牛β-乳球蛋白基因5′调控成分的分离、克隆及序列分析

利用PCR方法克隆了牛β-乳球蛋白基因5′调控成分(1 449 bp),其中包括5′侧翼序列(645 bp),第一外显子及第一内含子(804 bp).PCR产物回收纯化后,克隆在pMD 18-T Vector的T位点.序列分析表明,该序列与牛β-乳球蛋白A型基因、牛β-乳球蛋白B型基因、山羊和绵羊β-乳球蛋白基因的同源性分别为98.55%,99.79%,90.70%和90.09%.计算机分析表明,此调控成分含有诸多调节因子结合位点或反应元件,其中包括视黄酸反应元件(RARE)、佛波酯反应元件(TRE)、乳腺特异性因子(MSBF)和核因子1(NF1)结合位点等,提示此调控成分可调控外源基因在乳腺细胞中高效表达,可用于构建乳腺特异性表达载体.     

奶山羊β-乳球蛋白基因及其调控区的克隆和序列分析

从奶山羊组织提取基因组 DNA,根据已发表的山羊 β-乳球蛋白基因 (BLG)序列设计引物 ,用高保真长模板PCR法克隆得 6个奶山羊 BLG基因片段。这 6个基因片段的大小和部分限制性酶切图谱与已发表的山羊 BLG基因相同。部分序列测定结果显示 :6个奶山羊 BLG基因片段与山羊 BLG基因相应片段的同源性为 99%。进一步序列测定结果表明 :奶山羊 BLG基因 5′调控区与山羊、绵羊和牛的同源性分别为 99%、95%和 90 % ,3′调控区与这些动物的同源性分别为 99%、97%和 92 %。在乳腺特异表达调控元件集中的 -4 0 6bp区域内 ,奶山羊 BLG基因与山羊 BLG基因有 2个碱基的差异。所克隆的奶山羊 BLG基因调控区与山羊 BLG伪基因显著不同 ,其同源性仅为 83 % (上游调控区 )和88% (下游调控区 )。这些结果表明 :不同种动物的 BLG基因是高度保守的 ,高保真 PCR克隆的奶山羊 BLG基因调控区可用于乳腺特异表达载体的构建     

牦牛乳球蛋白基因5＇调控区的分离、克隆及序列分析

根据文献设计1对PCR引物，寡聚核苷酸序列上游引物为：5＇-gCg，AAT，TCA，TCC，CAC，gTg，CCT，gC-3’，下游引物：5＇-gAg，AAT，TCC，Tgg，ggA，ggg，ACE；TT-3’。经68℃退火及30轮循环的PCR程序后扩增出长度为1447bp的DNA片段，将该片段从琼脂糖凝胶中回收，克隆到pMD18-T Vector后进行序列测定。序列分析结果表明，牦牛乳球蛋白基因5’调控区与文献报道的奶牛该基因同源性为97．65％，突出的碱基差异为牦牛乳球蛋白基因5’调控区发生了1个位点连续3个碱基的缺失突变和另一位点1个碱基的插入突变。该研究也为开展以牦牛乳球蛋白基因5’调控区为启动子的乳腺生物反应器研究准备了条件。     

牦牛乳球蛋白基因5'调控区的分离、克隆及序列分析

根据文献设计1对PCR引物,寡聚核苷酸序列上游引物为5′-gCg,AAT,TCA,TCC,CAC,gTg,CCT,gC-3′,下游引物5′gAg,AAT,TCC,Tgg,ggA,ggg,ACC,TT-3′.经68℃退火及30轮循环的PCR程序后扩增出长度为1447 bp的DNA片段,将该片段从琼脂糖凝胶中回收,克隆到pMD18-T Vector后进行序列测定.序列分析结果表明,牦牛乳球蛋白基因5′调控区与文献报道的奶牛该基因同源性为97.65%,突出的碱基差异为牦牛乳球蛋白基因5′调控区发生了1个位点连续3个碱基的缺失突变和另一位点1个碱基的插入突变.该研究也为开展以牦牛乳球蛋白基因5′调控区为启动子的乳腺生物反应器研究准备了条件.     

牦牛乳球蛋白基因5′调控区的分离、克隆及序列分析

根据文献设计1对PCR引物,寡聚核苷酸序列上游引物为:5-′gCg,AAT,TCA,TCC,CAC,gTg,CCT,gC-3′,下游引物:5-′gAg,AAT,TCC,Tgg,ggA,ggg,ACC,TT-3′。经68℃退火及30轮循环的PCR程序后扩增出长度为1 447 bp的DNA片段,将该片段从琼脂糖凝胶中回收,克隆到pMD18-T Vector后进行序列测定。序列分析结果表明,牦牛乳球蛋白基因5′调控区与文献报道的奶牛该基因同源性为97.65%,突出的碱基差异为牦牛乳球蛋白基因5′调控区发生了1个位点连续3个碱基的缺失突变和另一位点1个碱基的插入突变。该研究也为开展以牦牛乳球蛋白基因5′调控区为启动子的乳腺生物反应器研究准备了条件。     

奶山羊β—乳球蛋白基因及其调控区的克隆和序列分析

从奶山羊组织提取基因组DNA，根据已发表的山羊β－乳球蛋白基因（BLC）序列设计引物，用高保真长模板PCR法克隆得6个奶山羊BLG基因片段，这6个基因片段的大小和部分限制性酶切图谱与已发表的山羊BLG基因相同，部分序列测定结果显示：6个奶山羊BLG基因片优山关BLC基因相应片段的同源性为99％，进一步序列测定结果表明：奶山羊BLG基因5调控区与山羊，绵羊和牛的同源性分别为99％，95％和90％，3调控区与这些动物的同源性分别为99％，97％和92％，在乳腺特异表达调控元件集中的－406bp区域内，奶山羊BLG基因与山羊BLG基因有2个碱基的差异，所克隆的奶山羊BLG基因调控区与山羊BLG伪基因显著不同，其同源性仅为83％（上游调控区）和88％（下游调控区），这些结果表明：不同种动物 的BLG基因是高度保守的，高保真PCR克隆的奶山羊BLG基因调控区可用于乳腺特异表达载体的构建。β     

西农萨能奶山羊β-乳球蛋白基因5′侧翼区多态性分析

根据β-乳球蛋白基因的DNA序列设计了1对引物，用PCR-RFLP技术对56只西农萨能奶山羊β-乳球蛋白基因5′侧翼区进行了多态性分析。结果发现，在西农萨能奶山羊群体中，PCR所扩增出的710bp片段经限制性内切酶Sam I消化后，表现出3种基因型。等位基因A，B的频率分别为0．91和0．09，3种基因型AA，AB，BB的频率分别为0．821，0．179和0．000。经检验，在所研究的群体中，该位点处于Hardy-Weinberg平衡状态。     

山羊BLG基因5′调控序列克隆及其调控GFP基因细胞的表达

通过PCR扩增出2.2kb的山羊β-乳球蛋白基因5′端的调控序列,包括第一外显子和第一内含子。测序结果表明,该序列与GenBank中登录序列相比,同源性为99.5%。用其替代表达载体pEGFP-c1上原来的启动子CMV,指导报告基因绿色荧光蛋白(GFP)在山羊乳腺细胞中的瞬时表达,结果发现该调控序列可以有效指导报告基因的表达,从而初步验证了所克隆的山羊乳球蛋白(BLG)基因表达调控序列的有效性。表明克隆的调控序列可用于乳腺生物反应器的研究。     

高效毛细管电泳测定α-乳白蛋白、β-乳球蛋白A及β-乳球蛋白B的纯度

采用毛细管电泳分析手段,用校正峰面积归一化法同时测定了本实验室购得的α-Lac、β-LgA及β-LgB三个蛋白参考物的纯度,其值分别为75.4%、84.5%和76.9%,相对标准偏差分别为1.6%、0.7%及1.4%。所得结果与应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺平板凝胶电泳法的测定结果进行了比较,并讨论了造成二者差异的原因。结果表明毛细管电泳法是分析此类蛋白的有效潜在手段。     

西农萨能奶山羊β-乳球蛋白基因5''''侧翼区多态性分析

根据β-乳球蛋白基因的DNA序列设计了1对引物,用PCR-RFLP技术对56只西农萨能奶山羊β-乳球蛋白基因5'侧翼区进行了多态性分析.结果发现,在西农萨能奶山羊群体中,PCR所扩增出的710 bp片段经限制性内切酶SamⅠ消化后,表现出3种基因型.等位基因A,B的频率分别为0.91和0.09,3种基因型AA,AB,BB的频率分别为0.821,0.179和0.000.经检验,在所研究的群体中,该位点处于Hardy-Weinberg平衡状态.     

里氏木霉β-葡萄糖苷酶基因的克隆及序列分析

文章以里氏木霉 (Trichoderma reesei)的基因组 DNA为模板 ,根据 Gen Bank上检索的 β-葡萄糖苷酶基因DNA序列 ,设计特异性引物 ,用高保真酶 probest polymerase进行 PCR扩增 ,获得了 2 .5 0 kb的 DNA片段。将其克隆在 p U C18的 Sma I位点上。测序结果表明 ,所获得的 DNA序列与 Gen Bank上检索的 β-葡萄糖苷酶基因的核苷酸序列同源性达 99.90 % ,氨基酸序列同源性达 10 0 %。     

乳清中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白分离制备技术研究

本研究采用不同分离方法对牛乳乳清中的主要成分α-乳白蛋白和β-乳球蛋白进行逐级分离纯化。利用两步硫酸铵沉淀法对乳清蛋白进行初级分离,使蛋白含量提高了4倍;响应面法优化PEG1500/硫酸铵双水相萃取系统的最佳工艺参数,萃取后蛋白组分被进一步纯化,蛋白浓度提高到815.6 mg/g,达到浓缩主要蛋白的目的;萃取蛋白经Sephadex G-75和DEAE离子交换层析后,所获得的α-乳白蛋白和β-乳球蛋白样品纯度达到85%。     

奶牛β-酪蛋白基因的克隆及序列分析

利用高保真PCR技术扩增了黑白花奶牛β-酪蛋白基因(CSN2)5'和3'调控成分,纯化PCR产物与pMD19-TVector亚克隆后酶切鉴定和测序.结果表明:克隆片断与奶牛β-酪蛋白基因相应区域同源性分别为97.0%和99.0%,并且包含有大部分的CSN2表达核心调控序列和多个转录、翻译因子的结合位点,获得了黑白花奶牛β-酪蛋白基因调控区的克隆.为构建乳腺特异表达载体,指导外源基因在转基因动物乳腺内高效表达奠定了基础.     

牛分枝杆菌MPB64基因的克隆及序列分析

以牛分枝杆菌ValleeⅢ染色体DNA为模板,以MPB64成熟蛋白基因特异性引物进行PCR扩增,获得了642 bp的DNA片段。通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T载体。经鉴定证实,成功地构建了pGEM-T-64克隆载体。序列分析结果表明:该基因序列与Mycobacterium bovis BCG Tokyo的MPB64成熟蛋白基因序列同源性为100%。     

梅花鹿LHβ基因的克隆及序列分析

【目的】克隆梅花鹿LHβ基因CDS区并进行序列分析。【方法】采用PCR克隆测序的方法获得梅花鹿LHβ基因CDS区全序列,采用ProtParam tool等分子生物学工具对梅花鹿LHβ蛋白的分子量、等电点、二级结构、蛋白功能等进行预测,并采用MEGA 6.0软件构建进化树以确定其系统发育地位。【结果】梅花鹿LHβ基因CDS区全长462bp(GenBank序列号为KT199365),包含了ATG起始密码子和TAA终止密码子,共编码141个氨基酸,蛋白质分子量为15.17kDa,等电点为8.00。梅花鹿LHβ蛋白均位于膜外,无跨膜结构,平均疏水性(GRAVY)为0.391,蛋白功能预测显示,该蛋白最有可能为激素,这与本研究的目的基因相符。进化树分析结果表明,梅花鹿LHβ基因与山羊、绵羊和牛等反刍动物较近,其中与绵羊最近。【结论】梅花鹿LHβ基因CDS区序列与绵羊LHβ基因最近。     

瞬变高压对β-乳球蛋白变性的影响

[目的]探讨瞬变高压条件下β-乳球蛋白的变性规律。[方法]以鲜牛乳为原料,通过瞬变高压处理后β-乳球蛋白的SDS-PAGE和巯基含量检测,考察压力水平、进料温度、处理时间对β-乳球蛋白的影响。[结果]瞬变高压处理可导致β-乳球蛋白发生凝聚和解聚;20~60 MPa范围内随着压力的提高,β-乳球蛋白的凝聚作用增强,但过高的压力(80 MPa)会导致其产生解聚作用;25~45℃进料温度的影响结果与压力类似;而2~8 min处理时间的影响不显著。[结论]该研究为消除β-乳球蛋白的致敏原及高压技术在牛乳中的应用提供了理论依据。     

牛FABGL基因cDNA的克隆与序列分析

以中国西门塔尔牛肝脏组织为材料,运用同源序列克隆技术结合RT-PCR和RACE技术,对牛FABGL基因的cDNA进行了克隆与序列分析,并对推导的FABGL蛋白结构与性质进行了初步分析。结果表明,牛FABGL基因的cDNA序列长994 bp,包括780 bp的开放阅读框、16 bp的5′非翻译区和198 bp的完整3′非翻译区,由260个氨基酸组成。该基因cDNA核苷酸编码区序列与猕猴、人、猪和小鼠FABGL基因的相似性分别为89%,89%,87%和86%。推导的氨基酸序列与猕猴、人、猪和小鼠的相似性分别为89%,87%,89%和86%。以FABGL基因cDNA编码区序列构建的分子进化树研究结果表明,牛的FABGL基因在人、猕猴、猪、鼠等物种中,与猪的亲缘关系最近。牛的FABGL蛋白的三级结构包含2个跨膜结构—Cu toff模体,分别位于11~16位氨基酸和128~131位氨基酸处。     

牛分枝杆菌RecA基因的克隆与序列分析

以牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)Valleelll株染色体DNA为模板,以RecA基因特异性引物进行PCR扩增,获得约240 bp的DNA片段.将PCR产物克隆至pMDTM18-T Vector中,通过α-互补法筛选、质粒PCR鉴定及序列分析鉴定,成功构建出了重组质粒pMDTM18-T-RecA,为进一步研究RecA基因及其在牛结核病诊断中的应用奠定了基础.