茶树己糖激酶基因CsHXK1的克隆与表达分析

己糖激酶(HXK)是植物呼吸和代谢过程中的关键酶之一,不仅催化己糖磷酸化,而且参与植物糖感应和糖信号转导过程,在植物生长发育和逆境响应中发挥重要作用。试验以茶树‘龙井长叶’为材料,克隆获得了茶树己糖激酶基因 CsHXK1的cDNA序列,其包含一个1 488 bp的开放阅读框,编码495个氨基酸,预测蛋白分子质量为53.63 ku,理论等电点为5.96。蛋白序列分析结果显示,CsHXK1含有2个保守的磷酸化激酶域、1个底物结合域和1个ATP结合域,与拟南芥、苹果等HXK1亲缘关系较近。另外, CsHXK1基因启动子区域包含多种与逆境响应和糖信号转导相关的顺式作用元件,如ABA响应元件(ABRE)、脱水响应元件(MYBCORE)及糖信号转导相关元件(SREATMSD)等。qRT-PCR分析结果显示, CsHXK1基因表达受高温、干旱、低温及盐胁迫的诱导,其可能在茶树响应多种非生物胁迫过程中发挥重要作用。     

草莓FaSKP1-1基因的克隆与表达分析

为研究草莓中SCF复合体的功能,以栽培草莓品种‘74’为试材,采用同源克隆的方法分离出2个SKP1基因。这2个基因核苷酸序列全长均为519bp,核苷酸序列相似性为98.46%,氨基酸序列相似性为98.84%,并具有特殊的‘GVDED’尾巴结构,分别命名为FaSKP1-1a和FaSKP1-1b(基因登录号分别为KU975057和KU975058)。RT-PCR和dCAPS分析发现FaSKP1-1a和FaSKP1-1b在草莓根、茎、叶、花托、花粉、花柱、果实中均高表达,在花瓣中表达量低。上述结果表明FaSKP1-1可能在草莓SCF复合体的形成过程中发挥重要作用。     

青稞类钙调素蛋白基因CML19的克隆、序列分析及原核表达

根据鉴定得到青稞类钙调素蛋白基因CML19的序列设计引物,以青稞叶片的cDNA为模板,扩增得到目的片段,对目的基因序列进行鉴定和分析,进一步构建该基因的原核表达载体pET28a-CML19,转入大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG诱导外源蛋白质表达并检测。结果表明,扩增得到CML19的CDS序列全长为447bp,编码的蛋白质含有148个氨基酸,分子质量为16.46ku,理论等电点(pI)为4.40,总平均亲水性(GRAVY)为-0.176,不稳定系数为49.59,存在典型的EF手结构域;系统进化分析表明,青稞CML19与山羊草具有较近的亲缘关系;原核表达蛋白结果显示,重组蛋白主要以包涵体形式存在于沉淀中。初步阐明青稞CML19基因的序列特征,为进一步制备抗体、探讨CML19基因的功能奠定基础。     

棉花茉莉酸羧基甲基转移酶基因克隆及其表达分析

根据亚洲棉石系亚1号的转录组测序结果,克隆获得陆地棉品种"新陆早17号"的茉莉酸羧基甲基转移酶(jasmonic acid carboxyl methyltransferase,JMT)全长cDNA,命名为GhJMT(GenBank登录号KJ856913)。序列分析表明,GhJMT基因开放阅读框为1 116bp,编码371个氨基酸。保守结构域分析显示,该基因编码的蛋白具有甲基转移酶-7保守结构域。系统进化树分析显示,GhJMT与可可的茉莉酸甲基转移酶在同一分支,可能定位于细胞质,为不稳定亲水性蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,2.5%PEG6000胁迫处理12h时,根中GhJMT基因的表达迅速上调并达到最大值,约为对照的2.6倍,在茎中GhJMT的表达量在9h达到最高,约为对照的2.3倍,而在叶中GhJMT表达量在3h达到最高,约为对照组的2.1倍,说明GhJMT基因表达受干旱胁迫的诱导。研究结果有助于阐明GhJMT基因表达与植物抗旱的相关性。     

红花CtMYB-TF1基因的克隆与表达分析

为了探索R2R3-MYB转录因子与植物类黄酮的次生代谢调控之关系,及对植物花青素合成代谢的作用,以红花花瓣为试验材料,采用RT-PCR结合RACE技术,从红花(Carthamus tinctorius)中克隆获得1个全长1 260 bp的调控花青素代谢的 CtMYB-TF1基因。结果表明,该基因序列可编码249个氨基酸,其蛋白质分子质量为28.08 ku;红花CtMYB-TF1蛋白分子式为C_(1220)H_(1930)N_(358)O_(378)S_(13),是一种不稳定的碱性亲水蛋白;由系统进化树分析可知,红花 CtMYB-TF1与葡萄 VvMYBPA1亲缘关系较近;通过RT-qPCR技术对表达体系进行基因表达量的检测分析,红花 CtMYB-TF1基因在花期的各个时期相对表达量均高于红花CtANS基因,并且随着花期的延长红花 CtMYB-TF1基因和CtANS基因的相对表达量也有增高,其中在花期的第5天红花 CtMYB-TF1基因的相对表达量出现峰值,说明 CtMYB-TF1基因对CtANS基因具明显的上调作用,可为构建高产、稳定的红花基因工程改良细胞株提供参考。     

卵形鲳鲹 SST1基因的克隆与组织表达

为了解卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus） SST1基因的生物学信息、胚胎发育不同时期的表达水平及其在组织中的表达和分布情况,进而探讨 SST1基因可能的生理功能及作用机制。对卵形鲳鯵基因组（登录号: PRJNA574895）中的 SST1基因（ID:EVM0001630）进行生物信息学分析,并对其在卵形鲳鯵胚胎发育的不同时期及其在幼鱼不同组织中的表达情况进行定量分析。结果表明,卵形鲳鲹的 SST1基因全长1 155 bp,开放阅读框序列长1 104 bp,共编码368个氨基酸,蛋白分子质量为41.42 ku,理论等电点pI为8.47,属于带正电的疏水性蛋白。SST1蛋白无信号肽序列,亚细胞定位主要于细胞质膜,属于膜蛋白,包含17个磷酸化位点,存在7个跨膜结构域,三维结构主体为7段α-螺旋并列扭曲排列成的一柱状结构。序列比对和系统进化树分析显示,卵形鲳鲹与黄尾鰤和高体鰤共聚于一个分支,氨基酸序列同一性分别为98.39%和  98.37%。定量PCR分析结果表明, SST1在卵形鲳鲹胚胎发育的前13个时期微量表达,进入初孵仔期表达量迅速升高。 SST1在卵形鲳鲹幼鱼不同组织中的表达量差异极显著,其中在脑组织中表达量最高,其次是卵巢和精巢,在背鳍、皮肤、肌肉等其他11个组织中的表达量相对较低。说明 SST1在卵形鲳鲹神经内分泌、性腺发育及生殖细胞发生过程中可能发挥着重要作用。     

白芨MYB类转录因子PAP1基因的克隆与表达分析

花青素对植物的生长发育具有重要的作用。MYB家族转录因子参与花青素合成代谢的调控。利用同源基因克隆的方法,根据其他物种中基因的同源序列设计特异性引物,利用PCR技术从白芨基因组中克隆到MYB转录因子PAP1,cDNA全长844bp,经DNAStar软件分析,PAP1无内含子,包含一个完整的阅读框,编码184个氨基酸。不同组织的表达特征分析发现,BsPAP1在花中的表达较强,在块根状假鳞茎和嫩蒴果中的表达次之。蛋白质特征预测及蛋白序列结构分析发现PAP1具有MYB转录因子典型的DNA结合区域。序列同源比对表明该基因与芜菁、花椰菜等的PAP1基因有很高的相似性,推测BsPAP1是MYB家族的成员之一。     

中华鲟促甲状腺激素β亚基基因（TSHβ）cDNA序列的克隆及其表达分析

【目的】克隆中华鲟(Acipenser sinesis)促甲状腺激素β亚基(TSHβ)基因,分析其序列特征和进化特征,研究其在中华鲟中的组织表达特征和不同年龄垂体中的差异表达,为中华鲟生长发育调控研究提供基础数据。【方法】采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE),克隆中华鲟TSHβ,对其cDNA序列及其推导的氨基酸序列进行序列特征分析和系统发生分析;采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法,对TSHβ-mRNA在中华鲟肝、心、脾、性腺、肠、垂体、下丘脑、中脑、端脑、小脑和延脑等组织中的表达状况,以及在1,3,5龄中华鲟个体垂体中的表达差异进行研究。【结果】克隆获得TSHβ基因,该cDNA序列全长649bp,5′和3′端非编码区分别为142和75bp;开放阅读框432bp,编码143个氨基酸。TSHβ亚基成熟多肽含有12个半胱氨酸(Cys)和2个N连糖基化位点。氨基酸序列多重比对表明,中华鲟TSHβ与促滤泡激素β亚基和促黄体激素β亚基的一致性分别为36%和35%,但与糖蛋白激素α亚基的一致性约为10%。与其他脊椎动物的TSHβ氨基酸序列进行比对发现,中华鲟TSHβ亚基与西伯利亚鲟一致性最高(98%);与鱼类、两栖类、鸟类和哺乳类的序列一致性分别约为44%,55%,56%和60%;脊椎动物TSHβ的Cys和N连糖基化位点位置高度保守。TSHβ亚基仅在中华鲟垂体中有表达;3龄雄性个体垂体中TSHβ的表达量约为1龄的9倍,3龄和5龄雌性个体垂体中的表达量均约为1龄的5倍左右。【结论】成功获得了中华鲟TSHβ亚基基因,该基因具有与其他动物TSHβ相似的结构和表达特征;雄性个体表达量高于雌性个体,其在中华鲟个体的生长发育过程中表达量上升。     

蕙兰CfMADS1基因的克隆及其时空表达特性

【目的】对蕙兰CfMADS1基因cDNA全长进行克隆和时空表达特性研究,为研究成花相关基因的功能提供参考。【方法】以蕙兰萼片cDNA为模板,利用反转录RT-PCR和RACE的方法,克隆获得CfMADS1全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析。以蕙兰各时期的器官组织为材料,利用荧光定量PCR进行该基因的时空表达分析。【结果】成功克隆了CfMADS1基因(GenBank登录号为KC148540),其cDNA序列全长1 061bp,开放阅读框长744bp,编码247个氨基酸,分子式为C1 244H2 040N370O377S9。其编码的氨基酸序列与AP1/FUL亚家族中金钗石斛MADS1具有较高的同源性(85.43%),与AP1/FUL转录因子亚家族中的蛋白聚为一类。该基因编码蛋白没有明显的信号肽和跨膜域,极可能位于细胞核内,具有MADS保守域(1-61aa)和相对保守的K区(87-178aa),而且在C末端具有AP1/FUL特征基序(LPPWML),二级结构中α-螺旋所占比例较高(55.63%),三级结构与月季、水稻和水仙MADS1蛋白结构非常相似。该基因在盛花期叶中表达最强烈,花蕾期叶、葶、蕾及营养期叶、盛花期葶中表达较为强烈,子房和营养期根中表达较弱,其余器官组织中表达痕量。【结论】从蕙兰萼片中克隆得到了CfMADS1cDNA全长序列,CfMADS1与蕙兰的成花诱导、花发育以及果实形成有关。     

GhCDPK4基因的克隆和功能分析

为了研究棉花中GhCDPK4基因在响应非生物胁迫中所起的作用,通过PCR的方法克隆GhCDPK4基因,利用基因重组技术,构建植物过表达载体,采用农杆菌介导的叶盘法转化模式植物烟草,分析干旱和盐胁迫处理对转基因烟草表型和生理生化指标的影响。本研究成功克隆了属于棉花CDPK家族的基因GhCDPK4,构建了植物过表达载体pCAMBIA2300-GhCDPK4。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测发现转基因烟草中GhCDPK4基因高水平表达,并且转基因烟草相比于野生型烟草表现出较强的耐旱和耐盐性,其中SOD、POD和CAT活性显著升高,而相对电导率和MDA含量降低。研究结果表明GhCDPK4基因可正向参与应答干旱和盐胁迫。     

白菜型油菜PDAT1基因的克隆及生物信息学分析

磷脂二酰甘油酰基转移酶(phospholipid:diacylglycerol acyltransferase 1,PDAT1)催化三酰甘油合成的最后一步反应,在生物质能源领域有良好的应用前景。本试验克隆得到白菜型油菜PDAT1的2条编码区序列,分别命名为BrPDAT1-1和BrPDAT1-2。BrPDAT1-1CDS全长2 007bp,编码668个氨基酸残基组成的肽链;BrPDAT1-2CDS全长1 794bp,编码597个氨基酸残基组成的肽链。生物信息学分析表明:BrPDAT1-1与AtPDAT1的相似度为91.08%,BrPDAT1-2与AtPDAT1的相似度为82.86%,两序列都编码一个无信号肽的亲水性稳定蛋白,跨膜结构域分析表明AtPDAT1和BrPDAT1-1都有1个跨膜结构域,而BrPDAT1-2无跨膜结构域。BrPDAT1-1和BrPDAT1-2蛋白序列均含有卵磷脂-胆固醇-酰基转移酶超家族保守结构域。     

续随子ElDGAT1基因的克隆、序列分析及表达特性

二酰甘油酰基转移酶(Diacylglycerol acyltransferase,DGAT)是植物三酰甘油(TAG)合成最后一步反应的关键酶和限速酶,属于酰基转移酶超家族。为探究续随子(Euphorbia lathyris L.)中二酰甘油酰基转移酶1(DGAT1)对于调控种子油脂合成的作用机理,依据续随子转录组数据,采用RT-PCR技术分离和鉴定出一个 DGAT1基因(命名为 ElDGAT1),运用生物信息学方法对获得的序列进行分析,通过qPCR技术研究 ElDGAT1基因在续随子不同器官中的表达特性。结果表明:从续随子中克隆获得 ElDGAT1基因的cDNA序列,编码区长为1 530 bp,共编码509个氨基酸;预测ElDGAT1蛋白定位于内质网上,且为疏水性膜结合蛋白;其二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,编码的蛋白含有9个典型的跨膜螺旋区。基于DGAT1蛋白的系统发育分析表明:续随子与乌桕的亲缘关系最近,与橡胶树和木薯的同源性次之。qPCR检测结果发现, ElDGAT1基因在续随子根中表达量最低,种子中的表达量相对较高,在花后15 d、30 d、45 d的表达量呈递增趋势。研究结果为进一步分析续随子种子油脂合成积累的调控机理及 ElDGAT1 基因的生物学功能提供依据。     

甘蓝型油菜DGAT1重复基因的克隆与表达分析

二酰甘油酰基转移酶(Diacylglycerol acyltransferase,DGAT1)是十字花科植物种子三酰甘油积累主要的贡献者。甘蓝型油菜为异源四倍体,存在多个DGAT1重复基因,目前还缺乏对这些基因的系统研究。以甘蓝型油菜为试验材料,根据TAIR已公布的拟南芥DGAT1基因序列在BRAD数据库中进行BLAST比对,根据比对得到的2个白菜型油菜与2个甘蓝的DGAT1基因序列设计引物,利用RT-PCR技术获得4个甘蓝型油菜DGAT1包含完整编码区的基因片段,并对所得到片段进行测序和生物信息学分析。结果表明:克隆得到的基因片段分别为BnDGAT1-1,1 509bp;BnDGAT1-2,1 533bp;BnDGAT1-3,1 515bp;BnDGAT1-4,1 506bp。这4个基因具有极高的相似性,BnDGAT1-1与BnDGAT1-2、BnDGAT1-3与BnDGAT1-4的2个基因相似度均高达97%以上。跨膜结构分析表明BnDGAT1-1与BnDGAT1-2这1对基因所编码的蛋白质含有9个跨膜结构域,而BnDGAT1-3与BnDGAT1-4这对基因所编码的蛋白质含有8个跨膜结构域。包含有BnDGAT1-1与BnDGAT1-3的基因对BnDGAT1-a与包含有BnDGAT1-2与BnDGAT1-4的基因对BnDGAT1-b在含油量不同的各种甘蓝型油菜种子中表达无明显差异,表明这2对DGAT1基因的表达差异并不是影响所选材料种子含油量的决定因素。     

猕猴桃 AcNPR1基因克隆及抗病响应表达分析

为探究猕猴桃 AcNPR1基因在抗病响应中的作用及其在不同抗性猕猴桃品种间抗性差异机制,以高感病品种‘红阳’和抗病品种‘徐香’猕猴桃叶片为材料克隆 AcNPR1基因序列;利用ExPASy-ProtParam tool、MEGA 7.0 等对‘红阳’AcNPR1蛋白的理化性质进行分析、亚细胞定位进行预测、进化关系等进行分析;通过RT-qPCR分析 AcNPR1基因在不同品种猕猴桃植株中的组织表达模式以及病原菌和水杨酸（Salcylic acid,SA）对其诱导表达模式。结果表明, AcNPR1基因开放阅读框1 770 bp（Genbank 登录号MW881148）,编码589个氨基酸,理论等电点6.27,具有典型的BTB/POZ结构域、ANK重复序列、NPR-like等NPR1蛋白保守结构域,AcNPR1蛋白预测定位于细胞核中;蛋白质的二级结构以α螺旋和无规卷曲为主;系统进化显示其与茶树的亲缘关系最为密切,相似性为83.94%。组织特异性分析表明 AcNPR1基因在‘红阳’和‘徐香’品种叶片中的表达水平最高。在丁香假单胞杆菌猕猴桃致变种（Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa）处理下,抗病品种‘徐香’ AcNPR1基因的相对表达水平在处理0 h后迅速增加,为对照的3.6倍;而高感品种‘红阳’在48 h后显著增加,为对照的2.7倍。在SA+Psa处理下,‘徐香’ AcNPR1基因相对表达水平在24 h内达到最高水平,是对照的7.7倍;‘红阳’在72 h后达到最大值,仅为对照的1.6倍。 ‘徐香’ AcNPR1基因的抗病响应反应早于‘红阳’且更易受SA诱导表达。 AcNPR1基因在猕猴桃抗病胁迫方面具有一定作用,在不同抗性的猕猴桃品种抗病机制中存在差异。