陆地棉MADS-box基因GhMADS13的功能分析

为了研究GhMADS13的功能,利用NCBI上提交的序列设计引物进行PCR扩增,扩增序列与提交序列的ORF (Open reading frame)的一致性为100％.qRT-PCR结果表明:棉花的各个组织中,GhMADS13在花中的表达量最高,是表达量低的根的几百倍;花器官中GhMADS13在萼片、花瓣、雄蕊、心皮和胚珠中都有表达,表达量虽有差异,但差异不大,其在胚珠中的表达量最高.将GhMADS13插入到pBI121载体上,构建了植物超表达载体.通过浸花法转化拟南芥,获得了2个转基因株系,分子检测和表型数据统计的结果表明GhMADS13的转录水平越高植株越矮小,角果的长度越短,种子的数目越少.根据GhMA DS13的qRT-PCR结果和异位表达分析,推测GhMADS13主要抑制胚珠的发育.     

棉花GhMADS12基因的克隆及其表达载体的构建

MADS-box基因是真核生物中一类重要的转录调控因子,调节着植物根、茎、叶到花的发育和果实的成熟。本研究以中棉所36花发育期均一化全长cDNA文库为基础,分离出一个棉花的MADS-box基因全长cDNA命名为GhMADS12。同时利用pBI121双元载体成功构建了GhMADS12基因的植物过表达载体,并利用基因枪轰击法瞬时表达载体,验证了载体的可靠性,为下一步转基因验证基因的功能奠定了基础。     

墨兰PI基因过表达载体构建及功能初步分析

MADS-box基因是植物中一类重要的转录调控因子,在生长发育调控和信号传导中发挥着重要作用,并参与花器官的发育和开花时间的调节。兰花中存在大量MADS基因,但这些基因的作用仅有少量研究报道。本研究将墨兰MADS基因家族中PI (PISTILLATA)基因cDNA开放框序列连接到pBWA(V)HU-ccdB-GUS载体上,构建了过表达载体,随后通过农杆菌介导法转化铁皮石斛原球茎,获得转基因株系;采用潮霉素抗性筛选,获得阳性植株,并利用试管开花技术,获得阳性植株开花苗,对开花表型进行观察。结果显示,PI基因在铁皮石斛中过表达能导致铁皮石斛花朵表型发生变化,阳性转化苗花朵在整体花型、中萼瓣和捧瓣的形状、花瓣边缘颜色、合蕊柱内侧的斑点区和紫色条带、舌瓣的颜色和形状等方面都发生了变异,尤其在舌瓣变化最明显,说明PI基因可能与兰花花瓣表型形成有关。本研究结果可为阐明墨兰舌瓣的形成机理及兰花基因工程育种性状改良提供参考依据。     

向日葵PMADS2 LIKE基因的克隆及表达分析

MADS-box家族基因是调控花发育进程的关键转录因子。在向日葵中大量的花发育相关基因有待于发掘和鉴定。本研究以向日葵(Helianthus annuus)为材料克隆到了一个MADS-box新成员PMADS2 LIKE。序列分析结果显示该基因具有MADS-box家族典型的MIKC保守结构域;系统发育树分析发现该基因与拟南芥PI基因亲缘关系最近;q RT-PCR组织表达模式分析该基因仅在花和果实中表达,且在6个花器官中仅在雄蕊和花瓣表达;q RT-PCR定量分析表示该基因从开花前25 d一直表达到开花期,并且在开花前5 d表达量最高。研究结果表明,PMADS2 LIKE基因在花发育和果实发育中具有一定的生物学功能。本研究的结果和推论为进一步探究向日葵PMADS2 LIKE基因在花发育和果实发育中的生物学功能提供前期数据基础,为理清MADS-box基因在向日葵花发育中的调控网络提供线索。     

牡丹PsAP1基因的表达分析及功能鉴定

为进一步探讨MADS-box基因家族在牡丹花器官发育和开花时间调控中的功能提供理论依据,为培育早花品种提供候选基因。以RACE扩增获得Ps AP1基因的全长c DNA为基础,分析了其表达模式和功能,以牡丹课题组利用454测序得到的类AP1基因的部分c DNA序列为基础,利用RACE扩增方法获得1 130 bp牡丹Ps AP1基因全长c DNA,同源性分析表明,牡丹Ps AP1与葡萄Vv AP1的相似性最高,为80.4%。实时定量PCR分析了其初花期的表达模式,结果表明,Ps AP1基因在萼片中转录量最高,其次为花瓣,在雄蕊中表达量最低。将Ps AP1基因在拟南芥中异源表达,分析鉴定了3个转基因株系的表型,结果发现异源表达Ps AP1拟南芥开花时间较野生型提前了约3 d。     

棉花GhMADS29启动子克隆及表达分析

以实验室克隆的GhMADS29(GeneBank登录号:JQ682642)基因的cDNA序列Blast搜索雷蒙德氏棉的基因组序列,根据Blast结果设计引物,克隆到起始密码子上游-19位开始的1316 bp的序列;利用PlantCARE启动子在线分析软件预测其含有核心启动子元件TATA-box和CAAT-box,并含有光、温、赤霉素、水杨酸、生长素等的响应元件.通过替换pBI121载体上的CaMV35S启动子构建了GhMADS29启动子与GUS基因的融合表达载体并转化拟南芥,组织化学染色分析发现其在14d幼苗的根和叶中都有表达,在萼片、花瓣、雌蕊、果瓣中也表达,而在雄蕊和种子中不表达.综上所述,我们推测GhMADS29可能与各种开花途径有关,与萼片、花瓣、雌蕊等花器官的发育有关,还可能与果实是否开裂有关.     

高品质转野生荠菜凝集素基因棉花的获得

利用花粉管通道转基因技术,将DE35S启动子驱动的野生荠菜凝集素(WSA)基因导入10个高品质棉花品种(系)。所使用的转基因表达载体还含有选择标记基因NPTⅡ(卡那霉素抗性基因)和Ω序列,以利于转基因植株的筛选以及WSA基因的高效表达。对转化当代3197棵棉苗的检测结果表明,4.88%植株具有卡那霉素抗性(Kan )。根据野生荠菜凝集素基因序列设计一对特异性引物,对156个Kan 植株进行PCR检测,筛选出45个转WSA基因棉花工程植株。45个株系纤维品质测定结果表明,获得了9个高品质转WSA基因棉花株系。并对植物基因工程研究中以NPTⅡ作为标记基因的局限性以及一些转WSA基因棉花株系纤维强度变劣的原因进行了探讨。     

棉花纤维特异转录因子GhMADS9的克隆及功能初步分析

从快速伸长的纤维细胞中克隆到了一个转录因子,通过序列比对发现其具有典型的MADS-box结构域,命名为GhMADS9。进化树分析表明GhMADS9属于典型的MIKC类MADS转录因子,与在拟南芥胚中高表达的转录因子AGL15亲缘关系最近。RT-PCR和原位杂交试验表明GhMADS9在纤维细胞中特异表达。酵母单杂交试验证明GhMADS9具有转录因子激活活性。继续研究GhMADS9对下游基因的调节机制有利于更加深入地了解棉纤维发育机制。     

梅花花器官发育相关基因PmSOC1-like的功能初探

SOC1/TM3(SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS 1/Tomato MADS-box gene 3)是MADS-box家族一员,它能够整合多条开花途径的开花信号,调节植物由营养生长向生殖生长的转变。在从梅花长蕊绿萼品种中克隆到3个SOC1同源基因PmSOC1-1、PmSOC1-2和PmSOC1-3的基础上,构建由CaMV35S启动子驱动的植物表达载体,并在拟南芥中过量表达,以研究其功能。通过对转基因植株表型观察发现,3个PmSOC1-like基因都具有使野生型拟南芥提前开花的作用。其中,PmSOC1-2作用最强,PmSOC1-1居中,PmSOC1-3作用最弱。对转基因拟南芥内源成花基因的qRT-PCR检测说明,PmSOC1-like基因主要是通过上调其下游花分生组织特性基因(AGL24、LFY、AP1和FUL)来促进植物开花;此外,PmSOC1-1和PmSOC1-2还导致了花瓣细丝状、花萼叶片化、花瓣和花萼宿存等花器官形态的改变,说明它们可能还具有影响花器官发育的功能。研究结果将有助于阐明梅花由营养生长向生殖生长转变的分子机制。     

黄瓜CsPI基因的克隆及不同器官中的表达

MADS-box家族基因在植物花器官发育中具有重要的作用。本研究采用同源克隆技术,从黄瓜(Cucumis sativus L.)顶芽中克隆获得B类MADS-box基因Cs PI的cDNA序列。序列分析表明,Cs PI基因cDNA序列的完整开放阅读框(ORF)为636 bp,编码211个氨基酸,分子质量为24 904,理论等电点为8.42。蛋白质序列相似性比对和分子系统发生分析表明,CsPI聚类于PI进化支,其C末端包含保守的PI基序。葫芦科PI同源蛋白序列比较保守,其中CsPI与甜瓜的同源性最高,为98.6%。实时荧光定量PCR显示,Cs PI基因主要在花器官中的花瓣和雄蕊中表达。本研究为探析黄瓜花器官发育提供了一定理论基础。     

春兰AGAMOUS同源基因的克隆及表达分析

为深入探索春兰(Cymbidium goeringii)中C类MADS-box基因参与春兰花器官发育调控的分子机理,用同源克隆的方法从春兰花芽中分离出两个C类MADS-box基因CygoAG1与CygoAG2。在分析其序列结构的基础上,分别检测2者在春兰不同花器官中的表达差异。序列结构分析表明:CygoAG1序列全长为831bp,包含702 bp完整开放阅读框(open reading frame, ORF),编码233个氨基酸和1个终止密码子;CygoAG2基因cDNA序列全长996 bp,包含705 bp完整开放阅读框,编码234个氨基酸和1个终止密码子,2个基因编码的转录因子均包含保守的MADS、K-box结构域和AG基序。分子系统发生与进化树重建结果显示:春兰CygoAG1与CygoAG2与拟南芥MADS-box基因家族中AG (AGAMOUS)基因的同源性最高。实时荧光定量分析结果表明,春兰CygoAG1基因只在花粉团、合蕊柱和子房中表达,在其它花器官及营养器官叶片中不表达,其在子房中的表达量最高。CygoAG2基因在春兰的花器官如萼片、花瓣、唇瓣、花粉团、合蕊柱和子房中均有表达,但在营养器官叶片中不表达,其在合蕊柱(雌雄蕊合生结构)中的表达量最高。CygoAG1和CygoAG2基因在春兰花器官中的表达模式呈现一定的差异。     

荷花NnMADS6基因的分离与表达分析

为了研究MADS-box E类基因在荷花花器官发育中的作用,以荷花‘重瓣一丈青’(Nelumbo nucifera'Chongban yizhangqing')品种为试验材料,利用RT-PCR克隆获得AGL6-like基因,命名为NnMADS6。序列分析表明,NnMADS6基因全长770 bp,含有1个726 bp的开放读码框(ORF),编码241个氨基酸,C-末端包含典型SEP/AGL6基序。氨基酸序列比对发现Nn MADS6与红花木兰MawAGL6、腊梅ChpAGL6、黑种草NidAGL6、无油樟AmtMADS6、烟草NitMADS6和拟南芥AtAGL6同源性分别为83.5%、81.5%、81.2%、80.9%、73.4%和59.1%,进一步系统进化树分析显示NnMADS6基因聚在AGL6分支中基本被子植物类群,说明该基因属于MADS-box家族AP1/AGL9亚家族AGL6分支同源基因。表达模式分析显示,无论在单瓣型材料或重瓣型材料,NnMADS6基因主要集中在花芽、萼片、花瓣和心皮中表达,花瓣中表达量最高。本研究结果表明,NnMADS6基因在花器官发育尤其在花瓣形成中有调控作用。     

The floral system of tomato

The tomato floral system is distinguished from that of Arabidopsis and Antirrhinum in several ways. The shoot is a sympodium, the first flower of the inflorescence is apical and no bracts are formed. We discuss the possible function of genes affecting growth habit and inflorescence development and analyze in detail the unique developmental alterations caused by inhibition or ectopic expression of tomato-specific MADS-box genes. Preliminary analysis of transgenic tomato plants expressing an alien homeotic gene and several different chimeric genes of the MADS-box family is also reported.     

萼脊兰MADS-box基因的克隆及表达载体构建

为了研究"ABC"模型的B类PI基因,探究决定花瓣和雄蕊形成的基因特征。采用CTAB法提取萼脊兰花瓣总RNA,并通过RT-PCR法克隆萼脊兰PI基因的编码序列,该序列长度为633 bp,编码210个氨基酸,与小兰屿蝴蝶兰的氨基酸相似性最高。对PI所表达蛋白质的结构、亲水性和二级结构进行了分析,结果显示,该基因包含MADS-box和K-box保守结构域,属于MADS-box基因家族;该蛋白分子属于亲水性蛋白,包含56.19%α螺旋、13.81%的延伸链以及30%的不规则折叠,实时荧光定量PCR结果显示,PI基因主要在花器官中表达,且表达量高,说明PI基因的表达具有组织特异性。构建植物表达载体的结果显示,目的基因和带启动子的片段已插入到表达载体p CAMBIA1301中,表明成功构建植物表达载体1301-PI,为最终获得新奇花型的萼脊兰奠定基础。     

棉花育性相关基因GhPG2的克隆与表达分析

多聚半乳糖醛酸酶家族是一个细胞壁水解酶,在许多高等植物的花粉中都具有高水平外切多聚半乳糖醛酸酶(PG)活性,可能在花粉成熟和花粉管伸长中发挥重要作用。利用已报道与恢复基因连锁的分子标记STS679筛选陆地棉Y18恢复系核基因组BAC文库,获得一个阳性克隆Z55E7,对该克隆测序获得6个基因,其中一个为编码多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)基因,暂被命名为GhPG2。在棉花细胞质雄性不育系、保持系和恢复系中对该基因进行序列和表达分析,以便进一步了解该基因与棉花细胞质雄性不育的关系。从BAC克隆中分离到GhPG2基因,对其进行序列分析,以半定量RT-PCR和实时定量PCR分析该GhPG2基因在棉花恢复系、保持系和不育系各个组织中的表达模式。分离到GhPG2基因的基因组序列为1 518 bp,其开放阅读框序列为1 239 bp,共编码412个氨基酸,包含PG基因家族的4个保守结构域。系统进化树分析表明,GhPG2基因与其他物种花粉表达的PG基因同属C分支。表达分析表明, 该基因在恢复系和保持系的花药、花瓣和VI级花蕾中高表达,而不育系的相应组织该基因表达量明显降低。GhPG2基因归类于花粉表达的一类PG基因。实验结果暗示GhPG2基因可能与棉花正常的花器官发育相关。