H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体IPMA检测方法的建立

本试验旨在建立一种针对检测抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的免疫过氧化物酶单层细胞试验（immunoperoxidase monolayer assay,IPMA）筛选方法。通过优化MDCK细胞接毒量、细胞接毒后培养时间、封闭液的种类和工作浓度、工作时间等各个反应条件,并对建立的IPMA筛选方法的特异性、敏感性和重复性进行评价。结果显示,建立的IPMA检测方法的最优反应条件为MDCK细胞接毒10^2.63 TCID₅₀/100 μL H1N1亚型猪流感病毒,37℃培养24 h,含3‰ H₂O₂的甲醇室温固定15 min,5%脱脂乳37℃封闭2 h,50 μL杂交瘤细胞上清作为一抗,37℃孵育2 h,羊抗鼠HRP-IgG二抗37℃孵育1 h。所建立的IPMA方法能特异性地检测H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体,与猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪瘟病毒（CSFV）阳性血清不发生交叉反应;其敏感性检测结果显示,可检测1：3 200的HI=2^-9标准H1N1猪阳性血清;批间和批内重复性试验结果较好。综上所述,本试验成功建立了抗H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体的IPMA检测方法,该方法特异性强、敏感性高、重复性好,为生产鉴定H1N1亚型猪流感病毒单克隆抗体提供了一种简便、实用、有效的检测手段。     

国内部分猪场猪流感检测情况分析

采用ELISA试验对上海市及部分外省市24个猪场的365份猪血清样品进行了猪流感病毒H1、H3亚型抗体的检测。结果：在被调查的24个猪场中,H1N1猪流感型抗体阳性率为30．96％,H3N2猪流感抗体阳性率为14．79％;在育肥猪和种猪的检测中,H1N1猪流感型抗体阳性率为36．6％,H3N2猪流感抗体阳性率为17．6％。表明在所调查的猪场中,猪流感病毒的感染较为普遍,大部分猪场都曾被H1、H3亚型感染,其中育肥猪和种猪的感染占主要地位。     

H1N1亚型猪流感病毒HA和NA基因双重RT-PCR定型检测方法的建立与应用

为了建立适用于临床诊断的H1N1亚型猪流感病毒快速检测方法,本研究根据GenBank已登录的H1N1亚型猪流感病毒HA和NA基因序列设计RT-PCR扩增引物,以H1N1亚型猪流感病毒、H3N2亚型猪流感病毒、猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒为试验对照,通过优化RT-PCR反应条件和反应体系,建立了H1N1亚型猪流感病毒HA和NA基因双重RT-PCR定型检测方法。同时,运用H1N1亚型猪流感病毒血凝和血凝抑制试验方法和本研究建立的方法对165份猪病料样品进行了对比验证。结果表明,本研究建立的H1N1亚型猪流感病毒双重RT-PCR具有良好的特异性、敏感性、重复性,所扩增的目的基因片段大小分别为428 bp和678 bp左右,可检出最小基因组RNA浓度为2.9×10-5μg/μL。本研究建立的方法和H1N1亚型猪流感病毒血凝和血凝抑制试验方法均从同一份猪肺脏样品中检测出H1N1亚型猪流感病毒,其余样品中均未检出H1N1亚型猪流感病毒,两种方法符合率为100%。本研究建立的方法适用于H1N1亚型猪流感病毒双基因定型检测,可在H1N1亚型猪流感病毒流行病学调查和临床诊断中应用。     

甲型H1N1流感、猪流感与兽医公共卫生学的关系及其应对与防治

介绍了甲型H1N1流感、猪流感的流行与防治情况,阐述了其流行特点、病毒的基因组特性、流行病学特点、临床症状.提出了甲型H1N1流感与猪流感的诊断方法和防治措施以及高危人群的主要应对方法.并从兽医公共卫生学角度对其进行了探讨和思考.     

2016年我国部分地区屠宰场猪流感血清学调查

目前,全球范围内流行的猪流感病毒亚型主要有3种:H1N1、H3N2、H1N2,此外,H1N7、H4N6、H9N2、H5N1、H3N3、H3N1和H2N3等亚型病毒也在猪体内分离到,但没有证据显示这些病毒在猪体内建立稳定的谱系。为了解我国屠宰场猪群中流感病毒的感染与流行情况,选取2009年甲型H1N1(pdm/09)、欧洲类禽H1N1(EA H1)、经典H1N1(经典H1)、新型三源重排H1N1(ReH1)、H3N2(H3)、H9N2(H9)流感病毒制备的血凝抑制(HI)标准抗原作为检测抗原,对全国25个屠宰场的猪血清进行了HI抗体的检测。结果显示,2016年我国屠宰场样品中,pdm/09、EA H1、经典H1、Re H1、H3、H9抗体阳性率分别为23.18%、28.12%、19.34%、24.97%、7%、7.41%;在所监测地区中,华南地区屠宰场猪流感血清平均抗体阳性率最高。结果表明,2016年我国屠宰场猪群中H1N1亚型猪流感病毒感染比较普遍,H3N2和H9N2亚型猪流感病毒抗体阳性率较低。     

甲型H1N1流感病毒核酸检测能力验证样品制备及其应用效果评价

为考核实验室检测甲型H1N1流感病毒的能力,设计和实施了“CNAS T0459甲型H1N1流感病毒核酸检测能力验证计划”.利用甲型H1N1流感病毒(2009)和经典H1N1猪流感病毒核酸标准物质制备6组能力验证阳性样品,经实验室检测分析,所制备的样品均匀性和稳定性均达到中国合格评定国家认可委员会对能力验证样品的要求.将6组阳性样品和1组阴性样品编号后下发54家参试实验室,共有50家实验室报送了有效数据,其中完全达到能力验证要求的实验室共34家,满意率达68％,其余16家为不满意实验室,包括8家实验室检测经典H1N1猪流感病毒满意,但甲型H1N1流感病毒(2009)特异性检测不满意.本次能力验证为整体提升我国甲型H1N1流感病毒的检测水平和评估各级实验室检测能力具有重要意义.     

携带H1N1 pdm09基因的重配猪流感病毒分子流行特征研究进展

在2009年甲型H1N1流感(H1N1 pdm09)大流行暴发初期,该病毒就已经成功地潜入到了猪群当中,继而参与到了猪流感病毒(SIV)的进化过程,通过不断地重配和适应,促进了新型SIV变异毒株的产生.目前,世界各地的猪群中普遍流行着携带有H1N1 pdm09基因片段的新型SIV,其重配形式呈现多样化.值得一提的是,由...     

部分猪场H1和H3亚型猪流感的血清学调查

为了解中国部分省市规模化猪场H1和H3亚型猪流感病毒的流行情况,采用血凝抑制试验对采集于广东、湖南、河南省12个市县28个规模化猪场的799份血清进行H1和H3亚型猪流感病毒的抗体检测。结果表明,H1亚型抗体阳性率在0~83.33%之间,猪抗体总阳性率为46.18%(369/799),猪场阳性率为89.29%(25/28)。H3亚型抗体阳性率在0~100.00%之间,猪抗体总阳性率为61.33%(490/799),猪场阳性率为85.71%(24/28)。广东、湖南和河南地区H1亚型抗体阳性率分别为48.91%、40.26%和50.67%,H3亚型抗体阳性率分别为58.55%、70.78%和78.67%。在被调查的上述3个地区的猪群中,H1和H3亚型猪流感病毒的感染较为普遍,其中H3亚型感染率高于H1亚型,且各地区猪流感病毒的流行情况存在地域性差异。     

辽宁省H1N1亚型猪流感病毒的分离鉴定与遗传演化分析

本研究2012年底从辽宁省某屠宰场猪鼻咽拭子样品中分离到1株流感病毒,经HA—HI试验和RT—PCR鉴定为H1N1亚型猪流感病毒株,命名为A／swine/Liaoning／01／2012（H1N1）,通过对病毒的8个基因片段克隆并测序,并利用分子生物学软件进行遗传演化分析。结果表明,分离株HA基因裂解位点附近的氨基酸序列为IPSIQSRjG,符合低致病力流感病毒的分子特征。全基因组进化树结果表明,分离株的8个基因片段与A／swine／Jiangsu／40／2011（H1N1）株核苷酸同源性最高,分离株处在类禽型H1N1亚型遗传进化分支上;由于类禽型H1N1猪流感病毒具有潜在感染人的潜力,在国外和国内均有感染人的报道,因此,辽宁省首次分离到该型猪流感病毒对全省养猪业和公共卫生安全具有重要意义,值得深入研究。     

具有地方性呼吸系统病史的50个猪群中3～6周龄出现咳嗽症状仔猪中猪肺炎支原体病的发生

到目前为止,意大利已经分离到了H1N1、H1N2和H3N2 3个亚型猪流感病毒。2006年,在一例有咳嗽症状的猪上分离到了一种新的猪流感病毒亚型(H3N1)。通过对肺组织的RT-PCR检测,对试验猪人工感染该新亚型流感病毒及利用空斑试验对该毒株的克隆鉴定,证实了这一独特的H和N组合的猪流感病毒的存在。同时,对该新型毒株进行了抗原及遗传特性鉴定。基因系统发育分析结果表明,H3N1亚型的完整HA基因序列与3株意大利H3N2亚型具有高度的一致性。这3个意大利亚型中有一株分离于2001年,其它2株分离于2004年,而该毒株的NA序列全长与2004年于意大利分离得到的3株H1N1亚型猪流感病毒极其相似。其余的基因片段也分别与当前意大利流行的H1N1与H3N2猪流感病毒极为相似。这表明,该新亚型猪流感病毒可能是H1N1与H3N2亚型的一个重组体。     

猪流感病毒H1、H3、N1、N2亚型分型 RT-PCR方法的建立

根据GenBank中H1N1和H3N2亚型猪流感病毒(SIV)血凝素(hemagglutinin,HA)、神经氨酸酶(neuraminidase,NA)和M基因保守序列,分别设计合成了5对特异性引物,利用RT-PCR技术对SIV的型和亚型进行鉴定。结果表明,该方法的型RT-PCR可以检测出10⁴ EID₅₀病毒量所提取的RNA;H1、H3、N1和N2的亚型RT-PCR均可以检测出10⁴ EID₅₀病毒量所提取的RNA。除每对特异性引物所对应的亚型外,对其他亚型及猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的检测均为阴性,应用该方法对临床样品进行检测,其结果与病毒分离结果符合率为100%。结果表明,该方法特异性好、敏感性高,有望成为SIV的一种特异、敏感、快速的分型检测方法,为猪流感分子流行病学的调查奠定了良好的基础。     

具有HI活性的H1亚型流感病毒特异性单克隆抗体的制备与应用

为了制备具有HI活性的HI亚型流感病毒特异性单克隆抗体(MAb),本研究以H1N1亚型猪流感病毒(SIV)株A/Swine/Guangdong/718/01(H1N1)为免疫原,免疫BALB/c小鼠,经常规细胞融合后,血凝抑制(HI)方法进行检测,融合细胞经稀释克隆纯化后,获得11株能稳定分泌抗血凝素特异性HI MAb的杂交瘤细胞株。鉴定表明,所获MAb与其他具有血凝活性的病毒以及其他14个HA亚型的流感病毒均不具有HI交叉反应,表明这11株MAb均具有良好的流感病毒亚型特异性。其中A6F、2BBF和2BB与其他H1亚型流感病毒分离株的HI试验证实我国不同地区分离株之间的抗原性存在一定差异。11株MAb对H1SIV抗原的HI试验结果显示其HI效价有明显差异。叠加实验表明这些MAb分别识别HA抗原的不同表位。间接免疫荧光试验表明,2BBF、8HB、1DH、7FC和2BB均可与2009年流行H1N1病毒A/California/04/2009HA抗原发生特异性反应。这些MAb特异性的研制为H1亚型流感病毒的疫情病原学快速诊断以及病毒抗原性变异的相关研究提供了物质基础。     

猪流感病毒HA基因的原核表达及其ELISA检测方法的建立

根据H1N1亚型猪流感病毒血凝素基因序列设计并合成特异性引物,从本室保存的H1N1亚型猪流感病毒中扩增信号肽和跨膜区缺失的血凝素基因,并将其克隆到原核表达载体pET-28a中,在大肠埃希菌中诱导表达.对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blot的结果表明,HA基因在大肠埃希菌中获得表达,产物具有免疫学活性,表达蛋白分子质量约为55 ku.表达产物经过纯化作为包被抗原建立了检测H1亚型猪流感抗体的间接ELISA方法.该方法具有较高的特异性和敏感性,重复性良好.应用该方法对2006年2 584份临床猪血清进行检测,结果显示多个地区检测猪流感抗体出现阳性,平均为20.5%.在6月、7月和12月分别出现抗体水平高峰,分别高达25.4%、25.0%和35.5%.     

1株H1N1亚型猪流感病毒的全基因组特征及其对小鼠的致病性

旨在了解河南省猪流感病毒的流行情况及其遗传进化和基因组特征。2018年4月，从河南省某一出现疑似流感症状猪群中采集鼻拭子样品150份用于分离病毒，对分离病毒的全基因组进行序列测定和分析。同时感染6周龄BALB/c小鼠，研究其对小鼠的致病性。结果显示，获得1株H1N1亚型病毒[命名为A/swine/Henan/NY20/2018（H1N1）]。遗传进化表明，其HA和NA基因属于欧亚类禽H1N1分支，PB2、PB1、PA、NP和M基因属于2009甲型H1N1分支，NS基因属于经典H1N1分支。HA蛋白的裂解位点序列为PSIQSR↓GL，具有低致病性流感病毒的分子特征，在小鼠肺和鼻甲有效复制并能引起肺组织病理学变化。本研究分离到1株3源重排H1N1亚型病毒，对小鼠呈现一定致病力，提示应进一步加强对SIV的监测。     

H1亚型猪流感病毒一步法实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速、简便、准确的方法以诊断和检测H1亚型猪流感病毒(swine influenza virus,SIV),试验根据H1亚型SIV血凝素(hemagglutinin,HA)基因保守序列,分别设计并合成1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,建立检测H1亚型SIV的一步法实时荧光定量RT-PCR技术。结果显示,该方法的敏感性可达10²拷贝/μL,除H1亚型SIV外,对H3N2亚型SIV、H9N1亚型SIV、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒的检测均为阴性,且应用该方法对疑似猪流感样品进行检测,其结果与SPF鸡胚分离病毒方法结果的符合率为94%。本试验结果表明该方法特异性强、重复性好,有望成为一种特异、敏感、快速、定量检测H1亚型SIV的方法。     

H9N2亚型猪源性流感病毒在小鼠肺微血管内皮细胞内最佳增殖条件的研究

试验旨在确定H9N2亚型猪源性流感病毒（SIV）在小鼠肺微血管内皮细胞（PMVEC）中增殖的最佳条件。将PMVEC解冻、复苏、培养,取长成单层的PMVEC,在不同浓度TPCK-胰蛋白酶维持液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 μg/mL）、不同H9N2亚型SIV（A/swine/HeBei/012/2008/（H9N2）接种剂量（1：10、1：100、1：1 000、1：10 000、1：100 000、1：1 000 000和1：10 000 000）及不同病毒吸附时间（0.5、1.0、2.0和3.0 h）条件下观察PMVEC形态变化,并测定细胞上清液中H9N2亚型SIV的HA滴度。在未加病毒的情况下,低于0.6 μg/mL的TPCK-胰蛋白酶对PMVEC的生长未造成任何影响,但随着TPCK-胰蛋白酶浓度的增加,PMVEC开始出现肿胀、变圆,甚至脱落;采用含有0.6 μg/mL TPCK-胰蛋白酶维持液将H9N2亚型SIV稀释为不同的浓度感染PMVEC,在0.3 μg/mL TPCK-胰蛋白酶维持液、10^-2病毒稀释倍数感染条件下48和72 h HA滴度分别为4.6log2和6.4log2;病毒吸附时间为2 h且中间震荡20 s的条件下H9N2 HA滴度最佳。结果表明,当TPCK-胰蛋白酶维持液浓度为0.3 μg/mL、病毒接种浓度为10^-2、吸附时间为2 h且中间震荡20 s时,H9N2亚型SIV在PMVEC中增殖最佳,达到6.8log2。     

猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型多重RT-PCR诊断方法的建立

对我国分离到的猪流感病毒和GenBank数据库中已有的猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型毒株的HA、NA基因核苷酸序列进行分析,分别选出各个病毒亚型HA和NA基因中高度保守且特异的核苷酸区域,设计扩增猪流感病毒H1和H3、N1和N2亚型的2套多重PCR特异性引物,建立了猪流感H1N1、H1N2和H3N2亚型病毒多重RT-PCR诊断方法。采用该方法对H1N1、H1N2、H3N2亚型猪流感病毒标准参考株进行RT-PCR检测,结果均呈阳性,对扩增得到的片段进行序列测定和BLAST比较,表明为目的基因片段。其它几种常见猪病病毒和其它亚型猪流感病毒的RT-PCR扩增结果都呈阴性。对107EID50/0.1mL病毒进行稀释,提取RNA进行敏感性试验,RT-PCR最少可检测到102EID50的病毒量核酸。对40份阳性临床样品的检测结果是H1N1、H1N2和H3N2亚型分别为16份、1份和20份,其它3份样品同时含有H1N1和H3N2亚型猪流感病毒,和鸡胚分离病毒结果100%一致。试验证明建立的猪流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亚型多重RT-PCR诊断方法是一种特异敏感的诊断方法,可用于临床样品的早期快速诊断和分型。     

Novel swine influenza virus subtype H3N1 in Italy

To date, three subtypes of swine influenza viruses, H1N1, H1N2, and H3N2 have been isolated in Italy. In 2006, a novel swine influenza virus subtype (H3N1) was isolated from coughing pigs. RT-PCR performed on lung tissues, experimental infection in pigs with the novel isolate, and cloning the virus by plaque assay confirmed this unique H and N combination. The novel isolate was also antigenically and genetically characterized. Genetic and phylogenetic analysis showed that the complete HA gene of the H3N1 strain has the highest nucleotide identity to three Italian H3N2 strains, one isolated in 2001 and two in 2004, whereas the full length NA sequence is closely related to three H1N1 subtype viruses isolated in Italy in 2004. The remaining genes are also closely related to respective genes found in H1N1 and H3N2 SIVs currently circulating in Italy. This suggests that the novel SIV could be a reassortant between the H3N2 and H1N1 SIVs circulating in Italy.