大鼠肌肉卫星细胞的分离、鉴定与诱导分化

肌肉卫星细胞是组织特异性干细胞,负责着骨骼肌的生长和再生.尽管发现卫星细胞的存在已经有50多年的历史了,但分离鉴定肌肉卫星细胞的方法仍然不稳定.本研究使用两步酶消化和差速贴壁相结合的方法分离大鼠(Rattus norve gicus)肌肉卫星细胞.免疫细胞化学染色显示,分离的大鼠肌肉卫星细胞高表达Desmin;通过RT-PCR鉴定所分离的细胞表达肌源性干细胞因子Myf5及Myod1;成肌诱导48h后,卫星细胞开始形成多核的肌管;成脂诱导1周后,细胞内开始出现脂滴,2周后充脂细胞明显增多.研究结果提示,分离的卫星细胞具有肌源性,有发育形成肌管和向成脂细胞分化的能力.     

猪前体脂肪细胞与肌卫星细胞体外联合培养

利用差速贴壁法分别纯化前体脂肪细胞与肌卫星细胞,按1∶10的浓度比接种混合培养。以单独两类细胞培养作对照,采用油红O染色和Desmin免疫组化染色鉴定,通过形态学观察和MTT比色绘制生长曲线研究细胞生长规律。结果表明,Desmin免疫组化染色观察肌细胞阳性率达97%以上,油红O染色计数诱导分化细胞比率大于60%;形态学观察发现,联合培养细胞接触汇合前形态呈梭形,接触后不规则重叠交织生长;充脂细胞呈现较晚,且数量稀少;HE染色可见多核细胞融合成肌管样结构;测定2～9d细胞生长曲线显示,联合细胞组增殖比率大于对照组,经历2～3d潜伏期、3～7d指数生长期后,并未与对照组同步进入平台期,而呈持续缓慢上升趋势。实验初步实现了体外猪前体脂肪细胞与肌卫星细胞的直接联合培养,并显示其与对照组生长特性存在差异。     

猪前体脂肪细胞与肌卫星细胞体外联合培养的初步研究

目的：初步建立猪前体脂肪细胞与肌卫星细胞体外联合培养的方法，探讨联合培养模式下两类细胞的基本生长特性。方法：利用差速贴壁法分别纯化前体脂肪细胞与肌卫星细胞，按1：10的浓度比接种混合培养，以单独两类细胞培养作对照；采用油红O染色、Desmin免疫组化染色鉴定；通过形态学观察、MTT比色绘制生长曲线研究细胞生长规律。结果：Desmin免疫组化染色观察肌细胞阳性率达97%以上，油红O染色计数诱导分化细胞比率大于60%；形态学观察发现，联合培养细胞接触汇合前形态呈梭形，接触后不规则重叠交织生长；充脂细胞呈现较晚，且数量稀少； HE染色可见多核细胞融合及肌管样结构；测定2～9d细胞生长曲线显示，联合细胞组增殖比率大于对照组，经历2～3d潜伏期、3～7d指数生长期后，并未与对照组同步进入平台期，而呈持续缓慢上升趋势。结论：初步实现了体外猪前体脂肪细胞与肌卫星细胞的直接联合培养，并由研究结果显示其与对照组生长特性存在差异。     

猪羊水干细胞的分离培养及向脂肪细胞诱导分化

羊水干细胞是一种存在于胎儿羊水中Oct4阳性的多能性干细胞.该细胞具有增殖能力强、分化潜能高和免疫原性低等特点,在生物学和医学研究上具有广泛的应用前景.本实验从不同胎龄的猪胎儿标本中分离猪羊水干细胞,并通过诱导其向脂肪细胞分化来检测其多向分化潜能.结果表明,从胎龄为30～70 d的猪胎儿羊水中分离出的羊水干细胞贴壁率高,增殖能力强,活性好,并建立了两株猪羊水干细胞系.经流式细胞仪和RT-PCR检测,猪羊水干细胞表达CD117、CD44、CD166和CD90表面抗原,不表达CD45、CD54和CD34;稳定表达Oct4、Nanog、C-myc和HLA-abc干细胞特异标志基因;转染报告基因载体pOct4-EGFP和pNanog-EGFP后表达绿色荧光;此外,猪羊水干细胞还能够在体外诱导分化为脂肪细胞.研究结果为大动物羊水干细胞的研究提供了可借鉴的材料.     

重组脂联素(rAdp)对皖南花猪骨骼肌卫星细胞脂联素及受体和肌球蛋白重链基因表达的影响

脂联素(Adp)是主要由脂肪组织分泌的细胞因子,其作用受到普遍关注.选择10 d皖南花猪半腱肌分离骨骼肌卫星细胞,用不同浓度(0、1、5和10μg/mL)的重组脂联素(rAdp)分别处理12和24 h,采用荧光定量PCR检测骨骼肌细胞中脂联素(Adp)、脂联素受体1(AdpR1)、脂联素受体2(AdpR2)和肌球蛋白重链(MyHC),4种亚型MyHC1、MyHC2a、MyHC2b、MyHC2x,以及AMP激活蛋白激酶(A MPK)、过氧化物增殖剂活化受体α(PPARa)的基因表达.结果显示:(1)1μg/mL rAdp处理后,Adp和A dpR1基因表达量极显著增加,AdpR2的表达量在处理24 h极显著增加.而5和10 μg/ml组Adp、AdpR1和AdpR2的表达量低于对照组;(2)1μg/mL rAdp处理显著上调MyHC1和MyHC2x的基因表达量,而MyHC2b的表达量则在处理24 h极显著下降.5和10μg/mL rAdp处理显著下调MyHC2b的基因表达量,而对MyHC1无显著影响.10μg/mL处理后MyHC2a的表达量极显著下降,5μg/mL处理后MyHC2x的表达量极显著增加;(3)1、5和10 μg/mL rAdp处理12 h后,AMPK基因表达量极显著高于对照组,但是低剂量组具有较高的基因表达量.1μg/mL rAdp处理12和24 h,PPARa基因表达量极显著高于对照组,然而高剂量组没有这种效应.结果提示,Adp作用于骨骼肌,可能是与受体结合后通过AMPK和PPARa两个信号途径,提高MyHC1、MyH2x和降低MyH2b基因表达量,改变肌纤维组成.     

胎猪胰腺干细胞体外诱导分化为胰岛素分泌细胞及其移植治疗裸鼠糖尿病的研究

缺乏供体细胞制约着胰岛替代疗法在Ⅰ型糖尿病治疗过程中的应用。本研究对实验室分离保存的胎猪胰腺干细胞(fetal porcine pancreatic stem cells,FPPSCs),体外诱导分化为胰岛素分泌细胞以及移植治疗裸鼠糖尿病的能力进行了深入研究,以探讨该细胞株作为异种供体细胞的潜力。研究结果表明,该细胞体外增殖活力旺盛,其形态及表面抗原表达特征与间充质干细胞极其相似,除表达胰腺干细胞相关标志外,FPPSCs还表达一些胚胎干细胞的相关标志。采用无血清诱导方案诱导2周后,FPPSCs形成DTZ染色阳性的胰岛样细胞团(islet-like cell cluster,ICC),该细胞团表达胰岛素、Glut-2等胰岛素分泌细胞功能相关的蛋白。RT-PCR结果显示,诱导后,胰腺干细胞相关标志表达减弱,而成熟胰岛素分泌细胞相关标志表达增强。葡萄糖刺激实验结果显示,诱导后,FPPSCs合成、分泌胰岛素和C-肽的能力显著增强(P<0.05)。将诱导2周后的细胞移植到糖尿病裸鼠腹腔内,可缓解其高血糖状况。结果提示,FPPSCs具有间充质干细胞的特性,体外能够诱导分化为胰岛素分泌细胞,并具有改善糖尿病裸鼠高血糖症状的...     

猪肌肉组织双向电泳分离条件的建立及常见问题分析

为建立和优化猪肌肉组织蛋白质双向电泳技术,从提取方法、加样量、IPG胶条的选择、SDS-PAGE胶浓度、染色方法等多个方面对双向电泳分离效果进行比较研究.结果显示,液氮研磨+超声破碎法提取猪肌肉组织蛋白效果优于液氮研磨法,前者细胞破碎彻底蛋白质溶解性好且核酸污染少,图谱质量较好;18cm pH 4～7的IPG胶条分离效果比pH 3～10非线性IPG胶条好;对于银染,18 cm pH 4～7的IPG胶条150μg上样量比较适宜;同一肌肉样品的三块胶的重复性可达70％以上;同时,对双向电泳过程中的典型问题作了详尽分析.研究结果表明,通过优化的双向电泳条件获得了较高分辨率和较好重复性的猪肌肉组织双向电泳图谱,可用于后续蛋白质组学分析.     

应用酵母双杂交技术筛选猪Calsarcin-2蛋白结合蛋白

Calsarcins是钙调磷酸酶肌小节特异性结合蛋白家族,本实验旨在研究Calsarcin-2(CS2)在猪骨骼肌纤维形成和信号通路调控中的功能。应用酵母双杂交方法筛选猪骨骼肌组织中CS2蛋白结合蛋白,从猪骨骼肌文库中筛选出180个阳性克隆,经分析得到12个相互作用的蛋白,研究发现骨骼肌α-肌动蛋白1(ACTA1),肌联蛋白(TTN)及钙调素1(CALM1)为CS2互作蛋白。ACTA1参与肌肉收缩过程,TTN调节肌小节动力传导及Z线装配,CALM1参与钙离子信号传导。结果表明,CS2在维持Z线结构稳定和参与钙离子信号传导方面起重要作用。     

从原始生殖细胞分离昆明小鼠EG细胞及其传代培养

为提高昆明小鼠胚胎生殖细胞(embryonic germ cells, EG cells)建系效率，以怀孕8.5～12.5 d小鼠胎儿为材料，比较了胎儿后1/3部位的组织共培养、生殖嵴共培养、差速贴壁和穿刺生殖嵴4种分离胚胎原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)的方法以及不同传代方式对EG细胞克隆的影响。结果表明：生殖嵴共培养和差速贴壁方式获得了较好分离EG细胞的效果，与其它两组比较差异显著；手工传代方式与连同成纤维细胞一起消化的传代方式相比获得了较高传代比率。对所分离EG细胞经形态观察、AKP染色和体外分化能力检测，证实其符合小鼠EG细胞的集落状生长、细胞未分化特性及细胞多能性等特征。     

胎猪胰腺干细胞的分离与鉴定

从胎猪胰腺分离得到一株细胞，该细胞经免疫组化检测表达PDX-1，GLUT-2，PCNA，Glucagon，somatostatin，polypeptide，弱表达nestin，目前细胞已传至58代。其在体外的生长行为有类似间充质干细胞样生长形态，经诱导后可分化为具有三维立体结构的类胰岛细胞团。成团后细胞强表达insulin、ck-19等标志，放免测定显示诱导成团后细胞胰岛素分泌量增加，显著高于未诱导细胞（P<0.05）。说明胰腺内存在着多潜能干细胞，本方法分离到胎猪胰腺干细胞，经诱导分化可形成有功能的胰岛样细胞团并释放胰岛素,有望为进一步研究异种胰腺干细胞移植治疗糖尿病提供材料。     

反义RNA干扰MSTN对牛肌肉卫星细胞脂肪生成相关基因的影响

肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)属于转化生长因子β(transforming growth factor β,TGF-β)超家族成员,在骨骼肌中高表达;敲除MSTN后,肌肉质量增加、脂肪含量变少,但抑制MSTN表达后,如何影响脂肪沉积,尚未研究清楚.为了探究抑制MSTN表达后对脂肪相关基因表达的影响,本研究利用反义RNA技术,成功构建了双向表达载体pMSTN-CMV-CAG-antiMSTN,并通过Western blot筛选出抑制效果最佳的MSTN的反义载体.利用最佳反义MSTN载体在牛(Bos taurus)肌肉卫星细胞中有效干扰MSTN表达后,检测了脂肪合成相关基因(脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN),乙酰CoA羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)和硬脂酰辅酶A去饱和酶1(stearoyl-CoA desaturase-1,SCD-1))、脂肪酸氧化分解相关基因(肉毒碱棕榈酰转移酶ⅠB(carnitine palmitoyltransferase 1b,CPT-ⅠB),乙酰辅酶A氧化酶(acyl-CoAoxidase,ACOX1)和烯酰辅酶A水合酶(enoyl-CoA hydratase 1,ECHDC1))以及脂肪转运蛋白(fatty acidtransport proteins,FATP)表达的变化.结果显示,在MSTN基因被干扰后,肌肉卫星细胞中脂肪酸合成相关基因表达量上调,脂肪氧化分解相关基因中ACOX1和CPT-1B表达量上调,而ECHDC1基因表达量下调,另外,FATP表达基本没有变化.MSTN功能缺失后,脂肪合成和脂肪氧化分解过程都得到了加强,所以MSTN敲除所导致的脂肪减少并不是由于抑制了脂肪合成,而是由于脂肪分解加强,为肌肉提供更多的能量.MSTN下调后,CPT-1B的表达上调最为显著,而CPT-1B是脂肪酸β氧化的关键基因,所以研究结果提示MSTN对于脂肪的影响主要是通过影响β氧化过程实现的.研究结果为MSTN下调所导致的脂肪含量下降提供了理论依据,为MSTN作用于脂肪沉积的机制做出了初步探讨.     

鸡胚原始生殖细胞的分离、培养及鉴定

采用Ficoll密度梯度离心法分离第19期(孵化68～72 h)艾维茵鸡(Gallus domesticus)生殖嵴原始生殖细胞(PGC)，通过体细胞-PGC共培养进行了原代和传代培养，对PGC进行了碱性磷酸酶(AKP)和过碘酸雪夫氏反应(PAS)鉴定，并用细胞增殖核抗原(PCNA)免疫细胞化学检测了传代于鸡胚饲养层上PGC的增殖活性。培养的PGC经AKP和PAS鉴定均为阳性，AKP阳性为红棕色，PAS阳性为深红色，PCNA染色显示PGC集落为红棕色，表明PGC处于增殖状态。同时比较了不同体外培养条件(5%~20%胎牛血清(FCS), ITS培养液(M199+ 10 μg/mL 胰岛素+5 μg/mL转铁蛋白+3×10-8 mol/L亚硒酸钠), 条件培养液, 15%FCS+ITS, 15%FCS+40% 条件培养液)下PGC增殖情况。发现未经密度梯度离心的PGC生长较离心的PGC好，且5%FCS在原代培养中起较好的促增殖作用；而传代培养时在不同培养条件下，5%FCS组或ITS组形成的PGC集落的直径较大，而仅用单纯的条件培养液效果并不明显。结果表明除鸡胚饲养层可作为PGC增殖的支持体系外，在体细胞-PGC共培养方式下5%FCS或单独的ITS也可作为PGC体外增殖的一种培养体系。     

兔胰腺干/祖细胞的分离培养和鉴定

采取1～9日龄的实验仔兔胰腺,1 mg/mLⅣ型胶原酶消化,低糖DMEM培养.细胞铺满后进行传代20代以上冻存.对2～3代的细胞进行免疫组化染色,诱导向β细胞分化并进行高糖刺激胰岛素分泌.结果表明,兔的胰腺干/祖细胞具有较强的增殖能力;免疫组化染色表现为PDX-1、CK19、nestin和胰高血糖素阳性;分化诱导2 d后,双硫腙染色（DTZ）20%阳性,6 d后迅速增加到80%;高糖刺激诱导细胞具有胰岛素释放能力.通过免疫组化染色和诱导细胞胰岛素分泌实验证明分离的是兔胰腺干/祖细胞.首次报道兔胰腺干/祖细胞分离培养方法.