热诱导转录因子ZmNF-YC13调控热胁迫应答基因提高玉米耐热性

热胁迫是影响玉米生长发育和产量形成的重要因素,相关抗性基因的挖掘和机制解析是进行玉米耐热品种培育的重要分子基础,而目前这方面的研究仍是缺乏。本研究鉴定到一个与热胁迫应答相关的核因子ZmNF-YC13,该基因受高温和渗透胁迫快速诱导表达。用拟南芥热胁迫诱导表达基因AtHSP70的启动子驱动ZmNF-YC13基因,转化玉米筛选出了热诱导表达的转基因材料HSP21Pro:ZmNF-YC13-myc。高温处理后的表型鉴定表明,叶长、叶宽、地上部粗、地上部分和地下部分的鲜重和干重均显著高于野生型。表达分析表明, ZmNF-YC13能增强下游热胁迫应答基因响应热胁迫的程度。荧光素酶报告基因实验和ChIP-qPCR实验表明,ZmNF-YC13可调控热应激转录因子ZmHsfA2c的表达。这些结果初步证实了ZmNF-YC13可通过调控下游热胁迫应答基因来提高玉米的耐热能力,可为利用该位点的多态性进行分子标记辅助选择和种质资源鉴定提供理论依据。     

甘薯蔗糖转运蛋白基因IbSUT3的克隆及功能分析

蔗糖作为光合产物的主要运输形式,其跨膜运输主要由蔗糖转运蛋白介导。本研究采用RACE技术,仍甘薯[Ipomoeabatatas (L.)Lam.]中兊隆得到甘薯蔗糖转运蛋白基因IbSUT3(GenBank登录号为MN233361)。IbSUT3基因全长1607 bp,开放阅读框为1518 bp,编码505个氨基酸。IbSUT3蛋白预测分子量为53.82 kD,等电点(pI)为9.19,含有12个跨膜结构域。序列比对表明, IbSUT3属于Group Ⅰ亚族,与其他物种的SUTs蛋白高度相似,但与Group Ⅳ亚族的蔗糖转运蛋白在进化上具有明显差别。利用酵母表达体系SUSY7/ura3证明IbSUT3编码有功能的蔗糖转运蛋白。亚细胞定位収现, IbSUT3蛋白定位在烟草原生质体膜上。实时荧光定量PCR结果表明, IbSUT3基因在甘薯不同组织中均有表达,但在叶片中表达最高;非生物胁迫(低温、高盐、干旱)和外源脱落酸均可诱导IbSUT3基因在叶片中的表达,表明该基因响应多种非生物胁迫,参与植物对脱落酸的响应。     

棉花转录因子GhGT30基因的克隆及转录功能分析

Trihelix转录因子广泛参与植物生长发育、非生物胁迫应答等一系列生理活动。本研究根据表达序列标签(EST)电子拼接,结合cDNA末端快速扩增技术(RACE)和RT-PCR技术,从棉花中克隆了一个cDNA全长为2 210 bp的新基因,其开放读码框为2 025 bp,编码一个675氨基酸的蛋白,分子量约76.26 kD,等电点为6.21。SMART蛋白结构预测发现,该基因在N端和C端各有一个trihelix结构域,属于GT-2型trihelix转录因子,被命名为GhGT30 (GenBank登录号为JQ013098)。氨基酸序列比对显示,该蛋白和其他高等植物的GT蛋白有较高的同源性。进化树分析表明,GhGT30基因和大豆GmGT-2B基因处在同一进化树分支。拟南芥原生质体中瞬时表达分析表明,GhGT30主要定位于细胞核中。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在棉花的花、纤维(12 DPA)中的表达量明显高于根、茎、叶及胚珠(0 DPA),同时,该基因对干旱、高盐、低温及脱落酸(ABA)等处理都有一定程度的响应,推测该基因对棉花非生物胁迫的调控起重要作用。     

盾叶半夏凝集素基因的克隆及功能分析

为克隆盾叶半夏凝集素基因,并对其功能进行分析。采用RACE技术从盾叶半夏中克隆得到盾叶半夏凝集素基因的全长cDNA序列,命名为ppl。同时,构建了ppl基因的原核表达载体,并成功实现了33 k Da重组蛋白在E.coli BL21中的表达。纯化后的重组蛋白PPL用于凝血和体外抗癌试验。该基因的全长cDNA序列为1 504 bp,其中开放性阅读框(ORF)813 bp,编码270个氨基酸,具有3个甘露糖结合识别位点。PPL具有凝血活性,这种凝血活性可受甘露糖抑制。PPL对人鼻咽癌细胞(CNE)、人宫颈癌细胞(Hela)及人乳腺癌细胞(Bcap-37)的生长均具有抑制作用,其中对Hela细胞的抑制效果最好。为进一步研究PPL蛋白的功能奠定了理论基础。     

‘贵紫麦1号’GzA BI5-3A3基因的克隆及在烟草中的功能分析

ABI5在植物种子休眠与萌发、生长发育、花青素合成以及对逆境胁迫的响应等诸多生物学过程中起着重要作用。而大量研究表明ABI5参与种子休眠与萌发,少有研究表明ABI5参与花青素合成。为了探究ABI5转录因子参与调控小麦花青素合成,本研究从‘贵紫麦1号’中扩增得到Gz ABI5-3A3的c DNA全长。其启动子顺式元件分析结果表明Gz ABI5-3A3可能参与调控植物生长、光合作用、开花及种子萌发和花青素累积的生物学过程。蛋白质系统进化树分析表明,Gz ABI5-3A3与小麦中Ta ABI5D-SH-31、Ta ABI5D-SH-23和Ta ABI5D-SW-23同源。本研究进一步构建Gz ABI5-3A3基因的过表达载体PBI121-Gz ABI5-3A3,用于烟草遗传转化,共获得8个烟草转基因株系。本研究对Gz ABI5-3A3过表达转基因株系进行研究发现,转基因烟草株系L4、L7和L15苗期叶片中花青素含量显著低于野生型,其花青素合成途径的结构基因Nt PAL、Nt DFR、Nt ANS和Nt CHS的表达量显著下降。研究结果表明Gz ABI5-3A3能够通过调控花青素合成途径结构基因的表达来负向调控植物花青素的合成,为后续研究Gz ABI5-3A3调控花青素合成的分子机制提供研究基础。     

野生大豆S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆及功能分析

干旱、盐碱和低温等非生物逆境是危害作物诸多因素中最为严重的自然灾害, 它可以使作物减产, 甚至死亡。目前通过生物技术手段获得可利用的抗性基因是提高植物抗性的重要途径。东北野生大豆具有丰富的基因资源, 是基因克隆的理想材料。从低温(4℃)、干旱(30%PEG)及盐胁迫(200 mmol L^-1NaCl)处理的东北野生大豆幼苗叶片中提取总RNA, 经反转录合成cDNA第一链, 并以此链为模板, 从已构建的盐胁迫全长cDNA文库和东北野生大豆盐胁迫EST数据库中筛选出与渗透胁迫直接相关的EST序列, 根据该序列设计一对PCR引物扩增S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶基因的全长序列, 经Blast比较分析, 确定所获得的SAMS基因全长序列。构建以pBI121为基础的CaMV35S启动子调控的植物表达载体; 利用农杆菌介导法将其导入烟草, 获得了180株转基因烟草, 并进行了低温、干旱和盐胁迫处理, 通过测定在不同胁迫处理下的生理指标, 分析了基因的功能。野生大豆的SAMS基因在烟草中的超量表达提高了转基因烟草的抗低温、干旱和耐盐能力。     

小麦脱落酸受体基因TaPYR1介导植株抵御干旱逆境功能研究

脱落酸(ABA)受体PYR/PYL/RCAR通过与渗透胁迫诱导的ABA结合,参与植株体内ABA介导的信号转导过程,在调控植株干旱逆境抵御过程中具有重要的生物学功能。本文研究了鉴定的1个干旱响应的PYR家族成员TaPYR1的分子特征、应答干旱表达模式及其介导植株抵御干旱逆境的功能。结果表明,TaPYR1与植物种属中部分PYR基因在氨基酸序列水平上高度同源,编码蛋白含有PYR家族成员保守结构域,翻译蛋白经内质网分选后定位于细胞质膜。TaPYR1基因在小麦根、叶中均呈明显的干旱诱导表达模式,在干旱胁迫48 h表达量达到峰值。与野生型对照(WT)相比,超表达TaPYR1烟草转化株系,干旱处理下植株长势增强,干鲜重增加。干旱处理下,转化株系较对照的光合能力增强,细胞保护酶活性提高,渗透调节物质脯氨酸和可溶性糖含量增加。研究表明, TaPYR1通过在转录水平上应答干旱逆境,改善干旱胁迫下的植株相关生理过程,在增强植株抵御干旱逆境能力中发挥重要作用。     

甘蔗赤霉素氧化酶基因ScGA20ox1的克隆及功能分析

GA20-氧化酶(GA20-oxidase,GA20ox)是赤霉素(gibberellic acid,GA)合成过程中的关键限速酶,但甘蔗GA20ox1基因(ScGA20ox1)的功能及其表达模式尚未明确。本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆了甘蔗GA20-氧化酶基因(ScGA20ox1), ScGA20ox1基因全长1574 bp,含有一个1125 bp的完整开放阅读框(open reading frame, ORF),编码375个氨基酸。ScGA20ox1蛋白分子量为42.3 kD,理论等电点为5.95,不含信号肽,不含跨膜结构域,为可溶性蛋白。实时荧光定量PCR结果表明该基因在甘蔗幼苗中茎秆的表达量最高,叶片次之,根的表达量最低;干旱、低温和赤霉素处理均会改变该基因在不同组织的表达模式。利用农杆菌介导法转化拟南芥,获得过表达ScGA20ox1的转基因拟南芥植株,转基因拟南芥植株存在株高增高,节间长度增长的表型变异。本研究结果表明,ScGA20ox1参与甘蔗的生长发育并在响应非生物逆境中发挥重要调控作用,过表达转基因拟南芥形态发生变化,这为深入探究ScGA20ox1生物学功能,...     

马铃薯StIgt基因家族的鉴定及其对干旱胁迫的响应分析

干旱胁迫是影响马铃薯产量和品质的主要非生物胁迫因素之一。马铃薯在抵御干旱胁迫的过程中,根系的生长发育和构型分布发挥着重要作用。Igt基因家族是普遍存在于植物中的一类功能基因,在调控植物根系构型和提高植株抗逆性等方面效果显著。本研究以马铃薯双单倍体‘DM-v4.03’高质量基因组为参考,在全基因组范围内分析鉴定了StIgt基因家族的成员,并采用多种生物信息学软件对其进行了系统进化树构建、染色体定位、保守蛋白结构域、基因结构和顺式元件预测。同时,利用本课题组前期对马铃薯四倍体品系在不同干旱条件下的转录组测序结果,分析了StIgts响应干旱胁迫的表达谱。结果表明,在马铃薯中共鉴定获得10个StIgt家族成员,其中StIgt1由本课题组前期克隆获得。除StIgt1位置信息不明外,其余基因不均匀地分布在1、2、5、7、10和11号染色体上。StIgt家族蛋白长度为110~283个氨基酸,分子量介于13.136~32.542 kD之间,预测等电点为3.82~9.86。系统进化树分析发现,该基因家族可分为3个亚族,亚族间的基因结构、蛋白保守域和顺式作用元件差别明显。干旱胁迫下的表达谱分析表明,StIgt6、StIgt7、StIgt9和StIgt10响应早期干旱胁迫,在干旱2 h时即迅速上调表达。这些结果为阐明StIgt基因家族的进化关系和进一步研究其成员的功能特性提供了理论基础。     

马铃薯块茎花色素苷合成相关R2R3 MYB蛋白基因的克隆和功能 分析

植物花色素苷的合成代谢受转录因子的调控, 其中R2R3 MYB为最主要的转录调控因子。本研究以彩色四倍体马铃薯为试材, 克隆了R2R3 MYB基因家族里调控马铃薯块茎花色素苷合成R2R3 MYB-StAN1的3个同源基因, 并利用生物信息学分析、稳定烟草遗传转化、qPCR等方法对这3个同源基因的结构和功能进行分析和鉴定, 结果表明, 这3个同源基因均含有R2和R3保守结构域, 其主要差别在于C端由10个氨基酸序列组成的重复结构(R)数目不同, 根据R数目将其分别命名为StAN1-R0、StAN1-R1和StAN1-R3, 其蛋白分子量分别为28 047.91、29 458.35和31 527.60 Da, 等电点(pI)分别为6.14、6.90和8.39, 均为亲水蛋白。通过转化烟草发现, 转入StAN1-R0、StAN1-R1和StAN1-R3后, 烟草叶片叶色变化明显, 其中转StAN1-R1烟草叶色呈深红色, 其叶片花色素苷含量最高。进一步利用qPCR分析表明, 外源StAN1使烟草叶片花色素苷合成代谢途径的关键基因(NtCHS、NtCHI、NtF3H、NtF3’H、NtDFR、NtANS、NtUFGT)上调表达, 同时烟草内源NtbHLH基因的表达显著上升; StAN1-R1可以高效地调控烟草内源NtbHLH基因和结构基因NtDFR和NtANS的表达。结果表明, StAN1的3个同源蛋白均可以调控花色素苷的合成, 而只含一个重复序列R的StAN1调控花色素苷合成的能力最强。     

小麦类受体蛋白激酶基因TaPK3A的克隆与抗纹枯病功能初步分析

小麦纹枯病已成为我国小麦生产的重要限制因素。研究小麦防御反应分子基础,发掘有效的抗病基因是小麦抗纹枯病育种突破的前提。本研究从抗纹枯病小麦品系CI12633中克隆出一个类受体蛋白激酶(receptor-like protein kinase, RLK)基因TaPK3A,并对其表达特性及抗纹枯病功能进行了分析和验证。TaPK3A基因的开放阅读框长度为1983 bp,编码660个氨基酸组成的类受体蛋白激酶。TaPK3A在抗纹枯病小麦品系 CI12633中的表达受禾谷丝核菌的诱导而显著上调;TaPK3A在根、茎、叶、穗中都有表达,以叶中的表达量最高;TaPK3A的表达受植物激素水杨酸诱导最为显著。利用大麦条形花叶病毒(barley stripe mosaic virus, BSMV)诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术,降低抗纹枯病小麦CI12633中TaPK3A的转录水平,再接种禾谷丝核菌 WK207 进行纹枯病抗性鉴定。结果显示,与对照植株相比, TaPK3A转录量下降的CI12633植株对纹枯病的抗性显著降低,说明TaPK3A是小麦防御纹枯病反应所需的。     

Induction of mutations for heat tolerance in potato by using in vitro culture and radiation

Heat tolerant mutants were obtained in two commercial potato cultivars, `Kufri Jyoti' and `Kufri Chandramukhi' through in vitro mutagenesis of in vitro propagated plantlets. Gamma-irradiated (20 and 40 Gy) shoots were micropropagated for three cycles (M₁V₃). A large number of the micropropagated shoots produced microtubers at 28 ^°C. Microtubers induced at high temperature had distorted shape but showed normal germination in field. Under stress conditions of high temperature, the frequency of chlorophyll variants increased in the gamma irradiation-derived material, however, nearly 40% of the plants had normal leaf tissue, whereas control plants showed completely damaged leaves. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

马铃薯StMAPK4响应低温胁迫的功能解析

马铃薯易受低温危害,造成减产。MAPK基因广泛参与多种环境胁迫,研究发现其参与低温调控。为探究马铃薯StMAPK4在响应低温胁迫过程中的功能,本研究以马铃薯栽培品种‘Atlantic’为试验材料,分析其在低温(4℃)胁迫下不同时间点在马铃薯根茎叶中的表达特性,并对StMAPK4基因进行生物信息学分析及对其编码的蛋白进行亚细胞定位分析,构建StMAPK4的过表达和RNAi干扰表达载体,转化马铃薯获得转基因植株,并分析了在4℃处理下非转基因(NT)、过表达和RNAi干扰表达转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性、脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量的变化。结果显示,StMAPK4蛋白的等电点为4.97,属于酸性蛋白,该蛋白定位于细胞核和细胞膜;低温胁迫下,StMAPK4在根茎叶中的表达量显著升高;StMAPK4过表达植株的SOD、POD活性和脯氨酸含量较NT植株明显升高,而MDA含量明显降低;StMAPK4干扰表达植株的SOD、POD活性和脯氨酸含量较NT植株明显降低,而MDA含量明显升高;通过表型观察发现,非转基因和RNAi干扰表达植株的叶片萎蔫严重,而过表达植株的叶片受影响较小。因此,过表达StMAPK4基因可以增强马铃薯植株对低温胁迫的耐受性。     

马铃薯StMAPK4响应低温胁迫的功能解析

马铃薯易受低温危害,造成减产。MAPK基因广泛参与多种环境胁迫,研究发现其参与低温调控。为探究马铃薯StMAPK4在响应低温胁迫过程中的功能,本研究以马铃薯栽培品种‘Atlantic’为试验材料,分析其在低温(4℃)胁迫下不同时间点在马铃薯根茎叶中的表达特性,并对StMAPK4基因进行生物信息学分析及对其编码的蛋白进行亚细胞定位分析,构建StMAPK4的过表达和RNAi干扰表达载体,转化马铃薯获得转基因植株,并分析了在4℃处理下非转基因(NT)、过表达和RNAi干扰表达转基因植株的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性、脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量的变化。结果显示,StMAPK4蛋白的等电点为4.97,属于酸性蛋白,该蛋白定位于细胞核和细胞膜;低温胁迫下,StMAPK4在根茎叶中的表达量显著升高;StMAPK4过表达植株的SOD、POD活性和脯氨酸含量较NT植株明显升高,而MDA含量明显降低;StMAPK4干扰表达植株的SOD、POD活性和脯氨酸含量较NT植株明显降低,而MDA含量明显升高;通过表型观察发现,非转基因和RNAi干扰表达植株的叶片萎蔫严重,而过表达植株的叶片受影响较小。因此,过表达StMAPK4基因可以增强马铃薯植株对低温胁迫的耐受性。