甘蔗花叶病毒福建分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析

 A fujian isolate of Sugarcane mosaic virus named SCMV-FJ was isolated from infected sugarcane. Cloning and sequence analysis of the coat protein gene of this isolate was carried out. A pair of primers was designed and synthesized based on the nucleotide sequences of coat protein genes of sugarcane mosaic viruses reported. The coat protein gene of SCMV-FJ was amplified from the extracted total RNA of the infected sugarcane by using RT-PCR, and cloned into the pMD18-T vector. The sequencing result indicated that the cloned segment included a 1137 bp open reading frame(ORF) and a 228 bp 3' untranslated region, in which the ORF comprised the whole coat protein and part of the nuclear inclusion b. The nucleotide and the deduced amino acid sequences of the coat protein gene were compared with those of the other isolates or strains of SCMV subgroup reported in GenBank. The result showed that it shares 56.8%-97.1% and 55.3%-99.4% homology in nucleotide and the putative amino acid sequences, respectively, with the highest amino acid homology of 99.4% with SCMV-D. Thus it was identified as a SCMV-D. This experiment provided a rapid, sensitive and relatively inexpensive method for RT-PCR detection of SCMV. At the same time, the cloning of SCMV-FJ coat protein gene provided the foundation for plant gene engineering against SCMV.     

黄瓜绿斑驳花叶病毒安徽分离物全基因组序列测定及分析

通过胶体金免疫层析试纸条和RT-PCR等手段对采自安徽和县的西瓜病株进行检测,确定其病原为黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)。为明确CGMMV安徽分离物CGMMV-Anhui的分类地位,进一步克隆了该病毒的全基因组序列,分析了其基因组结构特征。结果表明,CGMMV-Anhui基因组全长为6 423bp(GenBank登录号KT236095),与已报道的CGMMV的编码区的基因结构一致,仅5′和3′端非编码区核苷酸数目略有差异。将CGMMV-Anhui与已报道的分离物的全基因组序列和外壳蛋白基因序列进行系统发育分析,显示CGMMV不同分离物可分为亚洲和欧洲两个组,安徽分离物CGMMV-Anhui与亚洲分离物亲缘关系较近,可能具有共同的侵染源。     

西瓜花叶病毒2号新疆昌吉分离物外壳蛋白基因核苷酸序列分析

 利用RT-PCR从新疆昌吉地区表现花叶、疱斑、扭曲等症状的南瓜病株上检测到西瓜花叶病毒2号新疆昌吉分离物(简称WMV-2-XJ-CJ),并测定了该分离物外壳蛋白(CP)基因序列。序列分析表明,新疆昌吉分离物CP基因全长850个核苷酸,编码197个氨基酸。与国内外报道的12个WMV-2CP基因相比,其核苷酸序列同源性为92.6%~98.3%,由此推导的氨基酸序列同源性为94.7%~99.3%。新疆昌吉分离物在CP N'端可变区明显不同于国内外报道的核苷酸序列。WMV-2新疆昌吉分离物与日本和郑州分离物较其它国家和地区的分离物多出6个核苷酸,但其核苷酸及其推导的氨基酸序列差异较大。新疆昌吉分离物外壳蛋白有2个氨基酸残基明显不同于其它分离物,其中蚜传株系的特征结构域DAG突变为DAE。     

甜菜花叶病毒新疆分离物基因组3′末端序列分析

甜菜花叶病毒(Beet mosaic virus,BtMV)属马铃薯Y病毒科、马铃薯Y病毒属,可经多种蚜虫以非持久性方式传播,病毒粒子为弯曲线状,核酸为单分子正义ssRNA。目前只有美国华盛顿分离物的全序列以及斯洛伐克和英国少数几个分离物3′端的部分序列被报道[1,2]。美国分离物全长9591nt,3′端具有PolyA尾,编码一个由3086个氨基酸组成的多聚蛋白,与其它Potyvirus病毒一样可切割成10个蛋白,从N到C端依次为P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-Vpg、NIa-Pro、NIb和CP[2]。对于我国发生的BtMV,1981年Liu等[3]报道了发生于北京地区菠菜上的Bt…     

甘蔗花叶病毒2个山东分离物的全基因组序列分析

甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)是引起我国玉米矮花叶病的主要病毒。本文从山东泰安采集到2个表现矮花叶症状玉米样品的分离物(命名为DWK1和DWK2),通过RT-PCR扩增全基因组片段并测定了其序列(GenBank登录号分别为KU171814和KU171815)。序列分析结果表明,DWK1和DWK2基因组全长分别为9 575和9 576个核苷酸(nucleotides,nt),开放阅读框均为9 192 nt,编码3 063个氨基酸的多聚蛋白。DWK1和DWK2的全基因组核苷酸一致率为81.7%,DWK1与山西分离物SX(AY569692)的核苷酸一致率最高,为90.9%;DWK2与河北分离物BD8(JN021933)核苷酸一致率最高,达99.4%。二者在系统进化树中分别被聚类到Ⅰ组和Ⅳ组。重组分析发现,DWK1是HN(AF494510)、Guangdong(AJ310105)和BD8 3个分离物的重组体。选择压力分析表明,SCMV 11个蛋白的dN/dS值都小于1,均处于负选择,但在P1、P3和CP中存在正选择位点。本研究结果可为甘蔗花叶病毒株系的监测及防控提供理论指导。     

黄瓜绿斑驳病毒河北分离物基因组克隆及序列分析

为揭示河北省黄瓜绿斑驳病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)分类地位及系统进化情况,通过分子克隆测定了来自河北省西瓜产区分离获得的分离物CGMMV-chb的近全基因组序列,分析其基因组结构特征;并依据近全基因组核苷酸序列及外壳蛋白氨基酸序列进行了系统进化关系分析。结果表明,CGMMV-chb近全基因组大小为6 383 nts,Gen Bank登录号为KJ658958,含4个开放阅读框,编码4种蛋白;与Gen Bank库中的其它12个CGMMV分离物的核苷酸相似性为92%~100%,氨基酸相似性为98%~100%。CGMMV-chb与韩国分离物CGMMV-KW基因序列相似性最高,为98%~100%,与以色列分离物CGMMV isolate Ec基因序列相似性最低,为92%~99%;系统进化关系中CGMMV-chb与其它中国分离物、日韩分离物亲缘关系较近,处于同一亚组的不同分支中,与以色列分离物亲缘关系相对较远。     

蚕豆萎蔫病毒2号安徽分离物全基因组序列测定与分析

利用酶联免疫和RT-PCR技术对采自安徽地区的蚕豆病株进行检测,确定其病原为蚕豆萎蔫病毒2号Broad bean wilt virus 2(BBWV2)。为明确BBWV2安徽分离物(BBWV2-AH)的分类地位,克隆了该分离物的全基因组序列,分析了其基因组特征。结果表明,BBWV2-AH RNA1全长为5 944 bp(GenBank登录号:KY606992),含有1个ORF;BBWV2-AH RNA2全长3 587bp(GenBank登录号:KY606993),含有1个ORF。全序列核苷酸和氨基酸相似性分析显示,BBWV2-AH RNA1与BBWV2其他分离物的核苷酸、氨基酸相似性分别为78.4%~96%和87.1%~99%;BBWV2-AH RNA2与BBWV2其他分离物的核苷酸、氨基酸相似性分别为76.8%~95.5%和88.2%~98.3%。全基因组核苷酸序列系统发育分析显示,BBWV2-AH RNA1与中国的BBWV2-Hunan RNA1的亲缘关系最近,而BBWV2-AH RNA2与韩国的多个分离物聚集在一起,再与中国的分离物BBWV2-B935形成一个分支。     

槟榔坏死环斑病毒轻症型分离物(ANRSV-DAT)的基因组序列克隆及分析

 槟榔坏死环斑病(ANRSD)是近年来海南槟榔主产区发生广泛、危害严重的病毒病害,发病植株叶片表现严重坏死环斑、树势衰退,疑似与马铃薯Y病毒科(Potyviridae)槟榔坏死环斑病毒(areca palm necrotic ringspot virus, ANRSV)相关。本研究从海南定安槟榔种植区发现感病植株叶部表现轻微稀疏褪绿斑的病毒分离物(ANRSV-DAT),对其基因组序列全长克隆和分析。ANRSV-DAT与先前报道的强毒分离物ANRSV-XC1基因组核苷酸(nt)序列及其编码融合蛋白氨基酸(aa)序列的同源性分别为90.68%和97.91%;两者的融合蛋白之间存在63个aa变异,不同程度地分布在10个顺反子中(HCPro1、HCPro2、P3、7K、CI、9K、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb和CP)。与ANRSV-XC1显著不同的是,ANRSV-DAT的5'非翻译区的5'末端缺失95-nt序列。该缺失序列是否导致ANRSV-DAT毒性弱化有待进一步研究。本研究报道的ANRSV轻症型分离株,以期为筛选弱毒株及后续交叉保护防治ANRSV提供重要宝贵材料。     

菜豆普通花叶病毒RT-PCR承检测及3'末端序列分析

根据哈尔滨地区豇豆感病植株的症状,初步鉴定感染豇豆的病毒为菜豆普通花叶病毒(Bean common mosaic virus,BCMV).利用马铃薯Y病毒属通用引物扩增出病毒基因组3'末端序列,经BLAST检索表明该病毒为BCMV,将该序列与GenBank上的21个BCMV分离物的3'末端序列进行比较,显示其核苷酸序列与其他分离物的序列同源性为91.7%～97.3%.系统进化分析显示不同分离物可聚为5个类群,并显示出一定的寄主相关性.哈尔滨分离物BCMV-X与2个浙江分离物、1个澳大利亚分离物聚为一支,且该4株分离物的寄主均为豇豆.RNA二级结构分析显示BCMV基因组3'末端非编码区形成4个茎环结构,不同分离物的序列变化并未引起茎环结构的明显变化.     

油菜花叶病毒山西地黄分离物的全基因组序列测定与分析

 采用双链RNA(double-stranded RNA, dsRNA)技术和非序列依赖PCR扩增(sequence-independent amplification,SIA)方法对感病地黄进行分子鉴定,并测定油菜花叶病毒(Youcai mosaic virus,YoMV)山西地黄分离物(YoMV-SX)的基因组全序列。序列测定及分析发现侵染地黄的病毒为油菜花叶病毒(Youcai mosaic virus,YoMV)。获得YoMV-SX(GenBank登录号JX422022)全长为6 304 nt,5′UTR长度为68 nt,3′UTR长度为236 nt,含有4个开放阅读框(open reading frame,ORF)。全序列核苷酸一致性分析显示YoMV-SX与Tobamovirus亚组Ⅲ中分离物的一致性为90.7%～96.0%,与同属亚组Ⅰ和Ⅱ的一致性仅为50.2%～63.3%。全序列系统进化分析表明,YoMV-SX与YoMV-Wh形成一个独立分支,亲缘关系最近。这是YoMV侵染地黄的首次报道。     

北京地区辣椒上黄瓜花叶病毒和甜菜西方黄化病毒复合侵染的分子鉴定

辣椒是我国重要的蔬菜和经济作物,受多种病毒危害。2014年在北京市顺义区调查时发现部分种植的辣椒植株上叶片大面积黄化,边缘症状明显,个别植株叶片轻微上卷。提取典型症状样品的总RNA,反转录得到cDNA,分别用黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)特异引物和马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)通用引物进行PCR检测,CMV特异引物和马铃薯卷叶病毒属通用引物分别扩增得到约650bp和1 400bp的特异条带。测序和核苷酸序列比对表明,其分别与CMV和甜菜西方黄化病毒(Beet western yellows virus,BWYV)序列同源性最高为99%和96%。这是对我国种植的辣椒上发生的CMV和BWYV复合侵染的首次报道。     

小麦黄花叶病毒罗田分离物细胞质内含体蛋自基因的序列分析

利用RT-PCR,获得了小麦黄花叶病毒湖北罗田分离物细胞质内含体(CI)蛋白基因的cDNA克隆。序列分析结果表明,湖北罗田分离物CI基因由1977个核苷酸组成,编码一个由659个氨基酸组成的蛋白质。与已报道的河南潢川、四川雅安、江苏扬州及日本分离物序列比较,不同分离物之间核苷酸序列同源性在95.0％～97.5％之间,相应推导的氨基酸序列同源性在93.2％～97.1％之间。并对CI蛋白的功能进行了讨论。     

小麦黄花叶病毒罗田分离物细胞质内含体蛋自基因的序列分析

 利用RT-PCR,获得了小麦黄花叶病毒湖北罗田分离物细胞质内含体(CI)蛋白基因的cDNA克隆。序列分析结果表明,湖北罗田分离物CI基因由1977个核苷酸组成,编码一个由659个氨基酸组成的蛋白质。与已报道的河南潢川、四川雅安、江苏扬州及日本分离物序列比较,不同分离物之间核苷酸序列同源性在95.0%~97.5%之间,相应推导的氨基酸序列同源性在93.2%~97.1%之间。并对CI蛋白的功能进行了讨论。     

进境玉米种子中小麦花叶病毒的检测及其RNA3序列全长扩增分析

小麦花叶病毒（wheat mosaic virus,WMoV）是严重危害小麦、玉米等禾本科作物的种传病毒,在我国尚无发生,具有重要检疫意义。本研究利用引物WMoV-283F/R全国首次检测出玉米种子中的WMoV,成功扩增出了两个不同典型毒株NP序列,并分析其序列特征。根据WMoV-RNA3、WMoV-RNA3A和WMoV-RNA3B序列特点设计特异性引物,经RT-PCR扩增玉米种子样品2211-2和8044-10的RNA,扩增产物测序得到283 bp基因序列,分别与WMoV分离物GG1-RNA3B(GenBank登录号KT988872.1)、WMoV分离物K1-RNA 3(GenBank登录号KT988889.1)同源性为96.11%、96.47%。设计引物分别扩增玉米种子样品2211-2和8044-10的RNA核衣壳全长序列,得到WMoV-Germany RNA3、WMoV-Malaysia RNA3A和WMoV-Malaysia RNA3B全长序列。使用MEGA6软件采用Maximum likelihood法建立系统发育树,它们分别属于3个同源性差异明显的簇。通过DNAMAN序列比...     

一种侵染滇重楼的Potexvirus病毒分离物分子鉴定及其3'末端序列分析

 从云南武定的滇重楼上得到一个病毒分离物Paris-YN,病毒粒体为弯曲线状。利用RT-PCR扩增获得一条1074bp的片段,序列比较分析发现其与马铃薯X病毒属(Potexvirus)病毒3'末端的结构最为相似,且与属内的白三叶草花叶病毒等20个不同分离物3'末端有36.7%~58.9%的同源性;该病毒cp基因长639个核苷酸,编码212个氨基酸(22.8kDa),与20个Potexvirus病毒分离物的CP氨基酸序列比较发现,Paris-YN与白三叶草花叶病毒的CP氨基酸同源性最高(60.1%)。证据表明,该分离物可能为Potexvirus的新成员,暂命名为重楼X病毒(Paris polyphylla virus X)。     

一步法RT-PCR检测小西葫芦黄花叶病毒

本文在两步RT-PCR检测ZYMV的基础上进行了一步法RT-PCR检测小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)的实验,并对商品化一步法RT-PCR试剂盒和本文实验的一步法RT-PCR的效果和成本进行了比较,最终建立了一种比较实用的检测ZYMV的方法.     

侵染美人蕉的CMV基因组全序列及其致病性分析

 对一株从美人蕉上分离到的CMV(Cah1-CMV)进行了全长克隆、全序列分析及寄主生物学研究。结果显示:其RNA1全长为3 356 nt,编码993个aa的1a蛋白;RNA2全长为3 045 nt,编码843 aa的2a蛋白和111 aa的2b蛋白;RNA3全长为2 220 nt,编码279 aa的3a蛋白和218 aa的CP蛋白。系统进化树分析显示:Cah1-CMV是CMV亚组IB株系。但是,该株系可以通过汁液摩擦接种侵染烟草(Nicotiana tabacum)、心叶烟(N.glutinosa)和番茄(Lycopersivon esculentum)鉴别寄主,可引起心叶烟顶端坏死,而在其他茄科寄主上均为典型花叶。将Cah1-CMV的2b替换到Fny-CMV中,产生FCah12b-CMV重组体,分析其在心叶烟上的致病性。结果显示:侵染早期,FCah12b-CMV引起心叶烟顶端叶黄褐坏死,与其母本病毒Cah1-CMV的症状相似,而非Fny-CMV症状;侵染后期,FCah12b-CMV并不引起植株系统性坏死。Northern blot-ting结果显示:Cah1-CMV、FCah12b-CMV和Fny-CMV在系统叶中的积累水平不存在明显差异。以上结果说明Cah1-CMV的2b基因在Cah1-CMV致病过程中具有重要功能,但并不是整株症状的决定因子;致病性差异与其基因组RNA在寄主体内的积累水平并不呈正相关性。     

香蕉束顶病毒海口分离物基因组的克隆及序列分析

 以海口香蕉束顶病株的幼嫩假茎和叶片总DNA为模板,通过反向PCR法克隆了香蕉束顶病毒(Banana bunchy top virus,BBTV)海口分离物(命名为BBTV-HaiKou)的6个DNA组分的全长序列。结果表明,DNA1~6序列全长分别为1106、1040、1058、1040、1013和1082nt。各组分非编码区各包含一个茎环共同区和一个主要共同区,同源性分别为91.55%和88.45%。各组分编码区均编码一个开放可读框(ORF),其中DNA1 ORF内部还有一个小的ORF。序列分析表明,BBTV-HaiKou分离物与其它分离物间的DNA1最为保守,DNA2变异最大。DNA1组分核苷酸序列与亚洲组、南太平洋组各分离物及ABTV (Abacá bunchy top virus)分离物同源性分别为93.1%~99.1%,89.6%~90.7%和76.2%~77.4%,相应的编码蛋白氨基酸序列同源性在BBTV和ABTV中分别为93.4%~100%和85.7%。根据Karan等的分类方法,确定BBTV-HaiKou分离物属于亚洲组成员。