丝素蛋白水凝胶的凝胶机理及改性方法研究进展

水凝胶材料由于具备与人体软组织相似的特性而极具医用价值。以丝素蛋白为原料,采用有机溶剂诱导法可将丝素蛋白的凝胶时间由数天缩短到数小时;用碳化二亚胺(EDC)作活化交联剂制备的丝素/胶原复合水凝胶其储存模量可达10k Pa;通过酶催化作用交联形成的丝素蛋白水凝胶植入动物体内后,兼具良好的组织相容性与可生物降解性。本文首先阐述丝素蛋白水凝胶的凝胶机理,然后系统介绍了国内外多种丝素蛋白水凝胶的制备与改性方法及其基础原理,分析了丝素蛋白水凝胶作为新型生物材料在未来的临床医学应用中具有的巨大潜力,并提出了今后该领域需要攻克的基础理论问题与产品临床应用需要解决的技术问题。     

不同条件制备的血管样蚕丝编织物小口径管状支架及其形态结构与细胞毒性测定

为了开发适合临床应用的新型人工血管,以蚕丝编织物为芯层,模拟天然血管组织结构制备了一种丝素蛋白(SF)多孔管状支架。研究丝素蛋白与交联剂聚乙二醇双环氧甘油醚(PEG-DE)的配比、丝素蛋白浓度和冷冻温度对管状支架成型及结构的影响,并进行管状支架的体外细胞毒性试验。交联剂和丝素蛋白的配比与管状支架上丝素蛋白的覆盖度密切相关,SF与PEG-DE的质量比在1.0∶0.5~1.0∶1.0范围内,管状支架成型较好;丝素蛋白浓度越高,管状支架内部孔径越小,孔密度越高;冷冻温度越低,管状支架孔径越小。通过调节丝素蛋白浓度和冷冻温度可以控制支架内部孔径在50~300μm之间。采用MTT法测定PEG-DE交联的丝素蛋白管状支架没有明显的细胞毒性,具有进一步临床应用研究的价值。     

用酶水解结合盐溶解的方法制备丝素肽

以家蚕茧壳为原料,采用胰蛋白酶水解结合盐溶解的方法制备丝素肽。通过单因素试验、正交试验优化蚕丝蛋白纤维脱胶、酶水解、盐溶解和真空冷冻干燥全流程主要工艺条件为:蚕丝蛋白纤维以2.5 g/L Na2CO3+2.5 g/L NaHCO3的混合液脱胶30 min;在脱胶丝素蛋白纤维与8×105U/m L胰蛋白酶液的质量比为1∶100、酶解液pH 7.5、温度50℃的条件下酶解4 h;98℃下用200 g/L CaCl2溶液(浴比1∶120)溶解反应6 min;液态丝素肽在真空度60~70 k Pa条件下,进行-42℃3 h→60℃5 h→70℃4 h分段式真空冷冻干燥。在此工艺条件下,丝素蛋白的水解度为19.7%,获得的丝素肽样品呈粉末状,颜色洁白,无异味,可溶性指数接近100%,具有较好的商品性能与应用性能。     

不同溶解体系的丝素蛋白分子质量及对再生丝素膜性能的影响

为了便于根据不同丝素蛋白制品开发要求控制丝素蛋白的分子质量,用SDS-PAGE电泳方法检测不同溶解体系制取丝素蛋白的分子质量,并对不同分子质量丝素蛋白制备的再生丝素膜进行傅里叶红外光谱(FTIR)、热重(TGA)、微商热重(DTG)和热水溶失率等结构与性能的测试。SDS-PAGE检测结果显示,在LiBr-CH3CH2OH-H2O、Ca(NO3)2-CH3OH-H2O和Na-SCN-H2O溶解体系中的丝素蛋白分子质量较高且分布广;在CaCl2-CH3CH2OH-H2O和LiBr-H2O溶解体系中的丝素蛋白分子质量较低。FTIR、TGA、DTG和热水溶失率测试结果显示,低分子质量丝素蛋白溶液在成膜时较难形成α-结构和β折叠结构;而高分子质量丝素蛋白溶液在成膜时则较容易转变形成这2种结构。     

Ca2+对CdTe量子点复合丝素蛋白凝胶的影响

本实验利用LiBr法溶解丝素并制备其蛋白凝胶,基于CdTe量子点(quantum dots,QDs)本身固有的优良光学性能,通过荧光分光光度计分别测定不加Ca2+时和加入不同浓度的Ca2+时,CdTe量子点与丝素蛋白凝胶复合过程中荧光强度的变化,该实验结果证明CdTe量子点与丝素蛋白凝胶的复合需要Ca2+的介导,并且在一定范围内二者结合强度与Ca2+的加入量呈正相关性.     

木瓜蛋白酶对丝素蛋白的降解作用研究

丝素蛋白具有良好的生物相容性及降解性,被广泛地用于生物材料。本研究以废蚕茧为原料,通过脱胶、溶解、透析、浓缩等步骤制备了丝素蛋白溶液,再用木瓜蛋白酶降解丝素蛋白,利用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）进行丝素蛋白多肽的鉴定,探讨pH、温度及酶活等因素对木瓜蛋白酶降解丝素蛋白影响。结果表明：在pH8～9、温度60～70℃,木瓜蛋白酶的活性为20～25 U时丝素蛋白水解效果较好,酶的作用时间越长效果越好。本研究为开发丝素蛋白在食品、化妆品中的提供了基础。     

不同分子质量丝素肽的形貌结构与止血性能

为了利用蚕丝开发天然医用止血材料,以Ca Cl2-乙醇-水三元体系在不同温度条件下水解丝素蛋白并经喷雾干燥制备丝素肽,通过凝胶色谱、红外光谱、扫描电子显微镜、高效液相色谱仪等观测丝素肽的分子质量分布、形貌结构以及氨基酸组成和含量,通过凝血弹性描记分析(TEG)、大鼠肝脏止血模型和体外细胞毒性实验评价丝素肽的止血性能及细胞相容性。丝素蛋白在48℃条件下水解24 h获得的丝素肽分子质量分布在12~76 k D范围,平均分子质量为30 k D;在98℃条件下水解24 h获得的丝素肽分子质量分布在3.9~32.0 k D范围,平均分子质量为12 k D。2种丝素肽的二级结构均以无规卷曲为主,平均分子质量为30 k D的丝素肽存在部分β-折叠结构,且在水中易形成凝胶,用于处理大鼠肝脏止血模型时的出血量少,止血时间短,止血效果优于平均分子质量为12 k D的丝素肽,与Arista止血粉相近,且无细胞毒性,有望开发为体外快速止血材料。     

乳清蛋白凝胶条件的研究

以乳清蛋白为研究对象,研究了乳清蛋白浓度、温度、加热时间、pH值及金属离子等因素对乳清蛋白凝胶形成的作用。结果显示,乳清蛋白形成凝胶的基本条件是乳清水溶液浓度大于0．133g/mL；温度高于(85±2)℃。当温度在(85±2)～(90±2)℃之间,凝胶形成时间随乳清蛋白浓度变大而减少,在沸水中乳清蛋白浓度对凝胶形成时间影响不大,在19min左右；酸性条件下乳清蛋白形成凝胶的最适pH为5．3,pH小于1．2时,在沸水中加热30min,乳清蛋白形成碎块状凝胶；碱性条件下形成凝胶的最适pH为8．3,pH大于12．8时,在沸水中加热30min,乳清蛋白变为红色；钙离子的添加可使乳清蛋白形成凝胶所需时间减少到6min。     

多酚氧化酶对蚕丝及丝蛋白生物材料的改性与应用研究进展

多酚氧化酶能催化氧化酚类结构生成醌类活性中间体,引发酚类单体之间聚合。家蚕丝素蛋白和丝胶蛋白大分子肽链上均含一定数量的酪氨酸残基,酪氨酸的酚羟基能被多酚氧化酶催化氧化,生成醌类活性基,不仅可促成丝蛋白大分子交联,而且可与外源氨基功能化合物发生迈克尔加成或席夫碱反应,实现底物分子改造。本文讨论了多酚氧化酶的催化氧化机制,侧重阐述了近年来国内外应用多酚氧化酶(漆酶和酪氨酸酶)进行丝蛋白生物材料加工的研究,包括丝纤维制品酶法抗菌和防皱整理、丝素或丝胶酶促交联与接枝改性、再生丝蛋白膜及功能性生物材料制备等,为蚕丝及丝蛋白基材料的生物改性研究及开发利用提供参考。     

纳米TiO2改性丝素复合膜的研究

为了进一步改善丝素蛋白膜的结构性能,用溶胶凝胶法制备了不同比例纳米TiO_2改性的丝素蛋白复合膜。对生成的纳米粒子进行粒径分析表明,成膜前后纳米粒径约为80nm左右。对丝素膜的结构和热性能用X射线衍射(XRD)、扫描电镜(SEM)、热重分析(TGA和DTG)进行表征：XRD测试结果表明,随着纳米TiO_2的加入,复合丝素膜的结晶结构从SilkⅠ向SilkⅡ转化;SEM测试结果表明,TiO_2能与丝素形成较好的键合;TGA和DTG测试表明,复合丝素膜的热转变温度较之于纯丝素膜有所提高。     

具有交联结构的丝素蛋白质凝胶的理化特性

用二缩水甘油基乙醚作为交联剂制备的丝素蛋白质凝胶（ Ｃ Ｆ Ｇ） 具有良好的强度和柔韧性。根据制作条件可达压缩强度＞ １００ｇ／ ｍ ｍ ２ ,压缩变形率＞ ６０ ％ 。 Ｃ Ｆ Ｇ 在中性溶液中很少有丝素蛋白质溶出,但能被胰蛋白酶分解。     

抗凝血医用硫酸化丝素蛋白材料的生物相容性评价

将家蚕丝素蛋白通过化学接枝反应制备具有抗凝血功效的硫酸化丝素蛋白医用材料。经动物的热原试验、皮内刺激试验、皮肤致敏试验、急性毒性试验以及体外溶血试验,对硫酸化丝素蛋白进行生物相容性评价。结果表明:3只注射受试硫酸化丝素蛋白溶液后的家兔体温仅升高0.2、0.3、0.1℃,未引起热原反应;家兔试验部位和周边组织出现的少量红斑或红肿在72 h后自然消退,无刺激反应;涂抹受试溶液后连续3 d,小鼠的试验部位和周边组织均未出现红斑、水肿等致敏反应;小鼠腹腔注射受试溶液后生理活动及生长正常,无毒性反应;受试溶液在体外溶血试验中无溶血现象。各项试验结果提示:硫酸化丝素蛋白材料有良好的生物相容性,具有在生物医学材料领域应用的前景。     

丝素蛋白膜作为葡萄糖氧化酶载体的研究

采用戊二醛共价交联法将葡萄糖氧化酶（GOD）固定在丝素膜上，探讨了酶的固定化方法，研究了固定化酶膜的动力学性质，并与包埋法制备的酶膜进行了比较。共价法可获得高活力的酶膜（534u／cm2），固定化过程中使用甲醇或戊二醛处理对酶活力有轻微影响。固定化GOD最适pH值向中性偏移（pH7．0），最适温度为50℃，热稳定性提高，表观米氏常数比溶液酶降低，酶膜的贮存稳定性良好。     

用对苯二甲酰氯进行丝素蛋白的化学接枝改性研究

为改善丝素膜的性能,用对苯二甲酰氯(DB)作改性剂对丝素蛋白进行了接枝改性。研究了对苯二甲酰氯加入量以及不同温度下成膜等对接枝产率的影响。通过傅里叶红外光谱(FTIR)测试表明,对苯二甲酰氯与丝素形成共价结合;万能电子强力仪检测表明,改性后的丝素膜其力学性能有较大的改善,当接枝率为6.8%,丝素膜断裂强度可达42.5 MPa,断裂伸长率可达5%。     

阴离子表面活性剂SDBS对真丝纤维接枝反应过程的影响

在真丝纤维的接枝反应体系中添加适量的阴离子表面活性剂十二烷基苯磺酸钠(SDBS)以提高单体甲基丙烯酰胺(MAA)的利用率。研究SDBS对引发剂过硫酸钾(KPS)分解过程及单体MAA接枝反应速率的影响,结果表明:当接枝反应体系中加入1.6×10-5 mol/L SDBS后,SDBS与丝素蛋白、单体MAA分子之间电荷的相互作用,中和了丝素蛋白与MAA间的斥力,更多的MAA分子参与到接枝反应中,提高了接枝真丝纤维的反应速率,使单体利用率提高10个百分点左右;SDBS的加入使引发剂KPS的分解偏离一级反应,降低了单位时间内真丝纤维上吸附KPS的浓度,提高了接枝聚合物的平均分子质量。因此,在采用单体MAA接枝真丝纤维的反应体系中加入阴离子表面活性剂SDBS可提高单体利用率,从而降低生产成本。     

冷冻干燥丝素粉末的性质

对丝素溶液经冷并干燥制得的丝素粉末的性质进行的研究表明,丝素溶液经冷冻干燥得到的丝素粉末易溶解于水,得到的溶液同一般丝素溶液一样能形成丝素凝胶和丝素膜,但丝素膜的强度有下降趋势,伸长度有增加趋势。对丝素粉末进行高温高湿处理后,丝素粉末的溶解性下降,溶解丝素粉末制得的丝素膜的强度、伸长度下降。     

丝素/明胶共混膜的结构与溶解性能的初探

将丝素溶液与明胶溶液按不同共混比在不同条件下进行混合,制备成丝素/明胶共混膜。用环境扫描电镜、红外光谱仪、差示扫描量热分析系统分别测定共混膜的结构与热性能,采用烘干质量法测定共混膜的溶胀率和溶解率。结果表明:丝素与明胶的共混性好,共混膜结构改变,热稳定性好;烘干时间对共混膜的溶胀率和溶解率影响不显著,不同浓度乙醇处理对溶胀率有极显著影响,不同共混比则对溶胀率和溶解率都有极显著影响。     

蚕丝丝素的酚羟基与二氟一氯嘧啶型活性染料的模拟反应试验

以对甲酚作为蚕丝丝素的酚羟基的模拟物,应用反相离子对高效液相色谱技术研究酚羟基与二氟一氯嘧啶型活性染料黛棉丽蓝K-2RL在不同条件下的反应性能。试验结果表明:在60～80℃、pH=8～10的条件下,酚羟基与黛棉丽蓝K-2RL有很好的反应性,在与碱液中羟基的竞争反应中酚羟基占有明显的优势,染料上的2个氟原子均可分别或同时与酚羟基反应,其主要反应产物有4种。根据模拟反应结果推断蚕丝纤维表面富集的酚羟基是二氟一氯嘧啶型活性染料与蚕丝纤维反应固着的重要基团。     

丝素/纳米SiO2凝胶共混膜的制备及性能测试

为了改善丝素膜作为医用材料的物理性能,以丝素和纳米SiO2为基材,乙醇为溶剂,制备不同质量比的丝素/纳米SiO2凝胶共混膜。对丝素/纳米SiO2凝胶共混膜的微观形态与结构进行表征:共混膜表面呈凹凸状,横截面为多层次的网络状结构,丝素蛋白分子主要为β-折叠结构。对不同质量比丝素/纳米SiO2凝胶共混膜的物理性能进行测试:当丝素与纳米SiO2共混质量比为80∶5时,共混膜的断裂强度最大,为94.86 MPa;当共混质量比为80∶3时,共混膜的断裂伸长率最大,为55.20%;共混膜的溶胀度和热水溶失率与纳米SiO2含量成反比,而透气性随着纳米SiO2含量的增加呈先上升后下降的趋势。测试结果表明,在天然高分子材料丝素溶液中加入具有补强增韧功能的纳米SiO2制备的共混膜,更接近优良人工皮肤材料的物理性能特征,丝素与纳米SiO2的共混质量比以80∶3和80∶5为宜。     

丝素的结晶度和结构变化的研究

本实验用X射线衍射法研究了丝素膜的结晶度及结构的变化与其制备、处理条件的关系。同时与丝素凝胶的干燥相比较,由于成膜与凝胶干燥速度的不同,使室温下丝素膜含Silk Ⅰ而凝胶干燥所得的粉末则含Silk Ⅱ。对含有Silk Ⅰ的丝素膜于150℃饱和水蒸汽处理半小时,发生了Silk Ⅰ→Silk Ⅱ的转变。