禽呼肠孤病毒RT-RPA-LFD快速检测方法的研发

禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)主要感染鸡和火鸡，引起关节炎、腱鞘炎等症状。为满足疾病早期快速诊断的需求，建立一套应用重组聚合酶核酸等温扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)检测ARV的方法，使用侧向流动免疫试纸条(lateral flow dipstick,LFD)观测结果。首先针对ARV较为保守的片段M1基因设计数套引物，使用普通RT-PCR筛选出一套无非特异条带、敏感性优良的引物组建立ARV RT-RPA-LFD反应体系，优化探针浓度和反应温度，使用建立的反应体系进行特异性和敏感性试验，最后以最低检测模板浓度优化反应时间。结果显示，建立的ARV RT-RPA-LFD反应体系在探针工作浓度为0.12 mmol/L,37℃条件下反应20 min，可最低检测到1.5×10¹ copies/反应的ARV RNA，并且不与其他常见禽病原体核酸发生反应。使用建立的方法检测40份临床病料，发现有3份ARV阳性，与之前本实验室建立的二重qRT-PCR检测结果一致。结果表明，本研究建立的ARV RT-R...     

禽呼肠孤病毒检测方法研究进展

禽呼肠孤病毒(avian reovirus, ARV)主要引起家禽病毒性关节炎和免疫抑制,进而导致继发感染。近年来,随着ARV及其变异毒株的出现,加之传统疫苗对变异株的保护力不足,且没有特效药物治疗,使我国禽养殖业面临ARV感染的巨大风险。目前禽养殖场主要通过严格的生产管理结合周期性检测对禽呼肠孤病毒病进行防控。因此,本文着重介绍并分析了国内外已报道的ARV检测方法,为ARV的监测及新型诊断技术的研发提供依据,同时也为疫病的防控提供参考。     

反转录聚合酶链反应和核酸探针检测禽呼肠孤病毒研究的概述

根据禽呼肠孤病毒(ARV)参考毒株S1133S1基因序列，设计合成4对引物而分别建立了RT-PCR、半套式PCR和一步法PCR三种用于检测ARV的方法。它们能检测到的最近ARVRNA量分别为1pg、1fg和0．16ngRNA；研制出禽呼肠孤病毒地高辛核酸探针，并建立了地高辛核酸探针检测ARV的方法，该核酸探针最低能检测到0．45ng的ARVRNA；对广西部分鸡场血清学调查表明，ARV平均阳性率为27％；对广西ARV野毒株进行了分离和鉴定，并对获得的2个地方分离株的S1基因片段进行测序及分析，两分离株与标准株S1133的同源性分别为98．5％和98．3％；用所建立的RT-PCR和地高辛核酸探针方法对用ARV人工感染鸡采集的各种样品的检测，并和传统病原分离方法进行比较，结果RT-PCR检出率为92．5％(222／240)，地高辛核酸探针检出率为74．2％(178／240)，病原分离鉴定方法检出率为55％(132／240)。用ARV强毒分别对免疫种鸡后代和无母源抗体或SPF的雏鸡进行攻毒试验，结果油苗免疫的种鸡后代对本病有很强的抵抗力，能抵抗ARV强毒的攻击，其平均保护率90．8％(109／120)。而无母源抗体或SPF的雏鸡攻毒后均100％(240／240)死亡。     

二重荧光RT-LAMP鉴别检测禽呼肠孤病毒和鸡滑液囊支原体

本研究旨在建立一套通过添加荧光探针FD,反应后可使用成像仪直接观测结果的鉴别检测禽呼肠孤病毒(ARV)和鸡滑液囊支原体(MS)的二重荧光RT-LAMP检测方法。根据ARV和MS的保守基因片段，设计了2套LAMP引物，并各添加1条FD荧光探针，2条FD探针分别标记CY5和6-FAM荧光基团。结果：ARV阳性对照在成像仪下发出红色荧光，MS阳性对照发出绿色荧光，双重模板经过图像融合后为黄色荧光；特异性结果显示，该二重荧光RT-LAMP检测方法仅能扩增ARV和MS两种病原，对其他常见病原如鸡毒支原体(MG)、禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)等无扩增反应；敏感性结果显示，该二重荧光RT-LAMP检测方法对ARV和MS的最低检测量分别为1.7×10² copies和1.9×10² copies;使用该方法检测40份临床样品，检出率与本实验室前期建立的二重荧光RT-PCR检测结果相同。综上，该二重荧光RT-LAMP检测方法可特异、敏感地鉴别检测ARV和MS,通过添加FD荧光探针和成像仪观测结果，为不同条件的实验室提供了新的检测手段。     

鸡呼肠孤病毒流行情况、鉴别诊断和防控

鸡病毒性关节炎（Viral Arthritis）给养鸡业造成了严重的经济损失，其主要病毒性病原是禽呼肠孤病毒（Avian orthoreovirus, ARV）。ARV属分节段的RNA病毒，易发生基因变异或重组产生新毒株。近年来，鸡病毒性关节炎频发，新型毒株不断产生，呈现了新的流行趋势。本文从ARV流行情况、鉴别诊断与防控等方面进行综述，以期为研究和防控禽呼肠孤病毒病提供一定的参考。     

鸡滑液囊支原体和禽呼肠病毒的实时荧光定量PCR快速检测

根据禽呼肠病毒σC和鸡滑液囊支原体vlhA基因的保守序列,分别设计了特异性引物和不同荧光基团标记的TaqMan探针,优化反应条件,建立能同时鉴别诊断鸡滑液囊支原体和禽呼肠病毒(ARV)的检测方法。结果表明,该方法能够特异地鉴别检测ARV和MS,与其他病原体无交叉反应,检测敏感性均可达到2×10拷贝数。此外,该方法抗干扰能力强,具有良好而稳定的准确性,临床样品检出率与传统检测方法相符。因此,该基于TaqMan探针建立的荧光定量PCR具有特异、灵敏、准确、实时、重复性好等优点,不仅可用于鸡群中这两种病原体的鉴别检测和疫病监测,也有利于这两种病原体感染的有效防控。     

禽呼肠孤病毒在我国部分地区蛋鸡群中的血清流行率和风险因素分析

禽呼肠孤病毒(ARV)在我国流行范围较广,感染家禽后使其出现病毒性关节炎、生长不良和产蛋量下降等表现,对我国养禽业造成较严重的经济损失。为了解我国蛋鸡群中ARV的流行情况及存在的感染风险因素,本试验在2022年11月—2023年3月从北京、天津、河北、山东、河南、江苏、陕西、湖北和重庆9个省市的45个蛋鸡养殖场(其中包括祖代蛋鸡群、父母代蛋鸡群和商品代蛋鸡群),收集共计45份调查问卷和968份血清样本。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中的ARV抗体,并结合调查问卷,采用单因素分析和逻辑回归分析方法找到蛋鸡出现ARV感染症状的风险因素。ELISA检测结果显示,968份血清样本中检出阳性863份,阳性率为89.15%(95%CI:87.0%～91.0%);单因素分析结果显示,全进全出饲养模式下的蛋鸡出现ARV感染症状的概率显著低于区域性全进全出饲养模式或不同日龄、不同批次混养饲养模式下的蛋鸡,且具有较强程度的关联(P<0.05,0.1相似文献   

家禽致病性大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验

家禽大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的，可引起严重的腹泻和败血症。初生仔禽十分易感，常发生严重腹泻和败血症。家禽的大肠杆菌病一年四季均可发生，各种年龄和性别都易感，但主要发生于1-4月龄的仔禽。2007年4月莱阳某养禽场送检病死禽，根据剖检结果，疑似大肠杆菌病，并进行了一系列实验室诊断。     

禽呼肠孤病毒病疫苗的研究进展

禽呼肠孤病毒(Avian reovirus,ARV)是目前严重危害养禽业发展的一种病原微生物,其引起的禽呼肠孤病毒病在全球各地的家禽养殖场广泛流行.近年来,ARV在我国养禽业的感染率呈逐渐上升趋势,给我国养禽业造成了重大的经济损失.安全、高效的疫苗是有效预防禽呼肠孤病毒病的重要手段.文章综述了国内外禽呼肠孤病毒病弱毒疫...     

两种非放射性标记探针在马立克氏病毒检测上的应用

两种非放射性标记探针在马立克氏病毒检测上的应用李光富，钱建飞，陈溥言，张林元（南京军事医学研究所，１２１０００２；江苏农科院，南京农业大学）鸡马立克氏病（ＭＤ）是遍布世界各地的危害最严重的家禽传染病之一，每年给全世界的养鸡业带来极为严重的损失。常规检...     

禽呼肠孤病毒病疫苗的研究进展

禽呼肠孤病毒(Avian reovirus, ARV)是目前严重危害养禽业发展的一种病原微生物,其引起的禽呼肠孤病毒病在全球各地的家禽养殖场广泛流行。近年来,ARV在我国养禽业的感染率呈逐渐上升趋势,给我国养禽业造成了重大的经济损失。安全、高效的疫苗是有效预防禽呼肠孤病毒病的重要手段。文章综述了国内外禽呼肠孤病毒病弱毒疫苗、灭活疫苗和基因工程疫苗的研究进展,以期为研发有效预防禽呼肠孤病毒病疫苗提供参考。     

一步法RT-PCR检测禽呼肠孤病毒的研究

根据已发表的禽呼肠孤病毒（ARV）S1133株S1基因序列，设计合成了一对扩增跨幅为532bp的引物。这对引物对ARV标准株，分离株以及人工感染SPF鸡跗关节组织抽提的核酸进行一步法RT-PCR扩增，即将反转录和PCR反应在一个PCR反应管中一次性完成。结果该方法对ARV4个标准株和5个分离株的扩增均获得了与预期大小一致的RT-PCR产物，而对照样品的扩增全为阴性；该方法最低可检测到0.16ng的ARV RNA，还可以直接从感染鸡关节组织抽提的核酸中检测到ARV RNA，表明该一步法RT-PCR对于ARV的检测是可行的。     

山东省白羽肉鸡中MDV、REV、CAV和ARV感染状况的病原学调查

为了解鸡马立克氏病病毒(MDV)、鸡传染性贫血病毒(CAV)、禽网状内皮增生病病毒(REV)和禽呼肠孤病毒(ARV)在山东省白羽肉用型鸡中的流行情况,试验采用地高辛标记的核酸探针-斑点杂交法对淘汰的商品肉鸡、病死商品肉鸡及淘汰肉种鸡进行了上述4种病毒病原的检测。结果表明:ARV主要以单一形式感染,在病死商品肉鸡中感染率最高(30.07%),在3种类型鸡中ARV感染率高于MDV,REV,CAV。MDV在淘汰肉种鸡中感染率(12.82%)高于其他2种鸡群,而REV,CAV,ARV感染率在病死商品肉鸡中最高。混合感染亦相当普遍,以淘汰肉种鸡最高(混合感染率达10.25%),高于任一病毒单独感染率,其次为病死商品肉鸡。     

直接免疫荧光检测禽呼肠孤病毒方法的建立

本研究利用经纯化的原核表达禽呼肠孤病毒(ARV)结构蛋白σ3作为免疫抗原,免疫兔子三次,血清效价达到27时采血分离血清.用硫酸铵沉淀法浓缩纯化血清中的IgG,纯化的IgG用荧光素FITC加以标记.利用制备的荧光标记特异性抗体和对反应条件进行优化,建立了表达σ3蛋白荧光抗体检测ARV的诊断方法.结果经纯化获得特异性抗ARV结构蛋白σ3的荧光标记IgG抗体.用标记的抗体检测ARV病毒感染的单层细胞,出现特异性的荧光.用建立的σ3-FA方法检测接种疑似ARV感染的病料的鸡胚原代成纤维细胞,检出的阳性样品与病毒分离结果一致.表明本研究建立的σ3-FA方法检测ARV病毒有较好的特异性,可用于ARV感染的临床样品检测.     

木材提取物可体外抑制禽呼肠孤病毒和偏肺病毒

田间试验已经证实单宁类的天然提取物可以有效抑制家禽肠道类病毒感染。基于上述研究，意大利博洛尼亚大学的科研人员对3种栗树提取物和1种白雀木提取物（都包含单宁，目前都可在畜禽业中使用）的体外抗禽呼肠孤病毒（ARV）和偏肺病毒（AMPV）进行了试验。他们采用MTT试验检测4种提取物对Vero细胞的50％细胞毒性浓度（CC50）和半数抑制浓度（IC50）。结果显示，     

禽呼肠孤病毒的人工感染试验

从关节炎病鸡分离的禽呼肠孤病毒(ARV)经足垫、皮下和经口接种于无 ARV 母源抗体的1日龄肉用雏鸡,观察其临庆症状、肉眼和显微病变、排毒状况和抗体应答.ARV 主要引起腱滑膜炎、肝脏坏死、心肌炎和心包炎.试验鸡在接种后3天开始死亡,足垫接种鸡的发病率高达100%;足垫和皮下接种鸡发育不良,死亡率比经口接种鸡高,病变也较严重。泄殖腔抗子回收病毒结果说明,ARV 感染鸡向外界排毒。同栏混养鸡检出特异性抗体说明受 ARV 感染。血清中和抗体比沉淀抗体出现早.同栏混养鸡的抗体水平始终低于 ARV 接种鸡.     

家禽疾病的临床诊断技术

家禽疾病的诊断技术包括临床诊断技术和实验室诊断技术。目前，随着城郊、农区规模化养禽的兴起，客观造成家禽疾病的诊断相对远离高科技集中的城市实验室。由于高密度饲养家禽的发病特点，为能及时把握治疗机会就使得家禽疾病诊断的临床意义增大。为此，重视家禽疾病的临...     

鸡毒支原体和滑液支原体的种特异性寡核苷酸探针

支原体可使家禽饲养蒙受重大经济损失。从家禽中已至少分离到16种支原体，其中以鸡毒支原体（Myc叩办。gallisePticum）和滑液支原体（Mxconlasmasynoviae）最为重要，可引起鸡和火鸡严重的呼吸道病。通常，对支原体的防治策略是直接扑灭种禽中的致病支原体。因此，需要确定种禽是否受到致病支原体的感染。但现行的支原体的鉴定方法其准确率和灵敏度均不高，需要发展新技术。本研究设计了两种rDNA寡核昔酸探针，通过直接滤膜杂交法（directjilterhybridizationexperhoent）分别用于鉴定鸡毒支原体和滑液支原体。借助计算机软件分析，将鸡…     

禽病诊断新技术展望

禽病诊断新技术展望吴红专刘福安（华南农业大学动物医学系广州５１０６４２１引言随着家禽生产集约化程度的不断提高，家禽疾病的类型日趋繁多，给养禽业造成的损失也更严重，如何利用新的实验室手段对禽病加以快速、准确诊断是广大禽病工作者面临的跨世纪课题，本文就二...