家蚕模式识别受体PGRP、βGRP编码基因的克隆鉴定及表达谱分析

模式识别受体(PRR)是生物体先天免疫系统中免疫受体的代表,对生物体的生存极为重要。克隆鉴定了家蚕的14个模式识别受体编码基因,包括10个肽聚糖识别蛋白(PGRP)基因和4个β-葡聚糖识别蛋白(βGRP)基因,并得到了BmPGRP-S3、BmPGRP-S4和BmPGRP-L5的完整编码序列。家蚕PGRP的长型和短型亚家族都具有典型的酰胺酶活性结构域,短型亚家族具有信号肽,长型亚家族则没有信号肽。5个PGRP长型亚家族基因成簇分布于第1号染色体;5个PGRP短型亚家族基因中有2个分布于第9号染色体,有3个分布于第16号染色体。家蚕βGRP家族成员都具有信号肽,其中BmβGRP1-3成簇分布于第11号染色体,编码蛋白不具有典型的葡聚糖结合结构域;BmβGRP4独立分布于第22号染色体,编码蛋白具有典型的葡聚糖结合结构域。基因芯片数据分析表明,BmPGRP-L5和BmβGRP1在5龄第3天幼虫各组织中没有表达,其余12个模式识别受体基因为多组织表达,但在丝腺组织中均无表达。在这12个模式识别受体基因中,BmPGRP-L3等6个模式识别受体基因在中肠组织中的表达水平偏高;BmβGRP3、BmβGRP4和BmPGRP-L3、BmPGRP-L4等在家蚕生殖腺中的表达水平较高。在生殖腺以外的其他各组织中,这12个基因的表达不具有雌雄差异性。BmβGRP1在家蚕各发育时期没有表达,BmPGRP-L5主要在变态发育的转折期表达,其余12个模式识别受体基因在各发育时期均有表达,并从5龄第3天幼虫到上蔟第2天有较高水平的表达,雌雄个体间无表达差异性。由此说明这些模式识别受体基因的表达具有一定的组织性和发育时期性。给人工饲料无菌饲养的家蚕5龄第3天幼虫分别添食大肠杆菌、家蚕黑胸败血菌和家蚕白僵菌,对免疫诱导3、6、12和24h的家蚕进行个体水平的实时荧光定量PCR检测,发现PGRP长型亚家族基因BmPGRP-L1、BmPGRP-L3和短型亚家族基因BmPGRP-S1-3均能被这3种微生物诱导上调表达;βGRP基因家族中的BmβGRP3、BmβGRP4也能被3种微生物诱导上调表达。同时对诱导12h时家蚕各组织中14个家蚕模式识别受体基因的表达谱进行分析,结果显示经3种微生物分别诱导后,家蚕头部组织中BmβGRP2、BmβGRP4、BmPGRP-L2和BmPGRP-S1、BmPGRP-S3-5均上调表达;表皮、中肠和脂肪体中仅有BmβGRP3、BmPGRP-L4等少数模式识别受体基因上调表达。     

Hippo信号通路对家蚕体壁发育和细胞增殖的调控

Hippo信号通路最早是在果蝇中发现的,在组织器官的发育调控中起重要作用,信号通路中的一些基因还被鉴定为肿瘤抑制基因。这个信号通路在果蝇和小鼠中得到广泛关注,但是在家蚕中关注甚少。西南大学的LIN等人在家蚕中鉴定了Hippo信号通路的主要相关基因(Hippo,Salvador,Warts,Mats,Yorkie)并命名为BmHpo,BmSav,BmWts,BmMats,Bm Yki。这些基因在家蚕和其他生物中高度保守,说明它们通过相似的蛋白质相互作用建立Hippo信号通路。研究中分析了这些基因在家蚕胚胎,幼虫、游走期、蛹期及蛾期的时期表达模式,以及在幼虫5龄3天的14个组织中的组织表达情况。研究结果表明Hippo信号通路对家蚕的发育是有影响的。为了了解Hippo信号通路调控家蚕发育的分子机制,作者在家蚕卵巢细胞系(BmN-SWU1,NS)中分别上调和下调表达了BmHpo和BmYki基因,发现细胞增殖活性和细胞周期发生了改变。该研究发现Hippo信号通路的基因在家蚕表皮发育及细胞增殖方面有重要作用。     

BmMP54基因在家蚕组织的表达模式及与BmNPV多角体蛋白基因的融合表达分析

从家蚕蛹c DNA文库中筛选到一个403 bp的未知功能基因,将其命名为Bm MP54(Gen Bank登录号:DY231399.1)。该基因序列包含312 bp的开放阅读框,编码由103个氨基酸残基组成的蛋白质,生物信息学预测其含有2个跨膜区域,等电点及分子质量分别为9.90和10.463 k D。将Bm MP54与家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)的多角体蛋白基因(Polh)融合后分别连接到原核表达载体p GEX-4T-1和家蚕杆状病毒表达系统转移载体p Fast BacTMHTB中构建重组质粒,并分别在大肠埃希菌BL21(DE3)和家蚕卵巢培养细胞(Bm N)中表达。原核表达的融合蛋白通过调节p H值、阴离子交换层析等纯化获得了65 k D的重组融合蛋白Polh-Bm MP54,通过Western blotting可在重组杆状病毒感染的Bm N细胞中检测到42 k D左右的Bm MP54重组蛋白,表明已按设计要求高效表达并纯化获得目的蛋白质。实时荧光定量PCR分析显示Bm MP54在家蚕5龄幼虫的气门和脂肪体组织中表达量最高,在表皮和头部的表达量最低。上述研究结果有利于后续探讨Bm MP54在家蚕生长发育过程中的生物学功能。     

家蚕模式识别受体βGRP4的序列分析及诱导表达

β-葡聚糖识别蛋白(βGRP)属于模式识别受体(PRR),很多无脊椎动物的βGRP具有结合β-1,3-葡聚糖的能力,在识别入侵病原物和激活免疫调控途径中起着重要作用。对克隆的家蚕βGRP4(BmβGRP4,GenBank登录号为:GQ372969)及编码蛋白进行序列分析和诱导表达,探讨其参与免疫应答的作用方式。BmβGRP4的开放阅读框(ORF)长1 128 bp,编码375个氨基酸,具有一个由17个氨基酸组成的信号肽,预测成熟体蛋白分子质量为40.3 kD,等电点为6.5。BmβGRP4含有一个糖苷水解酶活性结构域(Glyco_hydro_16),具有结合β-1,3-葡聚糖的能力。将BmβGRP4亚克隆到p28载体进行原核表达,获得带有His标签的重组蛋白。给家蚕5龄第3天幼虫分别以1×109个/头的剂量添食大肠杆菌、家蚕黑胸败血菌和家蚕白僵菌,对免疫诱导18 h后家蚕体内的BmβGRP4表达水平进行Western blotting分析,结果表明BmβGRP4能被上述3种微生物诱导而产生较强的表达活性。研究结果提示BmβGRP4可能在家蚕先天免疫应答反应中通过识别病原微生物表面的相关分子模式而发挥作用。     

家蚕Met1基因的表达与组织定位分析

选择家蚕基因组中与果蝇Dm Met(Methoprene tolerant protein)同源的基因Bm Met1进行研究。预测Dm Met和Bm Met1的结构域均是一个b HLH-PAS(basic helix-loop-helix Per-ARNT-SIM)型转录因子,具有典型的DNA结合结构域。在原核系统表达获得了Bm Met1蛋白并制备了抗体。qRT-PCR和Western blotting检测结果显示,无论是Bm Met1基因mRNA的转录还是Bm Met1蛋白的表达,在家蚕5龄中后期和吐丝期的翅原基组织中都呈现较高水平,而在蛹期呈现较低的水平。通过免疫组织化学方法分析Bm Met1的组织定位,结果显示该蛋白质在5龄第6天和吐丝期家蚕胸节表皮、脂肪体及翅原基等组织中都有较高水平的表达,在蛹期上述部位和组织的表达水平较低。分别将蜕皮激素(20E)和保幼激素类似物(Methoprene)按照2μg/头的剂量注射到5龄第3天幼虫第2~3胸节间,qRT-PCR检测幼虫翅原基组织中的Bm Met1受到Methoprene的诱导上调表达,且在处理2 h后表达水平最高。上述结果暗示Bm Met1可能参与了保幼激素对家蚕翅原基生长分化的调控。     

家蚕蜕皮激素22激酶2(BmEcK2)的序列及基因表达特征分析

前期研究发现在感染家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrovirus,Bm CPV)的家蚕幼虫中肠中,有一个下调表达的差异蛋白可能参与了家蚕对Bm CPV感染的抵抗过程。利用Blastp进行同源性比对的结果显示,该蛋白质与尺蠖(Operophtera brumata)的未知蛋白质OBRU01_04785和蜕皮激素22激酶(Ecdysteroid 22-kinase)的序列相似度分别为51%、49%,进一步通过多序列比对和系统进化分析发现该蛋白质与Ecdysteroid 22-kinase蛋白的亲缘关系最近,属于蜕皮激素激酶超家族;该蛋白质与家蚕中已知的蜕皮激素22激酶1(Bm Ec K1)的序列相似度为24.4%,因此将其命名为Bm Ec K2。实时荧光定量PCR检测Bm Ec K2基因m RNA在家蚕5龄幼虫中肠组织中的转录水平最高,其次是马氏管、丝腺和卵巢,而在血淋巴、头部、精巢、脂肪体中几乎检测不到转录;家蚕5龄起蚕感染Bm CPV后24、48、72 h,中肠中Bm Ec K2基因m RNA的转录水平下调,分别是对照组家蚕中肠的0.32、0.45和0.21倍。研究结果初步提示,Bm CPV感染导致家蚕中肠中的Bm Ec K2下调表达,进而可能影响到家蚕体内激素调节水平的变化。     

家蚕核型多角体病毒基因bm64的表达及定位分析

对家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)功能未知基因的研究,有利于全面揭示病毒的复制和感染机制。依据NCBI数据库发表的Bm NPV T3株基因组序列(Gen Bank登录号:L33180.1),选择未知功能基因bm64进行生物信息学分析,该基因ORF全长333 bp,编码110个氨基酸,预测蛋白质分子质量为12.71 k D,等电点4.21。将Bm64蛋白亲水区1~49 aa的编码序列与原核表达载体p GEX-4T-3连接,构建重组表达质粒,转化E.coli Rosetta菌株后进行诱导表达。SDS-PAGE检测在预测分子质量处有明显的蛋白质条带,纯化该蛋白质并以此为抗原免疫新西兰大白兔,制备Bm64蛋白多克隆抗体。在病毒感染Bm N细胞后24 h即可用Western blot方法检测到Bm64蛋白的表达。通过间接免疫荧光检测到Bm64蛋白在Bm NPV感染的Bm N细胞中表达,并定位于细胞核。研究结果为进一步分析家蚕核型多角体病毒bm64基因的功能奠定了实验基础。     

家蚕ML家族基因的鉴定及病原诱导表达特征

MD-2相关脂类识别蛋白(MD-2-related lipid-recognition,ML)家族是一类广泛分布于动物、植物和真菌的含有ML单一结构域的蛋白家族,在先天免疫、脂类识别及代谢过程中发挥重要作用。通过同源检索在家蚕基因组数据库中比对获得4个ML家族成员基因,包括BmNPC2、BmML-1、BmML-2和BmEr-16,克隆其cDNA序列,生物信息学分析表明家蚕ML家族蛋白具有典型的ML结构域和信号肽,并至少含有4个保守的半胱氨酸残基。系统进化分析显示BmNPC2与黑脉金斑蝶的Promoting以及烟草天蛾的MsML-1亲缘关系较近,BmML-2、BmEr-16以及BmML-1与果蝇的NPC2家族蛋白亲缘关系较近。qRT-PCR结果显示ML家族基因在家蚕各组织中均有转录,其中在脂肪体和马氏管中的表达量相对较高。将大肠埃希菌以及球孢白僵菌、黑胸败血芽孢杆菌、核型多角体病毒和家蚕微孢子虫等家蚕病原通过注射或添食家蚕5龄幼虫进行免疫诱导,qRT-PCR结果显示家蚕ML家族成员在不同病原诱导之后均有不同程度的上调表达,推测ML家族成员可能参与到宿主对入侵病原物的免疫过程。     

化学感受蛋白家族基因在家蚕5龄幼虫表皮中的表达分析

化学感受蛋白(chemosensory protein,CSPs)在昆虫的免疫反应、生长发育及信号传递过程中起重要作用。以耐高温家蚕品种为材料,研究高温饲养环境下,作为家蚕物理屏障及感觉器官的表皮中化学感受蛋白基因的表达变化。依据从家蚕基因组数据库获得的15个家蚕CSPs基因(Bm CSPs)的序列设计引物,通过RT-PCR检测正常饲育温度(28℃±0.5℃)下,Bm CSP1、Bm CSP4、Bm CSP6、Bm CSP7、Bm CSP8、Bm CSP9、Bm CSP11和Bm CSP15等8个基因在家蚕5龄第2天幼虫的表皮中有表达;通过半定量RT-PCR和qRT-PCR检测在高温(35℃±0.5℃)饲育环境下,5龄第2天幼虫表皮中Bm CSP8和Bm CSP15的表达水平显著上调,其他6个Bm CSPs基因的表达水平未见显著变化。初步推测Bm CSP8和Bm CSP15可能与家蚕幼虫对高温环境的应激反应有关。     

家蚕微孢子虫表面蛋白NBO_33g0013的序列特征及亚细胞定位与功能分析

选择家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)表面蛋白质谱数据库中新发现的假定表面蛋白NBO_33g0013进行研究,了解该蛋白质的功能及是否参与微孢子虫对宿主细胞的侵染过程。预测该蛋白质分子质量为26.1 k D,等电点为4.59,其序列N端具有信号肽,无跨膜螺旋结构,含3个N-糖基化位点,无O-糖基化位点,不具有典型的功能结构域,与柑橘凤蝶微孢子虫(Papilio xuthus)的一个假定蛋白序列相似度达到93%。以家蚕微孢子虫CQ1分离株的基因组DNA为模板克隆该蛋白质的编码基因,构建重组表达载体进行该蛋白质的原核表达,并制备获得多克隆抗体,通过间接免疫荧光分析确证该蛋白质定位在家蚕微孢子虫孢子表面。经体外细胞感染实验初步分析,尚未发现该蛋白质参与了微孢子虫孢子对宿主Bm E细胞的粘附过程,推测该蛋白质可能为家蚕微孢子虫孢壁的结构组成型蛋白质,在孢壁的构架形成中发挥作用。     

家蚕组织蛋白酶L及其特异性抑制剂基因参与微生物诱导蚕体的免疫响应研究

给家蚕5龄第3天幼虫分别注射藤黄微球菌(革兰阳性菌)和球孢白僵菌(真菌)进行诱导处理,利用已登录的家蚕组织蛋白酶L基因Bm Cts L(Gen Bank登录号:S77508.1)和Bm Cts L特异性抑制剂基因Bm Cts LI(Gen Bank登录号:AJ131752)的全长序列设计引物,实时荧光定量PCR检测微生物入侵后家蚕组织中Bm Cts L和Bm Cts LI基因的时空表达变化及协同反应,分析Bm Cts L酶活性变化与家蚕对微生物入侵免疫响应的相关性。家蚕的血细胞与脂肪体是微生物入侵后Bm Cts L和Bm CtsLI基因出现表达变化的主要组织,其中经藤黄微球菌诱导后,血细胞中的Bm Cts L基因响应最快,且基因mRNA转录水平极显著上调,脂肪体中的Bm Cts LI基因mRNA转录水平也极显著上调。微生物入侵后蚕体组织中Bm Cts L与Bm Cts LI基因的表达变化存在时间差异,其中Bm Cts L基因先于Bm Cts LI基因上调表达,推测Bm Cts LI基因通过对微生物入侵的协同反应调控BmCts L酶活性变化。藤黄微球菌比球孢白僵菌能更快诱导Bm Cts L和Bm Cts LI基因的表达变化;2种微生物诱导下蚕体血细胞中的Bm Cts L酶活性不仅上升快,而且明显高于其他组织。上述结果提示Bm Cts L和Bm Cts LI可能与家蚕的先天免疫相关,并且佐证了家蚕的血细胞在微生物入侵后能比其他组织更快速地产生免疫响应。     

家蚕铁蛋白Ferritin家族基因的鉴定及序列特征与表达谱分析

机体内的铁蛋白Ferritin能存储和释放铁离子,在调节细胞的铁离子平衡中发挥重要作用。采用生物信息学方法分析家蚕基因组中Ferritin基因家族成员Bm Fer1、Bm Fer2、Bm Fer3和Bm Fer4的序列特征,并通过转录组芯片数据和实时定量PCR分析其时空表达谱,为研究蚕体内的铁元素代谢机制提供基础数据。Bm Fer1、Bm Fer2、Bm Fer3具有Ferritin蛋白家族典型的5个α螺旋结构,但铁离子结合位点的种类和数量相对较少。Bm Fer1和Bm Fer3为线粒体铁蛋白,具有O糖基化位点;Bm Fer2和Bm Fer4为细胞质铁蛋白,具有N糖基化位点。Bm Fer1、Bm Fer4为重链型铁蛋白,具有典型的亚铁氧化酶活性中心,在系统进化上与代表物种的重链型铁蛋白聚为一支;而Bm Fer2为轻链型铁蛋白,无亚铁氧化酶活性中心,聚类于轻链型分支。转录组芯片数据表明,家蚕5龄幼虫中肠中Bm Fer1、Bm Fer2的表达量明显高于其他各组织,而且在头部、脂肪体、血细胞、马氏管中的表达量是Bm Fer1的平均值高于Bm Fer2。在家蚕幼虫5龄4 d至蛾期的发育过程中,Bm Fer1和Bm Fer2的表达量均明显上调,尤以上蔟后期发育至蛾期的上调最为明显。实时定量PCR分析显示,Bm Fer1和Bm Fer2在家蚕5龄幼虫丝腺组织的表达量明显高于其他组织。Western blotting分析发现Bm Fer2在家蚕胚胎细胞中有表达,并在催青后的蚕卵中上调表达,推测Bm Fer2基因在家蚕早期胚胎发育中已开始转录、表达行使其功能。     

家蚕AGO2蛋白的单克隆抗体制备

Argonaute(AGO)蛋白家族在小RNA诱导的基因沉默中发挥重要作用。基于家蚕基因组测序发现的AGO蛋白编码序列,选择Bm AGO2为目标蛋白质,制备该蛋白质的单克隆抗体,为进一步研究其介导的miRNA靶基因以及基因调控网络奠定试验基础。通过分析Bm AGO2蛋白的抗原性分布,筛选出Bm AGO2抗原表位区aAGO2,设计引物扩增目的片段,构建重组表达载体p ColdⅡ-aAGO2原核表达aAGO2蛋白,以纯化后的aAGO2蛋白免疫BALB/c小鼠。剖取免疫小鼠脾脏,将脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0融合。以HAT选择培养基及间接ELISA法筛选阳性克隆,经Western blotting和免疫沉淀检测,获得2株生长状态好、能分泌高效价抗体的单克隆杂交瘤细胞株I5-A9和E1-3。经抗体亚型检测后,选择细胞株I5-A9进行大量培养,菌液注射小鼠腹腔制备的腹水经辛酸-硫酸铵沉淀及Protein A/G亲和层析纯化,获得了纯度较高的Bm AGO2单克隆抗体。利用获得的抗体免疫共沉淀家蚕卵巢培养细胞Bm N以及家蚕5龄幼虫的内源Bm AGO2蛋白,从分离的结合RNA检测到小RNA被显著富集,表明成功制备了可用于免疫共沉淀的Bm AGO2单克隆抗体并分离BmAGO2结合的RNA。     

家蚕保幼激素信号途径中转录因子BmKr-h1的基因克隆与表达分析

Krüppel homolog 1(Kr-h1)是含有C2H2锌指结构的转录因子,在昆虫变态发育中起重要作用。从家蚕5龄第3天幼虫的表皮中克隆了Bm Kr-h1基因,该基因全长c DNA为1 918 bp,其中开放阅读框1 047 bp,GC含量42.2%,编码348个氨基酸。氨基酸序列比对分析发现大部分昆虫物种的Kr-h1都含有8个锌指结构,暗示该蛋白质的功能具有一定的保守性。通过生物信息学方法预测Bm Kr-h1不含信号肽和糖基化位点,但含有19个可能的磷酸化位点,暗示其活性可能受到磷酸化和去磷酸化修饰的影响。利用原核表达系统表达获得了可溶的Bm Kr-h1蛋白并制备了抗体。Western blot和半定量RT-PCR检测的结果显示,不论在mRNA水平还是蛋白质水平,Bm Kr-h1在家蚕幼虫5龄初期和吐丝期的翅原基都有较高水平表达,而在蛹期的表达量较低。用保幼激素(JH)类似物Methoprene和蜕皮激素(20E)分别注射家蚕5龄第3天幼虫,发现2种激素均能诱导蚕体内Bm Kr-h1的表达上调。免疫组织化学结果显示,Bm Kr-h1在5龄第3天幼虫各组织中的表达量很低,而在吐丝期的中肠、脂肪体和表皮中都有一定水平的表达,暗示其可能参与家蚕蜕皮变态的过程。上述结果表明Bm Kr-h1可以响应JH和20E的诱导,提示其在家蚕的变态发育中发挥作用。     

家蚕C型凝集素16基因(BmCTL 16)的电子克隆及序列特征和表达谱

C型凝集素是在动物先天免疫中发挥重要作用的模式识别受体。从家蚕杂交一代超亲表达的基因中筛选出一个C型凝集素16基因(Bm CTL 16),通过电子克隆、序列拼接获得了总长度为1 105 bp的序列,其5'端和3'端分别为63 bp、385 bp,预测ORF为657 bp,在3'端终止密码子下游314 bp位置为加尾信号胞质多聚腺苷化特异因子(CPSF)结合位点。预测Bm CTL16编码218个氨基酸,组成蛋白质的氨基酸有20种,数量最多的是亮氨酸(有19个),蛋白质理论等电点(p I)6.65,分子质量25.124 4 k D。Scan Prosite结构域预测Bm CTL 16存在与其它鳞翅目昆虫CTL一样保守的糖蛋白识别位点CRD。系统进化分析表明Bm CTL 16与烟芽夜蛾、小菜蛾、刺舌蝇、埃及伊蚊的同源CTL序列相似度均高达99%。对电子拼接序列进行RT-PCR验证,扩增片段的测序结果与电子克隆的Bm CTL 16序列完全一致。qRT-PCR分析Bm CTL 16在5龄第1~2天幼虫中肠组织中的表达量较高,之后呈现下降趋势,推测可能是家蚕5龄初期旺盛的生命活动提高了蚕体免疫功能。     

家蚕bmo-miR-217对核型多角体病毒(BmNPV)lef-1基因表达的调控作用

昆虫的单链小分子RNA(microRNAs)不仅通过与自身的靶基因互补进行转录后水平调控,从而参与重要的生命过程,并且还可以与病原体靶基因相互作用,在免疫防御方面发挥重要功能。给家蚕5龄眠起幼虫接种家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)后72 h,收集蚕体血淋巴提取总RNA用于高通量测序,经克隆验证获得一条由Bm NPV诱导上调表达的家蚕miRNA(bmo-miR-217),用生物信息学方法预测到bmo-miR-217对应的一个病毒靶基因为lef-1。构建bmo-miR-217及Bm NPV lef-1 3'-UTR的表达载体,并共转染家蚕卵巢培养细胞Bm N,于48 h后通过检测细胞的双荧光素酶相对活性,显示出bmo-miR-217可显著下调Bm NPV lef-1基因的表达(P0.05)。已知lef-1是Bm NPV侵染复制的必需基因之一,因此抑制其表达是家蚕先天免疫的一种有效策略。     

BmATG5蛋白作为分子开关调控家蚕细胞自噬和凋亡关系的研究进展

细胞自噬(autophagy)和凋亡(apoptosis)是昆虫蜕皮与变态发育过程中细胞死亡最主要的2种方式。家蚕(Bombyx mori)是鳞翅目的模式昆虫之一,有关细胞自噬和凋亡的研究也比较深入,包括细胞自噬和凋亡的形态特征、诱导信号和通路、对蚕体发育的影响、自噬相关蛋白的鉴定和功能等。前期研究揭示家蚕自噬相关蛋白Bm ATG5和Bm ATG6具有自噬与凋亡的分子开关功能,但它们调控细胞凋亡的具体机制至今不详。本文在简要综述昆虫及家蚕细胞自噬和凋亡研究的基础上,重点介绍了Bm ATG5调控细胞凋亡分子机制研究的最新进展,为深入揭示Bm ATG5的分子调控功能,以及其应用于鳞翅目害虫防治和家蚕变态发育调控的研究提供参考依据。     

LPS诱导的奶牛蹄真皮细胞基因表达谱变化分析

通过转录组学测序技术,分析LPS诱导的奶牛蹄真皮细胞基因表达谱变化,筛选差异基因并进行生物信息学分析,为从细胞和分子水平上研究奶牛蹄叶炎提供必要的依据。结果显示,10 mg/L LPS作用24 h是诱导细胞模型的最佳条件。转录组测序结果显示,LPS作用前后,共有2 194个基因的表达水平发生变化,其中上调基因1 138个,下调基因1 056个。经过GO功能富集分析和KEGG代谢通路富集分析,发现差异基因主要富集于TNF、PI3K-Akt和MAPK信号通路等与免疫反应、炎症反应相关的通路中,推测LPS主要通过激活蹄真皮细胞相关炎性通路,诱导炎症介质的产生,从而导致奶牛蹄真皮细胞炎性损伤。     

家蚕核型多角体病毒编码miR-364对DNA聚合酶基因表达的调控作用研究

MicroRNA(miRNA)在调控病毒与宿主相互作用方面起着重要作用。为了研究家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)编码的miRNA对其自身靶基因的调控作用,通过高通量测序得到Bm NPV编码的一条miRNA——Bm NPV-miR-364,利用在线靶基因预测程序RNAhybrid与RNA22预测Bm NPV基因组中有6个基因可能是Bm NPV-miR-364的靶基因。分别构建Bm NPVmiR-364与6个侯选靶基因3'-UTR的表达载体,共转染Bm N细胞后检测其双荧光素酶活性,结果表明Bm NPV-miR-364对Bm NPV DNA聚合酶(DNA polymerase)基因的抑制作用显著(P0.05),对其余5个靶基因的抑制作用不显著。进一步采用Bm NPV-miR-364 mimic与Bm NPV-miR-364 inhibitor分别进行过表达和缺失表达分析,显示Bm NPV-miR-364 mimic能显著抑制DNA polymerase基因的表达,而Bm NPV-miR-364 inhibitor能显著解除Bm NPV-miR-364对DNA polymerase基因的抑制作用。将Bm NPV-miR-364与DNA polymerase基因的表达载体共转染Bm N细胞,qRT-PCR分析发现实验组细胞中病毒DNA polymerase基因的表达水平显著低于对照组。qRT-PCR检测家蚕经口接种Bm NPV后24 h内,血淋巴中Bm NPV-miR-364和病毒DNA polymerase基因的表达量很低,但在24 h之后表达量急剧上升。研究结果提示:Bm NPV编码的miR-364可以靶向抑制自身复制过程中的重要酶基因,调节DNA的复制。     

家蚕热激蛋白HSP90的鉴定、进化与表达模式

热激蛋白90是一类广泛分布与各类生物体中、高度保守的分子伴侣。HSP90s具有帮助受损蛋白的转运、折叠,防止聚集并恢复其正常构象等功能。昆虫HSP90s与生长发育、滞育和杀虫剂抗性等均相关。本研究在全基因组水平对家蚕HSP90s进行了鉴定,共分析获得3个基因(BGIBMGA004612、BGIBMGA012753和BGIBMGA001241)。根据系统发生分析,对家蚕HSP90s分别命名为Bm HSP90A1、Bm HSP90B1和Bm Trap1,它们分属于3个亚家族。家蚕与黑腹果蝇HSP90s直系同源基因的蛋白序列一致性均在60%以上。与其他物种HSP90s一样,家蚕HSP90s含有N-端ATPase结构域,4个特征性序列。基于组织和发育时期芯片及表达序列标签,发现家蚕HSP90s基因均有表达。基于芯片数据,Bm HSP90A1在雌雄间具有非常相似的表达模式,而Bm Trap1在5龄幼虫精巢中的信号值高达16 082.5,暗示着该基因可能与精巢发育相关。HSP90s作为一类功能广泛的分子伴侣,本研究将为其功能研究奠定基础。