一种制备动物乳腺生物反应器的通用表达载体的构建

本文构建了一种用于制备动物乳腺生物反应器的通用表达载体，这种载体含有牛αｓ１－酪蛋白基因的表达调控序列，在５′和３′调控区之间，存在多克隆位点，便于各种不同外源目的基因的插入，两侧存在罕见的单一酶切点，从而可以构建成为理想的转基因结构。     

牛乳腺细胞系BME-L1β-酪蛋白分泌的诱导及人促红细胞生成素(hEPO)的表达

用悬浮胶元(floating gel)及生乳激素(lact ogenic hormones)诱导BME-L1细胞合成并分泌了β-酪蛋白,证明了BME-L1所具有的上皮性质.用质脂体介导法向BME-L1转入含人促红细胞生成素(hEPO)基因的质粒pBCE,经生乳激素及悬浮胶元诱导,这些细胞短暂表达hEPO.讨论了影响乳腺细胞内源乳蛋白基因及外源基因表达效率的因素.     

马铃薯叶片特异性启动子克隆分析及其驱动的人白细胞介素-12表达载体构建

利用植物生物反应器表达具有应用价值的药用蛋白是近年来生物技术研究热点。本研究利用PCR技术从马铃薯基因组中克隆其叶片组织特异性启动子Prbcs后,利用PLACE等数据库对序列进行启动子元件分析,接着通过重叠PCR、限制性内切酶酶切、体外连接、转化等技术,以双元载体pCambia-2301为骨架,构建Prbcs驱动的药用蛋白人白细胞介素12（hIL12）表达载体。结果显示,本研究成功从马铃薯基因组中扩增得到了623 bp大小的启动子片段,序列分析表明该片段含有典型的启动子元件如TATA-box,以及一些组织特异性的相关响应元件,符合组织特异性启动子的特征;成功获得了基于pCambia-2301的Prbcs驱动的hIL12植物表达载体。本研究获得的Ppatatin启动子及其驱动的hIL12表达载体,为提高hIL12在植物生物反应器中表达量以及优化马铃薯生物反应器打下了基础。     

牛α1，3-半乳糖转移酶基因部分片段的克隆及无启动子打靶载体的构建*

利用La-PCR的方法,从牛的基因组中成功地获得2．4kb和5．2kb的扩增产物。其中2．4kb片段位于5～7外显子之间,包括了完整的第5及第6内含子;5．2kb片段位于8～9外显子,包括了完整的第8内含子。2个片段分别克隆于pCR-XL-TOPO载体。测序结果表明所克隆的两片段均为牛α1,3半乳糖转移酶基因的基因组序列。2．4kb和5．2kb的两个片段分别作为打靶载体的5’、3’同源臂构建了无启动子打靶载体TOPO-IRESneo7．6。电击转染牛胎儿成纤维细胞以期敲除牛的α1,3半乳糖转移酶基因。     

人IGF-1基因重组杆状病毒表达载体的构建及在sf9细胞中的表达

以pcDNA3．1／IGF-1为模板，采用PCR方法对IGF-1基因进行扩增，EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ酶切回收含IGF-1基因的DNA片段，与pFastHTA连接，获得重组载体pFast／IGF-1；将其转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH10Bac感受态细胞，经卡那霉素、四环素、庆大霉素及蓝白斑筛选得到重组杆状病毒载体pBacmid-Fa-IGF-1，PCR鉴定得到单-／GF-1条带。将该病毒载体转染sf9细胞，进行病毒重组，Western-blot检测／GF-1表达，并用MTT法检测促内皮细胞生长活性。结果成功获得了重组病毒，Western-blot检测出现1条约13．0kD的带，MTT法检测IGF-1促细胞生长率为24．4％。     

转录因子DREB1A基因的克隆及植物表达载体的构建

研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用。根据GenBank中登录的DREB1A基因的序列设计引物,用PCR方法从拟南芥中克隆DREB1A基因,利用基因重组技术成功构建了植物表达载体pCAMB1A1300-DREB1A。该结果为进一步利用DREB1A基因做遗传转化研究奠定了基础。     

含有融合标记基因和LoxP／FRT位点的植物表达载体构建及应用

本研究利用化学合成法合成了包含pCAMBIA0390左右边界T-DNA和LoxP／FRT（LF）位点的DNA片段Ⅰ,利用SacⅡ和SphⅠ酶切位点,去除了pCAMBIA0390左右边界T—DNA和多克隆位点之间的序列,然后连接DNA片段Ⅰ和载体片段,构建了植物表达载体pGM323-LF-enTP。随后,再合成含有适合在单予叶植物中表达的由玉米Ubi-1启动子驱动的融合标记基因（Bar：：gus）和水稻actin-1启动子驱动的助抗虫蛋白基因（Cry1A6）表达元件的DNA片段Ⅳ,在pGM323～LF—enTP的基础上,利用5以Ⅰ和PstⅠ位点构建了同时含有LF位点、Bar：：gus以及Cry1Ab基因表达元件的表达载体pGM626-LF—ABt。利用含有pGM626-LF—ABt的农杆菌遗传转化烟草和玉米,以草丁膦作为抗性筛选剂,非转化细胞得到了有效抑制,快速获得了转基W植株,利用GUS组织化学检测和RT—PCR分析了转基因植株中标记基因的表达,结果表明pGM626-LF—ABt可以用于农杆菌介导的单、双子叶植物遗传转化。本研究为培育安全抗虫转基因植物奠定了基础。     

人促红细胞生成素基因和AcGFP1共表达真核表达载体的构建及鉴定

摘要：为构建重组人红细胞生成素（hEPO）真核表达载体，应用PCR及人工合成方法获得除第一内含子的hEPO基因组基因，并将其插入载体pIRES2-AcGFP1，成功构建hEPO基因和AcGFP1共表达载体phEPO-IRES-AcGFP1，然后用脂质体法使该载体转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO）及山羊成纤维细胞，于转染后48h在荧263光显微镜下观察到绿色荧光。经G418筛选，在荧光显微镜下发现成簇的绿色荧光细胞，说明重组质粒被成功导入细胞并表达AcGFP1，为鉴定hEPO转染成功与否及阳性细胞筛选提供了方便。     

苎麻茎皮EST数据库构建及肌动蛋白解聚因子（ADF）和β-tubulin基因时空表达分析

本研究以封行期的苎麻(Boehmeria nivea(L.)Gaud)的茎皮为材料构建cDNA文库.从文库中随机挑选400个克隆测序获得274条有效序列(GenBank登录号为EH041928～EH041933,EH667190～EH667251,ES584534～ES584595和FG588817-FG588960).生物信息学分析表明:拼接出217个假定独立转录本(TUT),冗余度为20.8%.Blast比对结果获得了91条已知功能基因或具推测功能的基因,其余183个ESTs为未知基因.91条具已知或推测功能的ESTs大致分为9类,其中与细胞壁有关的ESTs占5.5%.对与细胞壁有关基因中的肌动蛋白解聚因子(ADF)和β-tubulin基因进行半定量RT-PCR分析,结果显示这两个基因在4个生长期和5个组织中均有表达,在封行期的茎皮高度表达.提示ADF和β-微管蛋白基因的表达具有时空特异性.     

表达外源绿荧光蛋白重组山羊痘病毒的构建及纯化

以我国自行培养并得到广泛应用的山羊痘病毒 (Goatpox virus，GPV) 疫苗株为亲本，以复制非必需胸苷激酶 (tk) 基因作为外源基因插入靶点及同源重组臂。利用转移载体pTK-lacZ-gfp及其与GPV发生同源重组获得的病毒(rGPV-lacZ-gfp) 验证外源基因β-半乳糖苷酶 (lacZ) 和绿荧光蛋白 (gfp) 基因在背靠背启动子p11和p7.5启动下成功稳定表达后，将转移载体lacZ基因更换为gpt (黄嘌呤鸟嘌呤磷酸转移酶) 基因 (pTK-gpt-gfp)，利用MPA阻断核酸代谢途径筛选并获得了遗传稳定表达的单一纯化病毒克隆 (rGPV-gpt-gfp)。研究建立了表达外源基因重组GPV构建系统及其克隆纯化方法，为进一步开展GPV活载体疫苗研制及相关基础研究提供了技术平台。     

棉花PEPC基因种子特异性ihpRNA表达载体的构建及鉴定

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase,PEPC）是控制植物体中蛋白质和脂肪酸含量比例的关键酶。本研究从棉花中克隆得到船PC基因,长度为433bp,并将该基因的正反义片段分别和种子特异性启动子napin启动子（1123bp）、α球蛋白B基因启动子（1149bp）连接,插入到植物表达载体pCADS1341中。经酶切和PCR鉴定,成功的构建了PEPC基因的种子特异性ihpRNA表达载体pCADSNPSPA和pCADSBPSPA,为后期高含油量棉花材料的选育打下了基础。     

人促红细胞生成素基因和AcGFP1共表达真核表达载体的构建

人促红细胞生成素(human erythropoietin,hEPO)是一种由肾脏分泌的酸性糖蛋白激素。它是一种红细胞造血刺激因子,在医学临床,主要用于治疗肾性贫血,对其它各种疾病和     

真核双顺反子表达载体pcDNA3.1AB的构建与表达

为了构建由双CMV启动子调控的真核双顺反子表达载体pcDNA3.1AB,首先在pcDNA3.1(+)的基础上,构建出pcDNA3.1A和pcDNA3.1B,通过PCR扩增pcDNA3.1A上含-PCMV-MCS-BGHpolyA-表达单元的片段,定向克隆入pcDNA3.1B,即得载体pcDNA3.1AB。将DsRed与EGFP基因插入pcDNA3.1AB,分别构建pcDNA-DsRed、pcDNA-EGFP和pcDNA-DsRed-EGFP。质粒转染COS-7细胞瞬时表达,用荧光显微镜进行检测。结果双价质粒pcDNA-DsRed-EGFP能同时表达红色和绿色荧光蛋白基因,两基因表达强度无显著差异,且双价与单价质粒相比荧光蛋白表达强度相当。双顺反子表达载体pcDNA3.1AB的成功构建和表达,为进行基因表达及双价核酸疫苗的研究奠定了基础。     

pBI121-Lyz-GFP表达载体的构建及其对和田苜蓿愈伤组织的转化

利用分子克隆技术,将GFP基因片段插入到pBI121-Lyz多克隆区,构建了重组表达载体pBI121-Lyz-GFP。经SmaI与BamHI双酶切和PCR验证重组质粒,均能得到约750bp的目的片段,通过进一步测序证明：GFP基因已成功连接到pBI121-Lyz中,且重组质粒连接方向正确。利用冻融法将重组质粒导入农杆菌菌株LBA4404,用叶盘法转化和田苜蓿,筛选出具有卡那霉素抗性的愈伤组织,经PCR扩增和荧光显微镜检测证明重组基因已成功转化到和田苜蓿愈伤组织中。     

加强Psy基因表达和通过RNAi抑制Lcy基因表达的载体构建

通过基因工程手段加强八氢番茄红素合成酶（Psy）基因的表达和通过RNAi抑制番茄红素β-环化酶（Lcy）基因（该基因是调控番茄红素转化为其他类胡萝卜素的主要的基因）的表达是培育高番茄红素品种的重要手段之一。根据GenBank中拟南芥的Psy基因序列（NM-121729），通过聚合酶链式反应（PCR）从拟南芥的cDNA中扩增出了长1296的Psy基因。根据GenBank中番茄的Lcy基因序列（X86452）和Pds启动子序列（U46919）分别设计特异引物从番茄中扩增出了Lcy基因的高度保守的长302bp的DNA片段和长1790的Pds启动子片段。根据RNAi的原理，将Lcy基因的长302bp的DNA片段以正反两个方向通过一段内含子序列连接在一起形成RNAi片段插入到抗Kan的pVCT2020的表达载体中，并通过具有果实特异性特点的启动子——八氢番茄红素去饱和酶基因（Pds）启动子控制该干扰片段的表达，同时将Psy基因在Pds启动子调控下插入到同一载体中，从而构建成了能同时加强Psy基因的表达和抑制Lcy基因表达的植物表达载体。     

柞蚕抗菌肽D基因重组杆状病毒表达载体的构建及其表达(简报)

昆虫抗菌肽是一类碱性小分子多肽,具有热稳定性、诱导源的非专一性和广谱的杀菌作用.抗菌肽在杀菌、抗肿瘤甚至抑制病毒复制方面具有较大的应用潜力,近年来国内外在抗菌肽的基因工程方面开展了不少研究工作.本研究采用杆状病毒载体在昆虫细胞和虫体中表达柞蚕抗菌肽D,为抗菌肽在农业、医疗卫生等方面的应用奠定基础.     

牛nanog基原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达

从6周龄的胎牛(Bos taurus)原始生殖嵴中提取总RNA,通过RT-PCR扩增nanog基因,将其克隆到PMD-18T载体,然后再亚克隆到pGEX-KG表达载体上,获得原核表达质粒pGEx-KG-nanog,限制性内切酶分析和DNA测序证明所插入片段为牛nanog基因编码序列.重组质粒转化大肠杆菌JM109(Escherichia coli),在不同的培养温度(25、30和37℃)和不同浓度的IPTG(0.10、0.25、0.50、1.00和2.00mmol/L)诱导下均获得了表达,结果表明,培养温度和IPTG浓度对GST-Nanog融合蛋白在大肠杆菌中的表达影响甚微;经Western blot检测证实该蛋白约60kD,并具有GST抗原活性,证实目的蛋白为Nanog蛋白.