构建脱水反应元件(DRE)报告子用于小叶杨DRE转录因子的克隆

通过基因合成构建了脱水反应元件(dehydration-responsive element,DRE)酵母表达载体,通过同源重组,利用SD-His-Ura平皿筛选获得了含有pHis-1-DRE和pLacZi-DRE双重报告子的酵母即得DRE报告子。建立小叶杨(Populus simonii)干旱模型,提取RNA,构建小叶杨cDNA AD融合表达文库,通过酵母单杂交的方法,用DRE报告子对小叶杨cDNAAD融合表达文库进行了筛选,得到了2个阳性克隆。结果表明,所构建的DER报告子被激活,可用于小叶杨DER转录因子的克隆。     

不结球白菜酵母杂交cDNA文库构建及BcFT上游调控因子筛选

FLOWERING LOCUS T(FT)是调控植物开花途径中的关键基因,前期研究中,在比较晚开花wym-97和早开花cx-49两个品种的BcFT启动子时,发现cx-49的BcFT启动子存在一个1 577 bp的插入片段。为探索该插入片段对不结球白菜开花的影响,本研究构建不结球白菜酵母杂交cDNA文库,继而利用酵母单杂交技术筛选与BcFT启动子互作的蛋白。结果显示,本研究所得cDNA文库的库容为1.8×10⁶ CFU,重组率为100%,插入片段长度分布范围约400～2 000 bp,平均长度大于1 000 bp,表明不结球白菜酵母杂交cDNA文库构建成功。自激活试验表明,800 ng·mL^-1的金担子素(AbA)可以抑制诱饵载体的自激活。通过酵母单杂交试验筛选到结合BcFT启动子插入片段的上游蛋白BcSAP18和BcDEAR2。综上,本研究成功构建了不结球白菜酵母杂交cDNA文库并获得了BcFT启动子插入片段的互作蛋白,为进一步研究BcFT在不结球白菜开花中的调控机制奠定了基础。     

构建脱水反应元件（DRE）报告子以用于小叶杨DRE转录因子的克隆

许多诱导型基因的表达均受特定的转录因子和顺式元件调控，脱水反应元件（Dehydration-Responsive Element，DRE）对植物的抗旱和抗低温基因的表达调控具有重要作用。拟南芥等草本植物的特异性结合DRE转录因子已有所研究，但木本植物中能够特异性识别DRE的转录因子尚未见报道。酵母单杂交技术是发现序列特异性DRE结合转录因子的一种很有效的方法。而获得含有DRE顺式元件的报告酵母菌株是应用酵母单杂交技术研究树木来源的DRE结合转录因子的前提。本文通过基因合成构建含有DRE顺式元件的报告酵母菌株，初步研究表明该报告酵母菌株可以用于研究与寻找木本植物DRE结合转录因子，为通过基因工程手段改善树木抗逆性研究奠定了科学基础。     

酵母单杂交方法初步鉴定甘蔗SPSⅢ启动子区域调控序列

蔗糖磷酸合成酶(SPS,EC 2.4.1.14)是植物糖分积累的关键酶基因,在甘蔗中其家族成员SPSⅢ在成熟蔗茎中表达量高,是禾本科作物的特异成员.本研究应用酵母在甘蔗中单杂交系统,筛选SPSⅢ5’侧翼-1410～-1181 bp的光响应元件ATCT-motif和分生组织特异性元件CAT-box的调控序列,获得了54个含有cDNA片段的文库质粒,测序分析显示,14个cDNA序列为非重复性.NCBI的Blast同源性结果显示,除E1-3、E9-1和E0-3外,其余克隆都与甘蔗(Sacharum spp.)近缘物种的蛋白有很高的同源性,达到90％以上.通过SMART和SBASE,对推演的氨基酸序列进行蛋白质功能结构域预测与分析,显示编号为E0-3、E2-3、F2-1、F4-2和G8-2的5个克隆对应的氨基酸序列具有转录因子特征结构域.研究结果为分离调控SPSⅢ基因表达的转录因子提供了候选基因.     

腺病毒介导的秦川牛固醇调节元件结合蛋白2基因(SREBP2)过表达载体的构建与鉴定

固醇调节元件结合蛋白2（sterol regulatory element binding protein 2,SREBP2）属于碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链转录因子家族,在胆固醇的代谢过程中具有重要的调控作用。克隆秦川牛（Bos taurus）的SREBP2基因并构建相应腺病毒过表达载体,包装扩繁获得高滴度腺病毒,对于在细胞水平上研究SREBP2基因的功能和作用机制具有重要作用。本研究以秦川牛脂肪组织为实验材料,提取总RNA并反转录为cDNA,依据GenBank收录的牛的SREBP2基因（Accession No.NM₀01205600）mRNA序列设计引物,克隆出SREBP2基因编码区（coding sequence,CDS）全长。将SREBP2基因与穿梭载体连接构建pAdTrack-CMV-SREBP2表达载体,用PmeⅠ分别酶切线性化pAdTrack-CMV-SREBP2和空白对照pAdTrack-CMV载体并转化含有骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌（Escherichia coli）BJ5183感受态进行同源重组,得到腺病毒重组载体pAd-SREBP2和pAd-CMV,分别用PacⅠ酶切后胶回收DNA大片段,并将回收产物转染293A细胞包装得到腺病毒Ad-SREBP2和Ad-CMV,增殖并提高病毒滴度,得到高滴度病毒后,用绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）标记法测定显示Ad-SREBP2和Ad-CMV的病毒滴度分别为7×108和1.3×109GFU/mL。将Ad-SREBP2和Ad-CMV腺病毒侵染秦川牛前体脂肪细胞检测病毒的有效性,实时定量PCR检测结果显示,侵染48h时SREBP2基因的表达量提高了102.3倍。本研究成功克隆了秦川牛的SREBP2基因,构建了病毒重组体,包装增殖获得了高滴度病毒,为在细胞水平上基因功能的研究提供了基础资料。     

非生物胁迫诱导的棉花酵母双杂交文库构建及GhJAZ1互作蛋白筛选

非生物胁迫导致棉花生长发育受到抑制,严重影响棉花的产量和品质。为了深入探究棉花非生物逆境响应的分子作用机制并鉴定GhJAZ1的互作蛋白,本研究以陆地棉标准系TM-1为材料,采用Gateway重组技术构建了非生物胁迫诱导的陆地棉酵母双杂交cDNA文库,获得的初级文库总克隆数为1.2×10⁷ CFU,次级文库总克隆数为1.6×10⁷ CFU,重组阳性率100%,酵母文库滴度为5.0×10⁷ cells·mL^-1,酵母克隆平均插入片段>1 000 bp,符合建库标准,可用于后续酵母双杂交筛选。以GhJAZ1为诱饵,构建pGBKT7-GhJAZ1诱饵蛋白表达载体,经毒性检测及自激活活性检测,明确了诱饵质粒在酵母系统中无毒性和自激活活性,可直接用于酵母文库筛选。利用酵母双杂交筛选构建的非生物胁迫诱导的酵母cDNA文库,得到72个初筛阳性克隆,经测序、序列比对和酵母回转验证,获得11个与GhJAZ1相互作用的候选蛋白。选取其中4个候选蛋白,利用酵母双杂交进一步确认了GhJAZ1与候选蛋白的相互作用关系。本...     

海岛棉纤维均一化酵母双杂交文库的构建与GbTCP5互作蛋白的筛选

为探究转录因子在海岛棉纤维中的生物学功能,以海岛棉8个时期的纤维为研究对象,利用SMART技术合成ds-cDNA,经DSN进行均一化处理,构建以pGADT7为载体的海岛棉纤维均一化酵母cDNA文库,利用酵母双杂交系统筛选与海岛棉GbTCP5互作的蛋白。根据克隆得到的GbTCP5基因的CDS区设计含有NcoⅠ、EcoRI酶切位点的引物,构建诱饵载体pGBKT7- GbTCP5。经自激活和毒性检测后共转化酵母菌株Y2HGold,筛选与GbTCP5互作的蛋白。实时荧光定量PCR显示,GbTCP5基因在纤维发育起始期和伸长期的表达量较高,且在花瓣和花萼中的表达量高于其他组织。文库的质量检测显示,构建的均一化cDNA文库库容为9.15×10⁷ cfu·mL^-1,重组率为100%,插入片段大小在500~2 000 bp之间。诱饵载体pGBKT7-GbTCP5通过酵母双杂交系统多次筛选、回转验证,最终确定了4个互作的蛋白,分别是GbTCP20、GbTCP42、GbTCP45和GbAHP1蛋白。海岛棉纤维均一化cDNA文库的构建和筛选,为进一步研究海岛棉TCP转录因子及其互作蛋白在纤维发育时期中的作用机制奠定了基础。     

美洲商陆抗病毒蛋白真核表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达

摘要：从美洲商陆（Phytolacca americana）叶片中通过异硫氰酸胍法提取出了总RNA,经RT-PCR扩增出缺失突变型抗病毒蛋白PAP基因,将该基因克隆于分泌型真核表达载体pPIC9K,然后导入毕赤酵母(Pachia pastoris )菌株GS115细胞。在甲醇的诱导下,经过酵母高密度发酵进行PAP的表达,经SDS-PAGE分析。结果表明,在培养基上清液中含有一明显的特异性蛋白条带,大小为34 kD,经Western-blotting分析,该蛋白与法国PAP抗血清有特异性反应,体外活性检测表明该蛋白对病毒的侵染性具有高度的抑制性,表明该基因在毕赤酵母GS115中得到了表达。     

脱氢表雄酮(DHEA)对鸡胚原代肝细胞cAMP/PKA信号通路和cAMP反应元件结合蛋白(CREB)的影响与调节

控制肉鸡脂肪过多沉积是肉鸡生产中亟待解决的问题。脱氢表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)是人体分泌最为丰富的肾上腺类固醇激素,可经由类固醇激素受体介导发挥生理功能,降低机体生脂能力。本研究以鸡胚原代肝细胞为研究对象,选用含DHEA终浓度为0(对照)、0.01、0.1、1.0、10和100μmol/L的培养液孵育肝细胞20min后收集细胞,放射免疫测定法(RIA)检测胞内cAMP水平。结果发现,0.1～100μmol/L DHEA孵育肝细胞均可显著提高胞内cAMP水平(P<0.05),其中0.1μmol/L DHEA效果最为显著(P<0.01)。0.1μmol/L DHEA孵育肝细胞20min或1h后收集细胞,RIA法分别检测胞内腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC)和磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)活性,(γ-32P)ATP掺入法测定cAMP依赖性蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)活性,Western blot法测定cAMP反应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)磷酸化水平。结果显示,0.1μmol/L DHEA孵育肝细胞20min可显著降低胞内PDE活性(P<0.05),提高PKA活性(P<0.05),但对AC活性无显著性影响(P>0.05)。0.1μmol/L DHEA处理肝细胞1h可显著提高CREB蛋白磷酸化水平(P<0.05),且这种效应可被PKA抑制剂阻断(P>0.05)。本研究结果提示,DHEA调控肉鸡肝脏脂肪代谢,降低脂肪沉积的机制可能与激活胞内cAMP/PKA信号系统,活化转录因子CREB有关。     

葡萄糖和含腺苷分子通过碳水化合物反应元件结合蛋白(ChREBP)诱导猪脂肪细胞硫氧还蛋白互作蛋白(Txnip)的表达

硫氧还蛋白互作蛋白(Txnip)是一种氧化还原调节蛋白,通过与硫氧还蛋白结合抑制其活性,调节细胞的氧化还原状态,在葡萄糖和脂质稳态中起重要作用。本研究利用从3~7日龄仔猪(Sus scrofa)皮下脂肪组织分离培养的脂肪细胞,应用RNAi沉默碳水化合物反应元件结合蛋白基因(ChREBP)表达,以含0或0.1 mmol/L NAD+的葡萄糖浓度分别为0、5和15 mmol/L的培养液培养,采用实时荧光定量PCR检测Txnip及ChREBP mRNA表达,以探讨葡萄糖和含腺苷分子对猪脂肪细胞Txnip表达的影响及其转录调控途径。结果表明,葡萄糖以浓度依赖方式促进猪脂肪细胞Txnip和ChREBP mRNA表达,无糖条件下NAD+对Txnip mRNA表达没有明显影响,但葡萄糖存在时显著促进其表达。siRNA沉默脂肪细胞ChREBP表达后,葡萄糖对Txnip mRNA表达的促进作用比相同条件下培养的对照细胞有较大幅度降低;以NAD+处理后,Txnip表达在葡萄糖浓度为5和15 mmol/L时分别较对照细胞降低了91%和93%。由此说明,NAD+诱导猪脂肪细胞Txnip转录表达依赖于葡萄糖的参与,ChREBP介导葡萄糖和NAD+对Txnip mRNA表达的诱导作用。研究结果为进一步探讨ChREBP在葡萄糖和脂质稳态中的作用提供了基础。     

木薯SBEI基因片段克隆及块根特异性反义表达载体的构建

为了抑制木薯支链淀粉的合成,提高直链淀粉含量,改变木薯淀粉结构,培育工业用燃料酒精型木薯品种,本研究利用RT-PCR方法,用木薯块根cDNA克隆获得支链淀粉合成的关键酶基因SBEI的部分片段,对其进行序列分析表明与GenBank序列高度同源,同源性为99.22％;并以pBI121为基础,构建了以块根特异性表达启动子Sporamin驱动的SBEI基因反义结构的植物表达载体。     

SRBSDV侵染的白背飞虱中肠酵母双杂交cDNA文库的构建和分析

南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)成员,主要由白背飞虱(Sogatella furcifera,WBPH)以持久增殖型方式进行传播.在病毒的侵染循回过程中,白背飞虱中肠上皮细胞是病毒的初侵染和主要增殖场所.而病毒的有效增殖是决定介体能否传毒的关键影响因素.为了更好地研究SRBSDV和介体白背飞虱的互作关系,尤其是了解白背飞虱中肠蛋白通过参与调控病毒的增殖过程,而使介体昆虫成功获毒并传毒,本研究以高带毒白背飞虱群体中肠组织为实验材料,构建了高带毒白背飞虱群体中肠的酵母双杂交cDNA文库.经过检测表明,构建的文库滴度为1.5×106 cfu/mL,平均插入片段主要分布在1.0～2.0 kb之间,文库质量较好,可用于研究SRBSDV编码蛋白和白背飞虱中肠蛋白的互作关系,并为开展SRBSDV和昆虫介体的互作研究奠定了基础.     

苦瓜果实酵母双杂交文库构建及McRPF互作蛋白筛选

为研究苦瓜果实成熟的分子调控机制,以苦瓜自交系E12201-e1为材料,取不同成熟期苦瓜果肉组织等量混合,采用All-Direct方法构建酵母双杂交cDNA文库。经质量鉴定,该文库库容为1.25×10⁷ CFU,平均插入片段大于1 200 bp,阳性率为100%,文库质量较高,符合建库标准。同时,以苦瓜果实成熟关键调控因子McRPF为诱饵,构建诱饵表达载体pGBKT7-McRPF。经鉴定该诱饵蛋白无自激活活性。利用共转化法,从文库中筛选到29个初始阳性菌落,经过DNA测序和BLAST比对分析,最终筛选得到12个可能与McRPF互作的蛋白,为进一步探究McRPF调控苦瓜果实成熟的分子机制奠定了理论基础。     

可诱导剔除选择标记基因的pBLCK载体构建

为了剔除冗余且有潜在安全问题的选择标记基因,本研究通过PCR扩增出ubiquitin启动子序列、lox P序列、Cre-GR融合基因和NPTⅡ抗性基因的编码区序列,采用酶切连接的方法将其引入载体p BRACT806,从而构建一个新的可诱导剔除选择标记基因及重组酶基因的表达载体p BLCK,测序结果显示其构建成功。该载体含有Gateway组件,可进行外源目标基因的高效重组整合;具有NPTⅡ基因,利于转基因植株的筛选;具有可诱导剔除外源基因的Cre-GR组件,诱导处于lox P位点之间的抗性标记基因NPTⅡ和Cre-GR融合基因的剔除,保留目标基因表达元件。此外,目标基因、Cre-GR融合基因和NPTⅡ基因都由ubiquitin强启动子控制,可在农作物中组成型超量表达外源基因。本研究为农作物转基因安全性研究提供了新的载体系统,具有一定的育种价值。     

冬瓜实时荧光定量PCR内参基因的筛选与评价

为筛选适合冬瓜稳定表达的内参基因,以黑皮冬瓜低温、高温、干旱胁迫处理不同时间的叶片和正常处理不同组织为试验材料,利用RT-qPCR技术,结合GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件评价7个候选内参基因(28SrRNA、UBQ、RP Ⅱ、GAPDH、EF-1α、UBC21和TUA)稳定性。结果表明,7个候选内参基因在不同组织和不同胁迫处理下表达丰度及稳定性存在差异; EF-1α在低温胁迫处理下表达稳定性最好;UBQ和TUA在高温和干旱胁迫处理下表达稳定性最好; EF-1α 在不同组织中表达稳定性最好。本研究结果为冬瓜内参基因的选择提供了一定的理论参考。     

玉米基因组Fosmid文库构建及类受体激酶基因(Psy1和Psy2)筛选

玉米(Zea mays L.)病害的发生和流行是限制玉米高产稳产的重要因素。玉米细菌性褐斑病是目前具有潜在危害性的病害之一,在抗性基因遗传规律和染色体定位研究方面取得一定进展,但在基因克隆、功能鉴定等研究上进展较为缓慢,利用构建的Fosmid文库克隆抗病候选基因是目前较为快捷和有效的方法之一。本研究以玉米细菌性褐斑病的抗病自交系F349为材料构建了玉米Fosmid文库,克隆总数约为3.7×105个,平均插入片段长度为32 kb,实现4.73倍的玉米基因组覆盖,筛选到任意基因或序列的概率达到了99.12%。基于该文库,利用不同引物组合进行了两个类受体蛋白激酶基因(Psy1和Psy2)的克隆筛选,得到14个阳性克隆,其中4个阳性克隆包含Psy2基因和Psy1基因部分片段;3个阳性克隆包含完整Psy1基因;对其中两个阳性克隆13-12F-23和32-4A-6的测序结果显示,Psy1基因的启动子和内含子分别被插入了10.0和13.5 kb的外源片段;13.5 kb的插入片段是LTR家族的huck反转录转座子,10.0 kb的插入片段是含有helitron转座元件的复杂转座子;扩增到了Psy1基因的cDNA全长,说明这两种类型反转录转座子的插入并未使基因失活。本研究为玉米基因的克隆和功能分析提供了一种可行的研究途径。     

水稻白叶枯病菌GX1329基因组文库的构建及含编码TAL效应物基因的克隆的分离

由革兰氏阴性细菌水稻白叶枯病菌引起的水稻白叶枯病是亚洲、北美以及非洲部分地区最严重的水稻病害之一,水稻白叶枯病可使水稻减产高达50％以上。研究表明水稻白叶枯病菌的毒力主要依靠三型分泌系统所分泌的效应物。为了解水稻白叶枯病菌广西菌株GX1329中含有avrBs3／pthA家族基因的情况,本研究应用Alu I部分酶切其基因组DNA,构建了含有736个克隆的菌株GX1329的基因组文库。BamHI酶切分析随机挑取的15个文库克隆表明,克隆的外源DNA随机性良好,克隆的最小片段为27．7kb,最大为58．5kb,平均大小为39．9kb,文库克隆容量约为2．8×10^3Mb,该文库中包含基因组中任一个基因的概率为99．4％。利用来自水稻白叶枯病菌菲律宾菌株PX086的无毒基因avrXa10的第252位～第486位核苷酸序列作为探针,通过菌落原位杂交从GX1329基因组文库中筛选到37个含avrBs3／pthA家族基因的克隆。再通过Southern杂交分析,得到了17个独立克隆。这17个克隆中至少含有13个不同的avrBs3／pthA家族基因。这些基因在GX1329基因组中有的单独存在,有的两个或两个以上串联存在。本工作基本上明确了菌株GX1329基因组中avrBs3／pthA家族基因的数量,为进一步研究菌株GX1329中avrBs3／pthA家族基因的功能奠定了基础。