通过定量蛋白组学研究OsGLO1对稻瘟病抗性的调控机制

[目的]水稻葡糖酸氧化酶1(OsGLO1)定位于水稻过氧化物酶体(peroxisome),参与过氧化氢的产生,但其是否参与水稻对稻瘟病抗性的调控还未见报道。本研究的目的是为了考察OsGLO1在水稻对稻瘟病抗性中的作用。[方法]以水稻‘日本晴’和稻瘟病病菌互作体系为研究对象,使用定量蛋白质组学技术,比较和分析了亲和型和非亲和型稻瘟病菌菌株侵染引起的水稻蛋白质表达变化。[结果]研究发现水稻OsGLO1蛋白的表达受到亲和型稻瘟病菌侵染的特异性抑制,但是在非亲和反应中的表达量变化则不明显。水稻原生质体过表达和沉默试验证明,OsGLO1的表达与水稻活性氧积累以及胼胝质沉积量呈正相关,且OsGLO1过表达诱发水杨酸(SA)和茉莉酸(JA)等多种防卫信号通路相关基因的表达。[结论]OsGLO1可以激活水稻的早期防卫反应,并通过启动多种激素信号通路维持水稻对稻瘟病一定水平的抗性。考虑到其也参与植物对非生物胁迫抗性的调控,提示OsGLO1可能是水稻抵抗生物胁迫以及非生物胁迫中的重要因子。     

水稻乙醇酸氧化酶基因的克隆和表达分析

根据水稻数据库中乙醇酸氧化酶(GLO)基因的编码序列,设计引物,克隆了水稻OsGLO3基因的序列,该片段长1 104bp,编码367个氨基酸,含有11个外显子。荧光定量PCR结果表明:OsGLO4在不同水稻生育期中表达量差异较大,且OsGLO1和OsGLO4在生长发育后期表达量较高,OsGLO2和OsGLO5在生长发育前期表达量较高。     

水稻乙醇酸氧化酶基因OsGLO1的原核表达及多克隆抗体制备

乙醇酸氧化酶是光呼吸代谢的关键酶.以水稻Oryza sativa叶片cDNA为模板,利用RT-PCR扩增水稻乙醇酸氧化酶基因(OsGLO1),并构建了该基因的原核表达载体pET23d-OsGLO1,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白.以纯化的OsGLO1融合蛋白为抗原免疫新西兰白兔,制备兔抗OsGLO1的多克隆抗体.Western-blot分析表明,制备的多克隆抗体能有效地检测水稻、菜心Brassica campestris、拟南芥Arabidopsis thaliana和菠菜Spinacia oleracea中乙醇酸氧化酶的表达,为进一步深入研究乙醇酸氧化酶在调控光呼吸及抗逆性等方面的作用奠定了基础.     

体外施用小分子RNA抑制稻瘟病菌分生孢子发育及致病性的作用效果

[目的]本文旨在分析体外施加靶向细胞色素b(Cytb)的小分子RNA对稻瘟病菌致病性的抑制作用。[方法]将稻瘟病菌与双链小分子RNA(ds-sRNA^MoCytb-21)共同孵育,通过测定孢子萌发效率和形态,确定小分子RNA对稻瘟病菌孢子萌发和附着胞形成有抑制作用。在分别施加溶剂(对照组)或dsRNA^MoCytb-500(处理组)的情况下,使用稻瘟病菌菌株Guy11侵染水稻‘日本晴’,明确体外施加小分子RNA是否可以降低稻瘟病菌的致病能力。[结果]与对照相比,与小分子RNA共同孵育的稻瘟病菌孢子萌发率和附着胞形成率显著降低。2′-O-甲基修饰(OMe)和硫代甲氧基修饰(SOMe)能够延长小分子RNA的抑制效果。用Guy11和dsCytb混合喷施的水稻病斑面积较对照组显著降低。[结论]体外施加特异性靶向稻瘟病菌Cytb的小分子RNA能够抑制稻瘟病菌的致病性,具有开发成为高效绿色环保RNAi药剂的潜力和价值。     

茉莉酸不同方式处理水稻对稻瘟病的防控效果 及对水稻防御体系的影响

[目的]分析外源茉莉酸喷雾处理水稻后对水稻防御系统的影响,为深入开展茉莉酸在稻瘟病菌与水稻互作中的作用机制研究提供参考依据.[方法]将茉莉酸以两种方式处理水稻:将100和400μmol/L茉莉酸分别预先喷雾于水稻叶片上,6 h后再接种稻瘟病菌株孢子;用100和400μmol/L茉莉酸制备稻瘟病菌株孢子悬浮液直接喷雾接种水稻,调查水稻稻瘟病发病症状及实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测水稻防御相关基因的表达.[结果]分别用100和400μmol/L茉莉酸预先喷雾水稻6 h后再接种稻瘟病菌株孢子的诱抗效果分别为16.02%和25.51%;而以100和400μmol/L茉莉酸制备稻瘟病菌株孢子悬浮液直接喷雾水稻的诱抗效果分别为21.82%和34.09%.qRT-PCR检测发现受侵染水稻防御相关基因均有不同程度的上调或下调表达.与接种前(0h)相比,在茉莉酸预先喷雾水稻后再接种稻瘟病菌孢子的水稻和茉莉酸制备孢子悬浮液直接接种的水稻中病程相关基因PR1a在稻瘟病菌侵染水稻早期表达量有所上调、侵染后期表达量下调,病程相关基因PR10a的表达量上调;水杨酸途径相关基因EDS1和PAL在稻瘟病菌侵染水稻的整个进程中一直处于较低的表达水平;茉莉酸途径相关基因AOS2的表达量显著上调(P<0.05).[结论]水稻病程相关基因及茉莉酸途径相关基因参与了水稻防御体系对外源茉莉酸的响应.     

稻瘟病菌侵染时水稻防御体系对外源茉莉酸的响应分析

[目的]探究特定时期稻瘟病菌与水稻互作对外源茉莉酸(JA)的响应,为揭示稻瘟病菌与水稻互作时水稻防御体系对外源JA响应的分子机制提供理论依据.[方法]以稻瘟病菌株95234I-1b和普通感病水稻品种丽江新团黑谷(LTH)为试验材料,通过外源JA以两种不同的方式(处理1,分别用100和400μmol/L JA处理水稻叶片,6 h后接种95234I-1b菌株;处理2,水稻叶片接种95234I-1b菌株72 h后,分别用100和400μmol/L JA处理水稻叶片)处理与稻瘟病菌互作过程中特定时期的水稻,调查水稻稻瘟病发病症状,并用即时聚合酶链锁反应(qRT-PCR)检测水稻防御相关基因的表达情况.[结果]外源JA的两种不同处理方式均能减轻受侵染水稻稻瘟病发病症状,并诱导水稻防御相关基因不同程度的上调表达.用100和400μmol/L JA喷雾水稻6 h后再接种稻瘟病菌株的诱抗效果分别为15.06%和25.63%;稻瘟病菌株孢子接种水稻72 h再喷雾100和400μmol/L JA的诱抗效果分别为36.60%和47.12%.与对照相比,JA抑制了水稻水杨酸(SA)途径相关基因的大幅上调表达.在一定JA浓度范围内,高浓度JA对SA途径相关基因表达抑制程度高于低浓度JA的抑制程度;高浓度JA诱导JA途径相关基因上调表达幅度高于低浓度JA的诱导程度;高浓度JA诱导PR1a上调表达幅度小于低浓度JA诱导的上调幅度,高浓度JA诱导PR10a上调表达幅度大于低浓度JA诱导的上调幅度.[结论]JA以两种不同的方式处理与稻瘟病菌互作过程中特定时期的水稻,均能诱导水稻病程相关基因和JA途径相关基因上调表达,抑制SA途径相关基因的大幅上调表达,表明水稻防御体系中的病程相关基因及JA途径的相关基因主要参与了水稻防御体系对外源JA的响应.     

水稻稻瘟病的发病原因和综合防治

<正>水稻稻瘟病是由半知菌亚门梨形孢属灰梨孢引起的世界性水稻病害,是水稻三大病害(稻瘟病、白叶枯病及纹枯病)之一。我国稻区每年都有不同程度发生,尤以南方发病较重,流行年份一般造成减产20%,严重的达40%~50%,甚至绝收[1]。20世纪90年代以来,中国稻瘟病的年发生面积均在380万hm2以上,稻谷损失达数亿公斤[2]。水稻稻瘟病也是松桃县水稻上的重要病害之一,为指导广大种植户搞好其防治,实现水稻增产、农民增收,现将水稻稻瘟病的综合防治措施介绍如下。     

Osa-miR1436靶标基因的生物信息学分析

【目的】水稻稻瘟病感染过程0 h、24 h与48 h的叶片miRNA进行高通量测序发现Osa-miR1436差异表达，探明miRNAs在水稻稻瘟病中的潜在功能，为Osa-miR1436在水稻稻瘟病发生中的功能与机理研究奠定分子基础。【方法】利用生物信息学软件psRNA Target对前期研究发现的1个miRNA表达水平发生显著变化的Osa-miR1436靶向基因进行预测，并对这些靶标基因进行GO、KEGG富集。【结果】通过预测发现70个靶标基因，这些基因主要富集在细胞大分子复合体组装(cellular macromolecular complex assembly)、DNA复制(DNA replication)、细胞应激反应(cellular response to stress)等与水稻抗逆相关生物学过程。靶标基因均显著富集了3种motif,且motif数量呈motif 1>motif 2>motif 3。【结论】Osa-miR1436可能通过靶向抗逆相关基因调控水稻稻瘟病的发生。     

基于RNA-Seq的稻瘟病菌Δznf1突变体的表达谱分析

【目的】稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的水稻稻瘟病是威胁全球水稻生产的重要病害之一,而该菌附着胞介导的侵染又是病害循环的重要环节。在前期的研究中发现一个编码C_2H_2锌指结构的转录因子基因ZNF1,参与稻瘟病菌附着胞形成、穿透和致病过程,论文旨在从转录水平上了解受Znf1调控的基因及其调控机理,为深入研究稻瘟病菌致病分子机理提供基础数据。【方法】利用RNA-Seq技术对稻瘟病菌野生型菌株Guy11和突变体Δznf1的营养菌丝体进行表达谱测序,采用FPKM法计算基因表达量,以FDR≤0.001且log2 ratio(Δznf1/Guy11)≥1为筛选标准,获得Δznf1中差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs);通过与Gene Ontology(GO)数据库和KEGG Pathway数据库比对,获得差异基因可能的生物学功能和参与的分子调控途径。为了更详细地研究受Znf1调控的基因,在同样的条件下,利用RNA-Seq技术对稻瘟病菌丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)编码基因PMK1的缺失突变体进行表达谱分析,通过对Δznf1和Δpmk1中的差异表达基因进行比较,筛选受Znf1和Pmk1共同调控的基因,并与前人的研究数据比较,分析获得在稻瘟病菌附着胞发育阶段上调表达但在Δznf1和Δpmk1中同时下调表达的基因。【结果】与野生型Guy11相比,Δznf1中共有709个差异表达基因,其中上调表达的有299个,下调表达的有410个;GO功能富集分析显示差异表达基因归类到生物学过程、细胞组分和分子功能上的基因数目分别有118、299和308个;KEGG Pathway富集分析显示,这些差异表达基因主要参与代谢途径、次生代谢物质生物合成、甘油磷脂代谢等。一些已知的稻瘟病菌致病相关基因,如LPP3、HOX7、PBS2、MPG1等,在Δznf1中表达水平下调。与Δpmk1中差异表达基因比较发现,Δznf1中约56%的差异表达基因同时也受Pmk1调控。其中,编码isotrichodermin C-15羟化酶的3个基因MGG_03825、MGG_02329和MGG_08498,在Δznf1和Δpmk1中的表达水平均显著下调。此外,在附着胞阶段上调表达的48个基因,在Δznf1和Δpmk1中同时下调表达,表明这些与附着胞形成可能相关的基因直接或间接受Znf1和Pmk1调控。采用q RT-PCR方法随机检测10个基因的表达情况,结果与RNA-Seq数据基本一致,说明本试验RNA-Seq数据的可靠性。【结论】RNA-Seq分析获得了受Znf1调控的基因信息和可能的生物学功能。一些与稻瘟病菌致病相关的基因受Znf1调控。此外,与Pmk1类似,一些在附着胞阶段上调表达的基因也同时受Znf1调控。结果可为进一步研究Znf1下游基因调控网络提供信息。     

外源水杨酸对稻瘟病菌效应蛋白BAS4过表达菌株耐受性的影响

[目的]研究不同水杨酸(SA)浓度对稻瘟病菌菌株形态发育及受侵染水稻防御相关基因表达的影响,探究SA对稻瘟病活体寄生相关效应蛋白BAS4在稻瘟病菌与水稻互作中的作用机制,为生产上有效防控稻瘟病提供理论依据.[方法]利用不同浓度SA(50、100、200、500、1000和2000 μmol/L)处理稻瘟病菌过表达菌株(35S:BAS4/Mo-1)和野生型菌株(A1343R-7),统计分析SA对过表达菌株和野生型菌株菌落生长速率、产孢量及孢子萌发和附着胞形成等形态发育的影响.调查200 μmol/L SA处理稻瘟病菌菌株侵染水稻的发病率,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析受侵染水稻防御相关基因表达情况.[结果]不同SA浓度对过表达菌株菌落生长速率、产孢量、孢子萌发率和附着胞形成的影响低于SA对野生型菌株的影响,经200 μmol/L SA处理过表达菌株侵染水稻的发病率降低,但降低幅度小于200 μmol/L SA处理野生型菌株侵染水稻的发病率.200 μmol/L SA处理能提高过表达菌株侵染水稻病程相关基因PR1a早期上调表达及PR10a基因72 h时的高效表达;使SA途径PAL基因表达量下调,JA途径AOS2基因早期上调表达,LOX2基因各时间点下调表达;使PR5基因早期上调表达,后期急剧下调;HSP90基因早期上调表达,但低于野生型菌株侵染水稻的表达量.[结论]BAS4过表达菌株对外源SA刺激有较强的耐受性.     

嗜碱假单胞菌Ej2对稻瘟病的防治效果及对水稻内源激素的影响

[目的]明确水稻内生菌嗜碱假单胞菌(Pseudomonas alcaliphila)菌株Ej2对镰孢菌(Fusarium spp.)等病原菌的抑菌效果,重点研究对稻瘟病的防治作用及对水稻内源激素的影响,为稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)杀菌剂的研发提供新的生防菌资源.[方法]嗜碱假单胞菌菌株Ej2分离于水...     

外源茉莉酸对稻瘟病菌引起褐点型坏死斑的水稻防御响应的影响

[目的]解析外源茉莉酸(JA)对JA合成/响应、水杨酸(SA)合成/受体及防御相关基因表达的影响,为进一步揭示JA调控稻瘟病菌侵染引起褐点型坏死斑的水稻抗病作用机制提供基础数据.[方法]以接种稻瘟病菌菌株Y92-66b后形成褐点型坏死斑的地方中抗水稻月亮谷为研究材料,分别利用400μmol/L JA和200μmol/L JA抑制剂(IBU)外源处理接种稻瘟病菌后引起褐点型坏死斑(72 h)的水稻月亮谷,调查水稻稻瘟病症状,同时利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测JA合成/响应、SA合成/受体、防御和蔗糖/果糖合成酶基因的表达.[结果]外源JA有效减轻了水稻稻瘟病症状.同时,JA诱导水稻JA合成基因OsLOX1、OsOPR1、OsOPR7、OsJIMT、OsHPL3和OsAOS2在72 h时上调表达,至96和120 h时,只有OsAOS2、OsOPR7和OsLOX1上调表达,其余3个基因下调表达;外源JA未诱导OsLOX3表达;JA诱导水稻JA响应基因OsCOI1a、OsMYC2、OsJAZ1、OsJAZ9和OsbHLH35在72 h时上调表达,至120 h时,只有OsCOI1a和OsJAZ1上调表达,其余3个基因均下调表达;外源JA未诱导OsCOI1b和JiOsPR10表达.JA诱导SA受体基因OsNPR4在72 h时显著上调表达(P<0.05,下同),96 h时下调表达,至120 h时又上调表达但不显著(P>0.05).JA诱导SA合成相关基因OsPAD4在72 h时显著上调表达,OsEDS1在120 h时显著上调表达.外源JA诱导防御基因OsPR5在72 h时开始上调表达,至96 h时显著上调表达;外源JA未诱导OsPR4a表达.外源JA诱导参与细胞壁合成的蔗糖合成酶基因OsRSUS1和果糖合成酶基因OsFRK-2表达,IBU则加重了水稻稻瘟病症状,同时抑制大部分JA合成/响应、蔗糖/果糖合成酶和防御基因的表达.[结论]外源JA主要通过诱导稻瘟菌引起的褐点型坏死斑的水稻JA合成/响应基因、参与细胞壁合成的蔗糖/果糖合成酶及防御基因表达参与水稻防御响应.     

褪黑素增强盐害条件下水稻幼苗对稻瘟病的抗病能力

[目的]探讨盐害条件下褪黑素对水稻抗稻瘟病的影响。[方法]采用3个浓度褪黑素处理生长在盐害(50 mmol/L)条件下的水稻幼苗,并接种稻瘟菌,调查不同时间发病率并检测叶片保护酶活力。[结果]盐胁迫能显著降低水稻抗稻瘟病能力。不同浓度(0、0.1和1.0 mmol/L)褪黑素水溶液处理能显著增强水稻对稻瘟病的抗病能力,并增强水稻叶片超氧化物歧化酶和多酚氧化酶的活力。[结论]褪黑素能激活这些保护酶从而增强盐害条件下水稻抗稻瘟病的能力。     

剑术(30%己唑·三环唑悬浮剂)防治水稻稻瘟病效果研究

正1试验目的通过田间试验,验证剑术(30%己唑·三环唑悬浮剂)对水稻稻瘟病的防治效果及对水稻产量的影响。2试验条件2.1试验作物:水稻作物品种:龙粳43(主茎11片叶)2.2靶标生物:稻瘟病3药剂试验药剂:剑术(30%己唑·三环唑悬浮剂),江苏剑牌农化股份有限公司。参考药剂:稻津(70%甲硫·三环唑粉剂)江苏龙灯化学有限公司4试验设计和安排4.1试验设计     

9个抗稻瘟病基因在291份水稻种质资源中的分布及组合特征

通过对Pib抗、感稻瘟病基因型序列进行比对,开发分子标记,并搜集已报道的8个抗稻瘟病基因(Pi9、Pi-k^h、Pit、Pi5、Pita、Pb1、Pi2、Pikm)的分子标记,分析这9个抗稻瘟病基因在291份水稻种质资源(以黄淮海区域种质为主)中的分布及组合特征,为今后抗稻瘟病分子标记辅助选择育种提供理论依据。结果表明,成功开发了Pib基因分子标记。单份水稻种质资源中携带的抗稻瘟病基因数目为0～6个,携带3个抗稻瘟病基因的种质资源最多,占比40.9%,其次为携带2个(20.3%)和4个(19.2%)抗稻瘟病基因的种质资源,携带6个抗稻瘟病基因的种质资源最少(0.4%)。9个抗稻瘟病基因在水稻种质资源中出现的频率存在较大差异,介于7.2%～59.1%,Pi9基因出现频率最高(59.1%),Pi-k^h次之(50.8%),随后依次为Pib(41.2%)、Pi5(36.4%)、Pita(29.2%)、Pb1(28.8%)、Pi2(19.5%)、Pikm(17.1%),Pit基因出现频率最低(7.2%)。291份水稻种质资源中共有抗稻瘟病基因组合93个,...     

不同药剂对防治水稻稻瘟病的药效试验研究

[目的]探究10种杀菌剂对水稻稻瘟病的田间防效。[方法]以稻瘟病感病品种新两优6号为试验对象,测定了10种药剂对水稻稻瘟病的田间防效。[结果]40％稻瘟灵可湿性粉剂100g/667m^2、32.5％阿米妙收SC l00mL/667m^2、30％爱苗EC l00mL/667m^2、75％拿敌稳WG100g/667m^2、75％稻艳WP100g/667m^2、2％春雷霉素液剂l00mL/667m^2,防治水稻稻瘟病有很好的效果,以上6种药剂可以作为防治水稻稻瘟病的药剂。[结论]该试验研究为我国水稻稻瘟病害的防治提供了借鉴。     

11%精甲·咯·嘧菌悬浮种衣剂对水稻恶苗病及稻瘟病的防治效果

采用包衣处理的方法研究了11%精甲·咯·嘧菌悬浮种衣剂(FS)不同剂量对种子出苗率的影响及对水稻恶苗病、稻瘟病的防治效果。结果表明,11%精甲·咯·嘧菌FS按照药种质量比(m/m)1∶300、1∶400、1∶500处理后种子出苗率分别为82.67%、86.67%和77.33%,均高于空白对照组75.67%;对水稻恶苗病有很好防效,分别达90.70%、89.53%和88.37%;对水稻稻瘟病的防治效果在10%以下,防效较差。因此,防治稻瘟病不建议用此药,防治水稻恶苗病的药种比(m/m)采用1∶400更为经济有效。     

黑龙江省主栽水稻品种抗稻瘟病基因Pi-2(t)的SSR检测分析

为合理搭配种植水稻品种,利用与抗稻瘟病基因Pi-2(t)紧密连锁的SSR标记AP22和SRM24检测49份黑龙江省主栽水稻品种(系)抗瘟基因Pi-2(t)的分布情况。结果表明:用2个与抗稻瘟病基因Pi-2(t)紧密连锁的SSR标记同时对抗瘟基因Pi-2(t)的检测是非常有效的方法,龙粳8号、绥粳4号、龙D99-709和垦676共4个水稻品种(系)检测出含有Pi-2(t)抗稻瘟病基因,并了解了该基因在黑龙江省水稻品种资源中的分布情况。     

水稻新品种对稻瘟病和稻曲病的综合抗性评价

为明确水稻品种对稻瘟病和稻曲病的抗病性,本研究通过室内人工接种和田间病圃自然诱发法开展101个水稻新品种对稻瘟病和稻曲病的抗性评价。结果表明,水稻品种在室内人工接种和田间自然诱发的抗瘟性表现相近;FJSM-25(元优2105)、FJSM-26(元优919)、FJSM-70(春优84)等43个水稻新品种对稻瘟病抗性较好;FJSM-21(绿两优2740)、FJSM-23(瑞优178)、FJSM-24(宜优嘉7)等33个水稻新品种对稻曲病抗性表现较好;FJSM-1(广优1029)、FJSM-11(天丰优110)、FJSM-25(元优2105)等9个水稻新品种对稻瘟病和稻曲病均具有较好的抗性。调查还发现,田间病圃水稻稻瘟病和稻曲病的混合发生的比率较高,达92%以上。     

短短小芽孢杆菌TW-2菌株对水稻穗颈瘟的防治效果

[目的]探讨生物农药的防治原理,寻找防治稻瘟病的新方法。[方法]采用系列稀释平板法测定生防菌TW-2对水稻稻瘟病菌的菌丝生长的抑菌活力,计算生防菌的抑菌活力回归方程式、EC50值和相对毒力。[结果]生防菌TW-2对田间水稻穗期的穗颈瘟的防效在80%以上。[结论]生防菌TW-2对水稻稻瘟病菌具有强烈的抑制作用,对水稻稻瘟病具有较高的防治效果。