绵羊Noggin基因的克隆、序列分析与原核表达

根据同源序列克隆原理设计一对引物,以绵羊脑组织总RNA的反转录产物为模板,利用RT-PCR扩增绵羊Noggin基因cDNA全长编码区,克隆到pMD-18T载体。测序验证后,提取pT-Noggin质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切回收目的条带,亚克隆到pET41a原核表达载体,转化BL21(DE3)菌,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。序列分析表明,绵羊Noggin基因的cDNA全长编码区(GenBank登录号为FJ751853)为699bp,编码232个氨基酸,与其他哺乳动物氨基酸序列同源性达到95%以上。SDS-PAGE结果显示,诱导表达的融合蛋白大小为60ku,与预期蛋白大小一致。Western blot检测结果显示,该蛋白为His融合蛋白。说明成功克隆了绵羊Noggin基因的编码区序列,构建了原核表达载体,在大肠杆菌中成功表达出目的融合蛋白。     

绵羊EDAR基因的克隆、序列分析及其在毛囊发育过程中的表达

旨在获得中国美利奴羊EDAR(ectodysplasin A receptor)基因的CDS区全序列并进行生物信息学分析,同时分析EDAR在绵羊毛囊发育过程中的表达特性,为深入研究该基因在绵羊毛囊生长发育过程中的作用及其表达调控提供基础资料。采用PCR扩增获得绵羊EDAR基因全长编码区,并克隆到PCRTM-BluntⅡ-TOPO@vector进行测序;利用生物信息学方法预测蛋白结构;应用qRT-PCR技术检测EDAR基因在绵羊毛囊发育过程中的表达特征。结果表明,绵羊EDAR基因的CDS序列长度为1 350bp(GenBank登录号:KX900497),编码449个氨基酸,该氨基酸序列与其他物种相比一致性较高;进化树分析表明,绵羊EDAR氨基酸序列与牛的进化关系较近,与斑马鱼较远;预测结果显示绵羊EDAR蛋白存在一个信号肽和一个跨膜结构域;qRT-PCR分析表明,EDAR基因在绵羊胎儿毛囊发育过程中均有表达,在毛囊发育第55天和第135天表达较高,第75天表达最低。获得绵羊EDAR基因完整的编码区序列和毛囊发育过程中的表达特性,生物信息学分析发现EDAR基因的编码区序列具有物种间的保守性,同时该基因在绵羊毛囊不同发育阶段的皮肤组织中表达,由此表明EDAR基因可能在绵羊毛囊的生长发育过程中发挥重要作用。     

绵羊NICD基因的克隆、真核表达及其序列分析

采用RT-PCR技术扩增绵羊Notch基因胞内段功能结构域(NICD),将其克隆到慢病毒表达载体中,在293T细胞中对其进行真核表达,通过Western blotting鉴定其蛋白表达,进一步对NICD核酸和氨基酸序列进行分析。结果表明,首次克隆获得绵羊NICD基因,该基因序列为2 388bp(GenBank登录号为KF318190.1),编码795个氨基酸,重组蛋白分子质量为110ku左右。序列分析结果显示,核酸序列与牛、马、人和小鼠的同源性分别为96%、90%、87%和83%,进化上与牛的关系最近;蛋白序列与牛、马、人和小鼠的同源性分别为96%、90%、87%和84%,预测二级结构可能存在26个α-螺旋、13个β-折叠、66个转角和64个无规则卷曲。     

绵羊TGFβ2基因及其剪切体的克隆与生物信息学分析

旨在克隆绵羊TGFβ2(Transforming growth factor-β2)基因CDS,解析其序列及编码蛋白的生物学特性,为绵羊生产利用提供理论基础。采用PCR技术克隆获得TGFβ2基因的CDS,并进行生物信息学分析。结果表明:绵羊TGFβ2基因的CDS长度为1 329bp,编码442个氨基酸;其可变剪切体TGFβ2-AS1和TGFβ2-AS2由于CDS部分缺失分别编码331和414个氨基酸。绵羊TGFβ2及其可变剪切体TGFβ2-AS1和TGFβ2-AS2编码蛋白的理论等电点分别为8.74、7.60和8.82,均存在1个信号肽和1个跨膜结构域,由α-螺旋、β-折叠、延伸及无规则卷曲构成;序列同源性分析发现,绵羊TGFβ2基因编码区的核苷酸和氨基酸序列与其他哺乳动物同源性较高,进化树分析表明,绵羊TGFβ2氨基酸序列与人类的进化关系较近,与斑马鱼较远;细胞定位分析表明TGFβ2及其可变剪切体TGFβ2-AS1和TGFβ2-AS2主要在细胞外基质中发挥作用,调控下游靶基因的表达。获得绵羊TGFβ2及其可变剪切体TGFβ2-AS1和TGFβ2-AS2完整的CDS,与TGFβ2转录本相比,TGFβ2-AS1和TGFβ2-AS2分别缺失111和28个氨基酸序列,其可能通过与TGFβ2转录本不同的分子调控机制发挥重要的生物学作用。     

布氏杆菌Ⅳ型分泌系统相关蛋白基因RicA的克隆、原核表达及免疫原性分析

为克隆并原核表达布氏杆菌(Brucella melitensis)疫苗菌株M5Ⅳ型分泌系统相关蛋白基因RicA,并进行表达蛋白的免疫原性分析,应用PCR技术从布氏杆菌疫苗菌株M5全基因组扩增RicA基因片段,亚克隆至pMD18-T载体后测序分析,构建重组表达载体pET-28a(+)-RicA,转化E.coli BL21(DE3)表达菌,以不同浓度IPTG诱导表达不同时间,SDS-PAGE鉴定表达效果,表达蛋白经AKTA蛋白纯化系统纯化,用Antheprot 5.0软件分析其理化特性及抗原性,Western Blot检测其免疫原性。结果表明:RicA基因全长528bp,编码175个氨基酸,与基因库中已知菌株的核苷酸同源性和氨基酸同源性均达到99%以上。SDS-PAGE表明,RicA融合蛋白在大约23ku处出现条带,纯化后条带单一。软件分析发现RicA蛋白融合抗原性较强,Western Blot检测证明其有较好的免疫原性。说明,成功克隆并表达布氏杆菌疫苗菌株M5 RicA基因,为进一步研究其与布氏杆菌Ⅳ型分泌系统及布氏杆菌致病机制之间的关系奠定了基础。     

苏淮猪BMP4基因克隆、组织表达及真核表达

为了解苏淮猪BMP4基因的序列特征和表达特征,本研究采用克隆测序技术获得苏淮猪BMP4基因编码区全序列,利用生物信息学方法分析BMP4基因的序列特征,采用RT-PCR技术检测BMP4基因在苏淮猪不同组织中的表达情况,构建苏淮猪BMP4基因真核表达载体并利用Western blot技术检测BMP4真核表达载体的表达情况。结果显示苏淮猪BMP4基因编码区序列长度为1 230 bp,编码409个氨基酸,与其他哺乳动物氨基酸序列的一致性均在97%以上;苏淮猪BMP4编码蛋白含有典型的TGF-β前肽和TGF-β样结构域;BMP4基因在苏淮猪卵巢组织中高表达;成功构建苏淮猪BMP4基因真核表达质粒pc DNA3.1-BMP4,转染后可显著上调猪卵巢颗粒细胞BMP4蛋白表达水平。     

麦洼牦牛H-FABP和MC4R基因的克隆及生物信息学分析

为探究H-FABP、MC4R基因在麦洼牦牛中的结构和功能,克隆测序麦洼牦牛H-FABP、MC4R基因的编码区全序列,并利用生物信息学软件分析其编码区序列、蛋白质结构、功能及进化关系。结果表明,麦洼牦牛的H-FABP基因全长440bp,其中编码区为401bp,编码133个氨基酸;MC4R基因全长1 434bp,其中编码区999bp,编码332个氨基酸。麦洼牦牛H-FABP和MC4R基因核苷酸序列与普通牛、绵羊、猪、人和小鼠的核苷酸比较,其一致性分别为83%~99%、85%~99%,其中与普通牛的最高(99%、99%),其次是绵羊(96%、95%),与小鼠的最低;说明在不同物种中,这2个基因属于直系同源的基因。H-FABP和MC4R蛋白均为疏水性结构蛋白。     

斯氏副柔线虫SHR基因表达载体的构建及生物信息学分析

为探讨斯氏副柔线虫免疫相关SHR基因作为疫苗候选抗原及早期诊断抗原的可能性,提取斯氏副柔线虫的总RNA,用RT-PCR技术扩增SHR基因,并将PCR产物克隆到pMD19-T载体,构建原核表达载体pET-30a(+)-SHR,利用在线软件对该基因编码蛋白序列进行生物信息学分析。结果表明:克隆获得SHR基因全长1 083 bp,编码360个氨基酸,理论等电点为6.09,无信号肽和跨膜区;磷酸化预测含有29个磷酸化位点;结构分析发现,α-螺旋构成二级结构的主要成分,亲水性氨基酸比例超过60%;抗原表位预测表明,SHR蛋白是一种抗原性较高的亲水性蛋白。推测SHR有望用作斯氏副柔线虫的免疫诊断抗原和疫苗候选抗原。     

略阳乌鸡METTL21C基因克隆及超表达载体构建

旨在克隆略阳乌鸡 METTL21C基因,构建其超表达载体。采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测 METTL21C基因在略阳乌鸡7种组织中的表达,通过PCR扩增技术克隆 METTL21C基因完整的CDS区序列,分析其核苷酸序列及不同物种序列进化关系,将 METTL21C基因片段连接至pCD513B载体,构建其超表达载体并转染至293T细胞。结果显示: METTL21C基因在略阳乌鸡心肌中表达量最高,骨骼肌次之;克隆获得略阳乌鸡 METTL21C基因完整编码区序列,共747 bp,编码249个氨基酸残基,与原鸡的相应序列具有很高的同源性;构建的 METTL21C超表达载体能转染293T细胞并成功表达,可直接用于后续 METTL21C基因功能探索的研究。     

苏州近郊4种不同森林群落稳定性研究

稳定性是一个评价群落结构与功能的指标,一直是生态学研究的热点。本文依据林分地上部分指标建立稳定体系,对苏州近郊4种人工林分,应用数学生态学方法,分析冬青针阔混交林、栎树针阔叶混交林、湿地松林和木荷林的林分稳定性。结果表明,多样性并不完全能够代表稳定性;4种林分群落稳定性主要因林分密度不同而异;稳定性依次为湿地松林＞冬青湿地松林＞栎树湿地松林＞木荷林。其中湿地松林可能会发展成为针阔混交林;木荷林中在生长过程中会因竞争产生限制,可能演替形成栎树—木荷混交林;2种针阔混交林在未来演替也可能向落叶阔叶、常绿阔叶混交林发展;该地区木荷林密度过大,稳定性较弱,应采取适当的抚育措施,提高其林分稳定性。     

四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1与ESBLs基因共转移分析

为了解四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1耐药基因流行情况,及其与超广谱β-内酰胺酶基因(ESBLs)共存和共转移的特征,采用微量肉汤稀释法检测菌株对不同抗菌药物的敏感性;采用PCR检测菌株mcr-1,以及mcr-1阳性菌株中ESBLs基因类型;采用质粒接合转移试验分析了mcr-1与ESBLs基因共转移的耐药机制。结果显示:190株大肠杆菌的mcr-1检出率为36.84%,75.71% mcr-1阳性菌株中同时检出ESBLs基因,主要以blaTEM-1、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14为优势基因;mcr-1阳性菌对氨曲南(ATM)、头孢噻肟(CTX)和多黏菌素E(COL)耐药率极显著高于mcr-1阴性菌(P<0.01);质粒转移率为47.14%,其中获得mcr-1和ESBLs基因共转移的接合子表现出与供体菌相同的耐药表型及耐药基因。综上,在四川省食品动物源大肠杆菌中,mcr-1与ESBLs基因共存现象广泛存在,且耐药基因易发生水平传播,对菌株多重耐药性的产生具有重要意义。     

青稞转录因子HvnANT1基因的克隆与表达分析

为探究HvnANT1基因在青稞粒色形成过程中的基因表达模式,以紫粒青稞‘涅如姆扎’和白粒青稞‘昆仑10号’为试材,利用简化基因组GBS(Genotyping-by-Sequencing)对青稞紫粒进行基因定位,克隆到HvnANT1基因,对其进行生物信息学分析。结果表明：1）在7H染色体的84.30—86.00cM获得1个MYB类转录因子,命名为HvnANT1。2）该基因长1 033bp,其完整开放阅读框为762bp,编码253个氨基酸。HvnANT1蛋白分子量为27.14kU,是亲水性的不稳定碱性蛋白且不存在跨膜结构,无信号肽。该蛋白的二级结构主要是由无规卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,具有2个SANT结构域（分别位于第13—第63个;第66—第114个氨基酸）。3）同源比对与系统进化分析表明：青稞HvnANT1蛋白与大麦、乌拉尔图小麦、高梁、玉米、二型花、小米、水稻、土瓶草、车轴草和杨梅10种植物的ANT1蛋白序列相似性分别为100.00%、88.85%、54.64%、60.95%、60.82%、58.46%、57.61%、37.76%、36.05%和36.33%;这些序列都具...     

干旱胁迫下不同品种小麦4种功能基因的表达模式及相关生理指标分析

采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)对干旱胁迫下脂质转移蛋白基因(TaLTP1)、膨胀素基因(TaEXPB23)、水通道蛋白基因(TaAQP7)和果聚糖6-果糖基转移酶基因(Ta6-SFT)在4种小麦叶片中的表达情况进行分析;通过测定相对水分质量分数和果聚糖质量分数来判断小麦生长发育状况。结果显示:干旱胁迫48h内,4种基因在不同抗旱性小麦叶片中的表达模式不同,干旱敏感型小麦中4种基因的相对表达量先上升后下降,恢复到正常水平;干旱耐受型小麦中4种基因的相对表达量先上升后下降,但仍维持较高表达水平;干旱耐受型小麦具有较高的相对水分质量分数和果聚糖累积量。以上结果表明,4种基因参与小麦干旱胁迫应答,4种基因的表达模式可以作为鉴定小麦抗旱的分子指标。本研究可为准确快速地鉴定小麦品种抗旱性提供重要分子依据。     

绣线菊内生真菌的分离及对植物病原菌的抑制作用

采用组织分离法,以PDA培养基为分离培养基,从绣线菊的根、茎和叶中分离获得39株内生真菌。平板对峙结果表明, 21株活性菌株对6种植物病原菌（辣椒疫霉病原菌、番茄枯萎病原菌、苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、葡萄灰霉病原菌、小麦赤霉病原菌）有不同程度的抑制作用,其中菌株XXT10对苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、番茄枯萎病原菌、小麦赤霉病原菌的抑制率分别达到73.2%、72.5%、39.5%和42.7%。通过测得的ITS rDNA 序列与GenBank数据库中已知序列比对后该菌为链格孢属菌。生物学特性试验表明,该菌株在28～32℃时,选择PDA培养基,分别以乳糖和蛋白胨作为碳、氮源,酸碱度中性的条件下,菌落的生长状况最佳。     

小立碗藓PpLBD20基因敲除载体的构建及功能研究

LBD(Lateral organ boundaries domain)是植物中特有的基因家族.前期研究发现灰霉菌处理小立碗藓导致配子体中的PpLBD20上调表达,但PpLBD20的功能尚不明确.因此提取小立碗藓DNA,PCR扩增PpLBD20基因的上下游片段,依次插入PTN182载体,利用同源重组原理构建敲除表达载体,酶切和测序验证插入序列的正确性.通过工作浓度为20％的PGE 6000介导小立碗藓原生质体转化,筛选鉴定得到敲除PpLBD20后的突变体植株,观察到敲除后小立碗藓不形成茎叶体结构且配子体成丝状.结果为深入探究PpLBD20在小立碗藓的形态建成调控病原菌侵染的抗性作用奠定基础.     

摘除眼柄与注射眼柄粗提物对凡纳滨对虾性腺发育相关基因表达的影响

利用荧光定量PCR技术,检测了眼柄粗提物对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)性腺发育相关基因(DMC1、VASA和VTG)表达的影响,探讨性腺抑制激素(GIH)在性腺发育过程中的调控机制,结果表明:DMC1和VASA只在凡纳滨对虾精巢和卵巢中表达;摘除眼柄后,精巢和卵巢中DMC1表达量均显著性降低(P0.05),而注射眼柄粗提物后精巢和卵巢中DMC1表达显著增高(P0.05);相反,摘除眼柄后,精巢和卵巢中VASA以及卵巢中VTG基因表达量显著增高,但注射眼柄粗提物后性腺中的VASA和卵巢中的VTG表达量显著降低。结果表明眼柄粗提物通过影响生殖相关基因的表达影响凡纳滨对虾的性腺发育。     

乌梅等20种中药对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性研究

【目的】观察乌梅Fructus mume等20种中药的体外抗胸膜肺炎放线杆菌Actinobacillus pleuropneumoniae活性.【方法】通过乙醇回流、水煎煮和超声波等方法对20种中药进行提取,采用二倍稀释法测定其对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性;并研究抗菌活性较强的几味中药的体外联合抑菌活性.【结果和结论】乌梅、黄连Rhizoma coptidis、诃子Terminalia chebula、秦皮Cortex fraxini、地榆Sanguisorbae officinalis、虎杖Polygonum cuspidatum 6种中药提取物对胸膜肺炎放线杆菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC)范围是6.25~50.00 mg/mL;大青叶Isatis indigotica、茵陈Artemisia capillaris、甘草Glycyrrhiza uralensis和白鲜皮Dictamnus dasycarpus 4种中药提取物的MIC范围是50.00~100.00 mg/mL;黄柏Phellodendron amurense、杜仲Eucommia ulmoides、金银花Lonicera japonica、柴胡Bupleurum chinense、蒲公英Taraxacum mongolicum、板蓝根Baphicacanthus cusia、栀子Gardenia jasminoides和黄芪Astragalus membranaceus等10种中药提取物的MIC100.00 mg/mL.联合抑菌试验结果表明,乌梅、黄连、诃子和虎杖两两联合抑菌指数(FICI)≤1,乌梅、虎杖分别与秦皮的FICI2.乌梅、黄连、诃子、虎杖、秦皮、地榆对胸膜肺炎放线杆菌均具有较好的体外抗菌活性;乌梅、黄连、诃子和虎杖两两联合为相加、协同作用;秦皮分别与乌梅、虎杖为拮抗作用.     

TmFAD2和BnFAD3双基因载体的构建及转化株脂肪酸分析

必需脂肪酸亚油酸(18∶2)和亚麻酸(18∶3)在植物中的合成过程一直备受研究者的关注。本研究利用旱金莲中合成亚油酸的油酸脱饱和酶基因TmFAD2及甘蓝型油菜中合成亚麻酸的亚油酸脱饱和酶基因BnFAD3,在pRD400骨架载体的基础上,构建同时表达TmFAD2和BnFAD3的串联双价载体pSFF。通过农杆菌介导的花序浸蘸法完成pSFF对拟南芥哥伦比亚野生型的转化,观察发现转基因植株的第1对真叶有不同程度的畸形。按照畸形程度将其划分为4个等级,气相色谱分析4个等级叶片及其后代种子中脂肪酸的组成及含量,发现随着畸形程度的增高,叶片和种子中亚麻酸C18∶3含量都呈现降低的趋势。     

结球甘蓝类钙调蛋白基因 CML48和 CML50在不同胁迫下的表达分析

为探究结球甘蓝类钙调蛋白（CMLs）响应不同胁迫时的功能,丰富CMLs参与钙信号网络调控,为CMLs参与植物逆境途径及其功能的研究提供依据。以结球甘蓝ZG为材料,克隆得到 CML48和 CML50基因,序列分析表明 CML48开放阅读框（ORF）为672 bp,含4个内含子,编码223 aa,分子量为25.28 ku; CML50开放阅读框ORF为1 095 bp,编码364 aa,分子量为38.06 ku,含3个内含子;均为亲水蛋白,均含有2个EF-hand结构域;系统发育树表明 CML48和 CML50均与甘蓝处于同一进化枝,与白菜、油菜的亲缘关系最近。qPCR表明 CML48和 CML50在干旱(PEG6000)、盐胁迫(NaCl)、低温(4 ℃)、高温(37 ℃)、H₂O₂、脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）等不同胁迫处理下,在叶和根中的表达均有上调,且 CML50的表达量均显著高于 CML48, CML48在茎尖中高度响应高温胁迫,而在根中不响应高温和H₂O₂胁迫。初步说明 CML48和 CML50在根和叶中均可响应上述8种非生物胁迫。