慢病毒介导shRNA干扰颗粒体蛋白前体(GRN)促进猪前体脂肪细胞分化

为研究颗粒体蛋白前体(granulin,GRN)在脂肪细胞发育过程中的作用,本实验构建了GRN短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒干扰载体,包装并感染猪前体脂肪细胞,采用油红O染色、油红O提取比色法检测猪前体脂肪细胞分化情况,采用Real-time PCR法检测成脂关键基因mRNA的表达变化情况。结果显示,GRN慢病毒干扰载体病毒滴度在5×107TU/mL以上,病毒感染前体脂肪细胞后显著降低了GRN的表达,shRNA2干扰效率最高,达到76%,沉默GRN后能够促进猪前体脂肪细胞分化;脂肪细胞分化标志基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、固醇调节原件结合蛋白(SREBP-1c)、脂肪细胞型脂肪酸结合蛋白(ap2)和脂蛋白酯酶(LPL)基因mRNA表达量均升高。结果表明,降低GRN基因表达促进了猪前体脂肪细胞分化,揭示GRN在猪前体脂肪细胞分化过程中可能起到抑制作用。     

猪脂肪细胞决定和分化因子1基因(ADD1)中一个新SNP的特性及其对肉质性状影响

脂肪细胞决定和分化因子1（adipocyte determination and differentiation factor-1,ADD1）基因与人类和鼠的脂肪细胞分化具有确定的连锁关系。在脂肪细胞分化过程中,ADD1与转录因子PPARγ和C/EBP发挥着关键的作用。本研究克隆了保守DNA序列并用PCR-SSCP和直接测序法鉴定其多态性。同时,选择136头猪作为实验群体来探索其与肉质性状的关系。多态性分析发现：在第二外显子内一个导致错义突变的SNP,该SNP在实验群体内分布不平衡,未检测到AA基因型。相关分析结果显示,ADD1不同基因型间在肌内蛋白（MP）和肉色（MC）存在显著（P〈0.05）的差异;肌内脂肪（IMF）存在极显著（P〈0.01）的差异。说明,ADD1基因多态性有可能应用到提高肉质的育种实践中。     

表皮生长因子（EGF）对牛前脂肪细胞增殖和分化的影响

以分离新生牛腹股沟白色脂肪组织的前脂肪细胞进行原代培养为基础,采用MTT比色法和油红O提取比色法研究表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)对牛前脂肪细胞增殖及分化的影响,同时通过半定量RT-PCR检测不同浓度EGF处理细胞第8天时对分化标志基因脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase,LPL)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(adipocyte fatty-acid-binding protein,A-FABP)mRNA表达的影响.结果表明,10 ng/mL EGF能极显著地促进前脂肪细胞的增殖(P<0.01),在分化诱导后添加不同浓度的EGF在第8天均可促进脂肪细胞的分化,并能促进脂肪细胞分化标志基因LPL、PPARγ和A-FABPmRNA的表达.EGF可以促进牛前脂肪细胞的增殖和分化.     

禾谷镰刀菌Fgap1转录因子调控Tri基因表达及DON毒素合成

DNA序列同源比对分析预测出镰刀菌氧胁迫调控因子Fgap1在DON合成基因簇的Tri5和Tri10基因上有结合位点。为阐明Fgap1转录因子在禾谷镰刀菌的Tri基因表达和DON产生中的作用,本研究以野生型PH-1和突变株⊿Fgap1为试验材料,通过菌落形态观察、菌丝生长速率、菌丝结构观察分析氧压敏感性,通过实时荧光定量PCR技术分析Tri基因在不用氧化压力下的表达量,并采用HPLC法测定DON毒素含量。结果表明,过氧化氢、甲耐醌、过氧化叔丁醇、重铬酸钾4种氧化剂均可抑制镰刀菌生长;通过同源重组构建的Fgap1基因缺失突变株对氧化压力更加敏感,明显抑制了镰刀菌的菌丝生长。在氧化胁迫下野生型PH-1菌株中DON毒素含量大量增加,Fgap1基因缺失突变株的DON毒素含量没有明显增加;在氧化胁迫下野生型PH-1菌株的Fgap1基因和Tri基因的表达量大幅上调,而基因缺失突变株⊿Fgap1中未检测到Fgap1基因表达,Tri基因的表达没有明显上调。本研究明确禾谷镰刀菌中Fgap1转录因子能够感受并传递氧化压力信号,为调控Tri基因的表达和DON毒素的合成提供了一定的理论依据。     

猪FUT1基因启动子区的确定及活性分析

F18大肠杆菌(Escherichia coli F18,E.coli F18)是养猪(Susscrofa)业中发生最普遍、危害最大的病原菌之一,球系列鞘糖脂生物合成通路及通路中α-(1,2)岩藻糖转移酶1基因(alpha(1,2)fucose transferase 1,FUT1)对断奶仔猪F18抗性具有重要调控作用.本研究运用生物信息学技术挖掘课题组前期获得的断奶仔猪转录组测序结果,确定FUT1基因的转录起始位点和启动子区.同时对启动子区序列进行CpG岛分析;采用双荧光素酶报告基因以及AliBaba 2.0软件,分别分析启动子区活性和CpG岛序列潜在的转录结合位点.通过比对人类(Homo sapiens)和猪的基因序列信息数据库,结果表明,FUT1基因转录起始区域具有5种可变剪接(AS-1,AS-2,AS-3,AS-4和AS-5)和2个启动子区域(启动子1和启动子2);双荧光素酶报告基因检测结果进一步显示,FUT1基因启动子2的转录活性极显著高于启动子1的转录活性(P＜0.01),启动子2的活性是启动子1的2.75倍,根据结果可以推测启动子2在转录过程中起主导作用;CpG岛分析显示,猪FUT1基因启动子1和启动子2分别存在一个CpG岛.FUT1启动子1扩增片转录因子预测分析表明,FUT1基因启动子1存在20个潜在的转录因子结合位点,并且Sp1出现在多个转录结合位点处.本研究结果为猪FUT1基因的甲基化检测和调控机制分析提供一定的基础和依据.     

长白猪NEAT1基因C1149G多态性位点与血液和免疫性状的关联(英文)

NEAT1是一个长的非编码RNA,参与了免疫反应、paraspeckle形成以及mRNA的输出等生物学过程。本研究利用PCR-RFLP方法检测了猪(Susscrofa)NEAT1一处C1149G单核苷酸位点的多态性,在检测的猪品种中等位基因频率变异较大。关联分析结果表明,在长白猪群体中CC基因型个体,0日龄和17日龄猪瘟病毒(CSFV)抗体水平,0日龄平均红细胞体积和32日龄红细胞平均血红蛋白浓度显著高于GG或CG基因型;而32日龄的血小板分布宽度、血小板平均容积和大血小板比率则显著低于GG或CG基因型。实验结果可以为猪的分子标记和辅助育种提供参考。     

黄芩苷对热应激条件下猪近端肾小管(LLC-PK1)细胞凋亡率及B细胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白基因(Bax)表达的影响

为探讨不同浓度黄芩苷对热应激条件下猪近端肾小管细胞(pig kidney proximal tubular cells,LLC-PK1)细胞凋亡率及B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(B-cellymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白基因(Bcl-2 associated X protein,Bax)表达的影响,将培养的LLC-PK1细胞随机分为7个组,Ⅰ组为37℃空白对照组,Ⅱ组为42℃单纯热应激1 h组,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅶ组分别为用不同浓度黄芩苷(0.01、0.1、1、10和100μg/m L)处理组后42℃热应激1 h组,运用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测Bcl-2和Bax基因及蛋白的表达,流式细胞仪(Annexin V-FITC/PI双染法)检测细胞凋亡率。结果表明,与Ⅰ组相比,Ⅱ组能显著诱导LLC-PK1细胞Bcl-2 m RNA的表达(P0.05),极显著诱导细胞Bax m RNA和蛋白的表达(P0.01),能极显著降低细胞Bcl-2和Bax m RNA和蛋白的比值(P0.01),极显著增加细胞凋亡率(P0.01),但对细胞Bcl-2蛋白的表达无显著影响(P0.05)。黄芩苷处理组与Ⅱ组相比,Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组LLC-PK1细胞Bcl-2 m RNA的表达量均升高,其中Ⅴ组差异极显著(P0.01),Ⅳ及Ⅵ组差异显著(P0.05),Ⅲ及Ⅶ组差异不显著(P0.05),而细胞Bcl-2蛋白的表达量与Ⅱ组相比均差异不显著(P0.05);同样与Ⅱ组相比,黄芩苷处理的各组细胞Bax m RNA及蛋白的表达量均降低,其中Ⅴ及Ⅵ组差异极显著(P0.01),其余各组差异显著(P0.05);除Ⅲ组外,其他各组细胞Bcl-2和Bax m RNA及蛋白的比值与Ⅱ组相比均显著升高(P0.05),其中Ⅴ组细胞Bcl-2和Bax蛋白的比值差异极显著(P0.01);细胞凋亡率仅有Ⅲ组与Ⅱ组相比差异不显著(P0.05),而Ⅴ及Ⅵ组细胞凋亡率极显著低于Ⅱ组(P0.01),其余的Ⅳ和Ⅶ组显著低于Ⅱ组(P0.05)。一定浓度范围内的黄芩苷(0.1~100μg/m L)可能通过下调热应激条件下LLC-PK1细胞Bax的表达,从而提高Bcl-2和Bax的比值,降低细胞的凋亡率,对细胞起到保护作用。本研究从分子水平研究黄芩苷缓解热应激对猪LLC-PK1细胞的损害作用,可为明确其解热机制提供理论基础,并为其在临床上的应用提供有价值的参考资料。     

灯盏花乙素(Scu)对猪肾小管上皮细胞(LLC-PK1)细胞热休克蛋白72(HSP72)及凋亡相关基因表达的影响

灯盏花乙素(scutellarin,Scu)具有清热解毒、扩张心脑血管、改善微循环等作用。通过观察不同浓度Scu对猪肾小管上皮细胞(pig kidney proximal tubular,LLC-PK1)热休克蛋白72(heat shock protein72,HSP72)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cellymphoma/leukemia-2,Bcl-2)及Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2associated X protein,Bax)表达的影响,探讨灯盏花乙素提高细胞耐热性的可能机制。将培养的LLC-PK1细胞随机分为37℃空白对照(Ⅰ组),42℃单纯热应激1 h(Ⅱ组),以及分别用不同浓度(1×10-5、1×10-6和1×10-7mol/L)Scu处理并42℃热应激1 h组(分别为Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组),提取各组细胞总RNA和总蛋白,用实时荧光定量PCR和Western blot分别检测HSP72、Bcl-2和Bax基因及蛋白的表达量。结果显示,与Ⅰ组相比,Ⅱ组LLC-PK1细胞HSP72和Bax的mRNA及蛋白表达量显著升高(P0.05),Bcl-2/Bax mRNA和蛋白比值显著降低(P0.05),Bcl-2 mRNA和蛋白表达量并无显著差异(P0.05)。与Ⅱ组相比,Ⅳ和Ⅴ组LLCPK1细胞HSP72 mRNA和蛋白的表达量均显著升高(P0.05),Ⅲ组无显著差异(P0.05);Ⅳ组细胞Bcl-2 mRNA和蛋白表达量均显著升高(P0.05),Ⅲ和Ⅳ组并无显著差异(P0.05);Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组Bax mRNA和蛋白表达量均显著降低(P0.05);Ⅳ和Ⅴ组Bcl-2/Bax蛋白比值显著升高(P0.05)。研究结果表明,热应激条件下Scu可诱导LLC-PK1细胞HSP72表达,提高Bcl-2/Bax比值。结果提示,Scu可增强细胞的抗热休克作用。本研究丰富了体外培养细胞热应激反应的理论,为在实践中增加细胞抗热休克能力提供了理论依据。     

亚硝酸盐添加对土壤硝化和反硝化基因转录活性及N2O排放的影响

设施菜田土壤氧化亚氮（N2O）脉冲式排放期间通常伴随着亚硝酸盐（NO2-）的大量积累,为揭示NO2-对设施菜田土壤N2O排放的影响机制,以两种典型蔬菜种植区土壤（碱性土壤/酸性土壤）为研究对象,通过室内培养试验,对比厌氧和好氧培养条件下添加NO2-后两种土壤无机氮转化与N2O、氮气（N2）和二氧化碳（CO2）等气体排放,以及氨氧化单加氧酶α亚基调控基因（amoA）、亚硝酸盐还原酶调控基因（nirK和 nirS,统称nir）和N2O还原酶调控基因（nosZ）的丰度和转录情况。结果显示：受pH等环境因素影响,土壤中NO2-含量并不一定与N2O排放之间存在相关性,但添加NO2-的处理显著增加了两种土壤的N2O排放量和N2O/(N2O+N2)指数（IN2O）（P<0.05）。碱性土壤中,60 mg?kg-1外源NO2-对土壤CO2排放无明显抑制作用,厌氧培养条件下nirK基因、好氧培养条件下amoA和nirS基因均出现了添加NO2-后转录拷贝数显著高于空白处理的现象,而nosZ基因无此现象。酸性土壤中,amoA转录活性整体较低,好氧空白处理时nirS基因转录拷贝数随培养时间的延长而增加（P<0.05）;60 mg?kg-1外源NO2-明显降低了酸性土壤的CO2排放量、相关基因的丰度及转录拷贝数。上述结果显示,土壤中积累的NO2-会通过诱导nir基因转录与N2O还原酶竞争电子和抑制N2O还原酶活性等途径,增加土壤的IN2O,影响有氧条件下N2O的排放途径,研究结果将为探索设施菜田土壤氮素高效利用和N2O减排提供科学依据。     

小鼠Gli-similar-1(Glis1)基因新转录本功能分析

Gli-similar-1(Glis1)是一种在小鼠卵母细胞和受精卵一、二细胞期高表达蛋白,在小鼠胚胎发育中起着重要的作用。本实验以小鼠(Mus musculus)肾为材料,克隆小鼠 Glis1 基因,并构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核表达载体 pEGFP-C1-Glis1。研究了 Glis1 蛋白的表达和亚细胞定位,并利用 qPCR 检测过表达 Glis1 对 Oct4、Sox2、c-Myc、N-Myc、Klf4、Nanog、Nrgn 和 Tspan18 等基因表达的影响。结果表明,从小鼠肾中成功克隆到 Glis1 的一个新转录本(GenBank 登录号: JQ043365),其第三个核定位信号缺失 4 个氨基酸,C 端结构域缺失 124 个氨基酸,包括富含脯氨酸结构域全部氨基酸序列。Glis1 定位于细胞核,过表达能够显著上调Tspan18。研究结果表明,Glis1 新转录本与现有转录本亚细胞定位结果一致,其在小鼠胚胎发育和小鼠成纤维细胞重编程过程中可能发挥不同的功能。