表面活性剂LAS在棉花高通量DNA提取中的应用

本研究以棉花种子和叶片为材料,探索一种适用于棉花DNA高通量提取的方法。通过在裂解液中加入APG、LAS、CPB、DTAB、Tween80、SDS和CTAB 7种不同表面活性剂,比较其在棉花种子和叶片中的DNA提取效果,并与磁珠法和氯仿抽提法两种高通量纯化方法结合,对比传统SDS和CTAB提取液提取效果。结果表明,加入LAS表面活性剂的裂解液提取的DNA效果较好,提取棉花种子和叶片的浓度可达2 127.61和572.70 ng/μL,OD260/280分别为1.97和1.98,上清液清澈透明。LAS与两种纯化方式结合的DNA提取效果都明显优于传统CTAB和SDS提取液的提取效果,其中LAS与氯仿抽提的纯化方法结合提取效果最好,且DNA提取通量可达到600个样品/2 h。LAS表面活性剂能在棉花种子和叶片DNA提取中都能起到促进作用,与氯仿抽抽提纯化方法相结合可兼顾DNA提取通量与质量,能满足后续大部分分子实验要求。     

一种快速高效的油茶叶片DNA提取方法

油茶叶片含有较多的多糖和多酚等次生代谢产物是提取DNA的重要障碍。本研究以油茶叶片为材料研究高质量的DNA提取方法。建立了一种改良的CTAB法,运用2×CTAB缓冲液来裂解细胞,在裂解细胞后的溶液中加入终浓度为2 mol/L Li Cl,用氯仿异戊醇抽提溶液,用等体积的异丙醇沉淀DNA,用预热的70%乙醇洗涤DNA沉淀。运用紫外分析和琼脂糖凝胶电泳分析测定了DNA的产率和质量,并与经典SDS法、经典CTAB法、高盐低p H法进行了对比。结果表明,改良的CTAB法提取的DNA产率比经典SDS的少,与经典CTAB法和高盐低pH法的相似,达到39.0μg/g,且纯度高,无RNA的污染。改良的CTAB法提取的叶片DNA可用于油茶后续的PCR分析研究。     

春兰基因组DNA提取方法的研究

本文以春兰(Cymbidiumgoeringii(Rchb.f.)Rchb.f.)为研究试材,对植物基因组DNA提取方法中的若干影响因子诸如药品、试剂配制方法、DNA取材部位、蛋白质去除次数、DNA析出时间、提取样品水浴时间等进行了比较分析,试图找出春兰基因组DNA提取的最佳方法。结果表明:采用进口的CTAB提取效果比国产的CTAB要好,特别适用于花药的提取,蛋白质去除效果很好;SDS提取缓冲液配制方法很重要,不同的SDS缓冲液配制方法,其提取效果差异较大。春兰花苞的DNA提取得率较叶片高,但是叶片DNA的纯度则相反,叶片较花苞高。在提取花苞基因组DNA过程中,增加氯仿/异戊醇抽提次数,对去除DNA中蛋白质、多糖及其它杂质有一定的作用,但是对DNA的损失也是很明显的。从实验效果来看,氯仿/异戊醇抽提次数以2次为宜。提取基因组DNA在异丙醇沉淀时,采取挑取絮状沉淀的方法,也可减少蛋白质、多糖等其它杂质的影响,从而提高DNA纯度。无论是叶片还是花苞材料,采用异丙醇沉淀5min,一般析出的以核酸基因组DNA为主,蛋白质为次,核酸析出量在80%以上。继续沉淀(15min)的产物中DNA含量明显较低,而且沉淀的纯度相对不高,因此异丙醇沉淀时间可以缩短到10min之内以提高DNA的纯度。使用CTAB法提取DNA时,水浴时间至少需要30min,过短的水浴时间会造成DNA得率的下降,同时过长的水浴时间,如超过1h,则可能会引起DNA的降解,或者最后产物中增加其他杂质,因此,适宜的水浴时间当为40￣60min。     

适合RAPD分析的三种玉米基因组DNA提取方法比较

本文通过对3种玉米基因组DNA提取方法的比较得出，DNA提取时采用一次氯仿／异戊醇抽提方法，得到的DNA质和量都较为理想，并且能够达到RAPD实验的要求。     

一种改进的多浆旱生植物霸王叶和根总RNA提取方法

针对多浆时旱生植物霸王富含多酚和多糖类物质的特点,在常规异硫氰酸胍方法的基础上进行改进,摸索出一种霸王叶和根总RNA提取的方法.本方法主要通过在提取缓冲液中加入4%β-巯基乙醇以去除多酚物质的干扰;用2mol/L醋酸钠(pH4.0)、水饱和酚和氯仿:异戊醇(24:1)抽提以去除多糖和蛋白物质.采用该方法提取的霸王总RNA纯度高、完整性好,电泳条带清晰,OD260/OD280抛值在1.8～2.0之间,其质量完全可以满足进一步分子生物学研究的要求.     

胡萝卜叶片线粒体DNA提取方法研究

本实验以胡萝卜叶片为材料,通过高盐差速离心和蔗糖沉淀差速离心两种方法提取线粒体DNA。通过改变分离和沉淀线粒体离心力大小、使用DNaseⅠ处理得到了无核DNA污染的线粒体。用SDS和蛋白酶K 裂解线粒体,经酚/氯仿/异戊醇抽提除去蛋白,并用RNase A 消化从而得到单纯线粒体DNA。本实验还特别设计了叶绿体特异性引物检测线粒体DNA纯度。结果表明：利用优化后的蔗糖沉淀差速离心法提取胡萝卜线粒体DNA,不仅操作简单,而且所得线粒体DNA纯度高、产量高,每克叶片能够得到34.46 μg 线粒体DNA。     

胡萝卜叶片线粒体DNA的提取方法

提取高质量的线粒体DNA,对植物细胞质雄性不育的研究起着关键性的作用。以胡萝卜叶片为材料,通过高盐差速离心和蔗糖沉淀差速离心2种方法提取线粒体DNA。通过改变分离和沉淀线粒体离心力大小、使用DNaseⅠ处理得到了无核DNA污染的线粒体。用SDS和蛋白酶K裂解线粒体经酚/氯仿/异戊醇抽提除去蛋白,并用RNaseA消化从而得到单纯线粒体DNA。还特别设计了叶绿体特,异性引物检测线粒体DNA纯度。结果表明:利用优化后的蔗糖沉淀差速离心法提取胡萝卜线粒体DNA,不仅操作简单,而且所得线粒体DNA纯度高、产量高,每克叶片能够得到34.46μg线粒体DNA。     

青藏高原珍稀藏药水母雪莲药材DNA微量提取方法优化

本研究采用改良CTAB法、改良SDS法、高盐低p H法提取自然风干的水母雪莲植株的基因组DNA,并对提取方法进行优化筛选出适合于水母雪莲药材DNA的提取方法。研究表明改良CTAB(CTAB浓度为2%,PVP浓度为1%,β-巯基乙醇浓度为2%)法所提取的基因组DNA得率较高,且使用氯仿/异戊醇抽提两次时提取出的DNA质量较好,能够满足ISSR分析要求。在此基础上对实验材料进行预处理,优化获得了完全适用于水母雪莲风干药材DNA提取的一整套提取流程。该方法能够有效去除次生代谢产物对DNA提取的影响,且对原材料消耗较少,可以应用于后续水母雪莲种质资源鉴定和遗传多样性分析。     

胡萝卜肉质根线粒体DNA提取方法研究

本研究以胡萝卜根为材料,通过高盐差速离心和蔗糖沉淀差速离心两种方法提取线粒体DNA。通过改变缓冲液、使用DNaseⅠ处理得到了无核DNA污染的线粒体。用SDS和蛋白酶K裂解线粒体,经酚:氯仿:异戊醇抽提除去蛋白,并用RNaseA消化从而得到单纯线粒体DNA。本实验还特别设计了叶绿体特异性引物检测线粒体DNA纯度。结果表明:利用优化后的蔗糖沉淀差速离心法提取胡萝卜线粒体DNA,所得线粒体DNA纯度高、产量高,每克肉质根能够得到27.60μg线粒体DNA。     

枳壳基因组DNA提取方法的比较研究

以枳壳（酸橙）叶片为试验材料,分别采用改良CTAB法、CTAB-硅珠法、SDS法、高盐低pH值法和周世良法5种方法提取枳壳基因组DNA,并通过紫外分光光度计、琼脂糖凝胶电泳及SSR-PCR扩增3种方法对所提取的DNA样品进行检测。结果表明,5种方法中SDS法提取的DNA浓度最高（平均为900 ng/ul）,纯度最好（OD260/OD280平均值为1.90）,且SSR-PCR扩增结果与紫外分光光度计和凝胶电泳检测结果基本一致。因此,SDS法是枳壳DNA最佳提取方法,可用于分子检测试验。     

以PCR为目的的大豆叶片DNA提取方法的比较研究

模板DNA的质量直接影响PCR扩增的结果,而不同提取方法及其缓冲液的成份与浓度对提取DNA的质量有重要影响。本文以5个栽培大豆品种的叶片为材料,比较分析了SDS与CTAB两种提取方法以及不同浓度CTAB提取缓冲液对所提取的DNA质量的影响,并通过PCR进行检验。实验结果表明：用1％(W/V)、2％(W/V)浓度的CTAB提取缓冲液和1．25％(WV)SDS提取缓冲液所提取的大豆叶片DNA的质量较好,均能满足PCR扩增模板的需求,其中以1．25％(W／V)SDS提取得到的大豆叶片DNA质量最好,以其为模板扩增的效果最佳,而4％浓度的CTAB不适宜提取大豆叶片DNA。     

Evaluation of 'quick and dirty' DNA extraction methods for marker-assisted selection in rice (Oryza sativa L.)

Six simple methods for extracting DNA from rice seedlings were evaluated for marker‐assisted selection (MAS). The assessment of each method was based on PCR amplification of SSR markers, DNA yield and purity, time and cost. Based on these criteria, two methods were selected as being superior to other methods. The best two methods included the standard method developed at the International Rice Research Institute (IRRI), which utilizes a sodium dodecyl sulfate extraction buffer followed by chloroform/isoamyl alcohol extraction and a previously published method using sodium hydroxide and Tris. These two methods produced nearly identical PCR amplification results. The sodium hydroxide method is considerably simpler, quicker and cheaper than the standard IRRI method, and may be particularly useful for many applications of MAS or high‐resolution mapping. This method was also adapted into an effective high throughput method utilizing 96‐well plates emphasizing its versatility.     

美味猕猴桃基因组DNA的高效提取

为了从富含多糖和多酚等次生代谢物质的猕猴桃叶片及野外采集保存的叶样中分离出高质量的基因组DNA，以美味猕猴桃幼叶为试材，对4种不同的DNA提取方法与3种不同的样品保存处理的DNA提取效果进行了试验研究，并首次采用CTAB区室法提取猕猴桃基因组DNA。结果表明，CTAB区室法与硅胶脱水干样保存处理所提取的DNA效果最佳，其OD260/OD280值为1.8以上，能完全被EcoR I酶切消化，1%琼脂糖凝胶电泳谱带明亮清晰，并能获得条带清晰、多态性好的PCR扩增图谱。     

一种适合葡萄多种组织的总RNA提取方法

为了解决葡萄组织中总RNA提取难度大的问题,以感染葡萄卷叶病毒-3的葡萄品种‘蛇龙珠’为试验材料,采用CTAB结合SDS法对总RNA提取方法进行了研究,建立了一套适合葡萄叶片、叶柄及韧皮部等多种组织总RNA提取的方法。结果表明,该方法在多种组织中均能获得高质量的RNA,OD260/OD280=1.8~1.9,电泳结果表明,所得RNA完整性好,无降解。同时用所得RNA进行了GLRaV-3的检测,电泳结果表明该法所得RNA可满足葡萄病毒病RT-PCR检测的质量要求。该方法操作简单,结果稳定,对其他富含多酚、多糖类植物组织总RNA的提取具有借鉴意义。     

苦瓜基因组DNA的提取及ISSR扩增体系的优化

为了快速获取高质量的苦瓜基因组DNA,以便进行苦瓜白粉病抗性基因分子标记研究,比较了不同的DNA提取方法、不同部位的苦瓜叶片提取基因组DNA的产量和质量,探究了苦瓜基因组DNA提取的最佳方法和叶片的最适部位;研究了ISSR-PCR的退火温度,并采用正交设计法对影响ISSR-PCR的Mg²⁺、dNTPs、Taq酶、模板DNA以及引物浓度等5个因素进行了优化。结果表明,采用改良CTAB法从苦瓜顶端嫩叶中提取的基因组DNA OD260/OD280值在1.8~1.9之间,OD260/OD230值为2.0左右,对DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测,主带清晰,降解较少,产量和纯度均较高,效果较好。优化后的ISSR-PCR反应体系为：2.5μL 10×PCR buffer,2.5 mmol/L MgCl₂,250μmol/L dNTPs,10 ng模板DNA,0.75 U Taq酶,引物浓度0.7μmol/L,反应总体积为25μL,引物UBC826最佳退火温度为53℃。该体系在多次重复中均能获得良好的扩增结果。苦瓜基因组DNA提取的最佳方法为改良CTAB法,最适合的部位为顶端嫩叶。     

玉米单株幼芽DNA快速提取新方法

为了攻克利用DNA指纹技术进行玉米种子纯度鉴定中存在的技术难关,对玉米单株幼芽DNA快速提取方法进行了研究,结果表明：利用新方法提取DNA,不用液氮、不用研磨、不用离心、不用沉淀,不用SDS、不用CTAB、不用氯仿,并且提取的DNA不降解、完全可以满足利用SSR分子标记进行DNA指纹分析的需要。一个人提取100株幼芽(1个检测样品)DNA只需30min左右,1d可以提取2000株幼芽(20个检测样品)的。DNA,为DNA指纹技术在玉米种子纯度及真伪快速鉴定中的广泛应用解决了关键性技术难题。