利用酵母双杂交系统筛选水稻类受体蛋白激酶FTPK1的互作蛋白

类受体蛋白激酶(receptor-like protein kinases, RLKs)作为重要的信号分子受体,在植物生长发育过程中起着重要的调控作用。RLKs主要通过胞内的激酶区磷酸化其底物蛋白来发挥作用,因此鉴定RLKs的底物蛋白对于其功能的研究至关重要。本研究利用酵母双杂交系统对FTPK1的互作蛋白进行筛选,初步确定了两个候选蛋白,为进一步研究该激酶的功能奠定了基础。     

草莓果实FaRIPK1蛋白的酵母外源表达及验证

[目的]类受体蛋白激酶在植物的生长发育及果实成熟过程中发挥重要作用,而植物中已鉴定的类受体激酶绝大多数属于LRR型.为了得到草莓中LRR型蛋白激酶FaRIPK1,从而进一步研究其功能.本实验采用真核表达的方法诱导表达FaRIPK1蛋白质,以期确定其最佳的诱导表达时间.[方法]以‘童子一号’草莓果实为试验材料,扩增出FaRIPK1基因的功能区序列,构建真核表达载体pPICZB-RIPK1后转入酵母表达菌株X-33诱导表达,通过在0,12,24,36 h处取样检测FaRIPK1蛋白质的表达情况并采用Ni-NTA琼脂糖树脂亲和层析柱纯化得到目的蛋白,纯化后的FaRIPK1蛋白质再进行Western-blot验证.[结果]重组表达菌株经过BMMY诱导培养基诱导24 h后FaRIPK1蛋白质的表达量达到最高值,此时最利于FaRIPK1蛋白质的纯化.Western-blot验证表明所得蛋白质确为FaRIPK1蛋白质.[结论]确定了诱导表达后24 h为FaRIPK1蛋白质真核表达的最佳时间,为进一步研究FaRIPK1蛋白质的功能奠定基础.     

玉米ZmCIPK42原核表达载体构建及蛋白纯化

[目的]分析玉米ZmCIPK42序列,诱导蛋白表达,并获得纯化的蛋白.[方法]利用蛋白分析软件分析ZmCIPK42性质及磷酸化作用位点,构建ZmCIPK2-pET30a原核表达载体,用IPTG诱导蛋白表达,用NiNTA树脂纯化蛋白.[结果]ZmCIPK42具有典型的CIPK家族基因的N端激酶结构域和C端NAF调控域,激酶结构域内有较多磷酸化位点,原核表达的ZmCIPK42主要以包涵体形式存在,用Ni-NTA树脂可以纯化获得有活性的ZmCIPK42蛋白.[结论]28℃诱导后ZmCIPK42可以有活性的蛋白.用His作为标签纯化ZmCIPK42蛋白,可高效获得大量纯化蛋白.     

谷子类受体蛋白激酶基因SiRLK35的克隆及原核表达

本研究以"豫谷1号"c DNA为模板,通过PCR技术获得类受体蛋白激酶基因SiRLK35(NCBI登录号:XM_004956247.2)的全长序列。生物信息学分析显示,该基因编码蛋白由392个氨基酸残基构成,包含一个S_TKc保守结构域以及一个TFS2N结构域,含3个跨膜结构域,N端有信号肽。SiRLK35基因经Bam HⅠ、SalⅠ双酶切后,利用p ET-28a构建原核表达载体,转化大肠杆菌菌株BL21(DE3),经0.5 mmol/L IPTG于25℃诱导12 h后,在44.6 k D处得到一明显诱导表达蛋白条带,表达产物与预期相符,证明SiRLK35基因可在大肠杆菌中诱导表达。该结果为进一步研究SiRLK35基因功能奠定基础。     

水稻OsRLCK167基因的组织表达模式和生物信息学分析

类受体胞质激酶(receptor-like cytoplasmic kinases, RLCKs)家族是一类特殊蛋白激酶，在植物生长和病原菌防御中发挥着重要的生物学功能。在对水稻RLCKⅥ家族成员OsRRK1基因的研究中发现水稻4号染色体上存在一个与其同源性特别高的基因，即OsRLCK167(LOC＿Os04g56060)。为了丰富类受体胞质激酶家族并探究水稻胞质受体激酶基因的作用，本研究利用ExPASy-Protparam、Protscale、CD-search等在线工具和DNAMAN软件对OsRLCK167基因进行生物信息学分析；采用qRT-PCR技术对OsRLCK167基因做组织表达模式分析。结果显示：OsRLCK167蛋白的分子量为43.77776 kD,为疏水性、不稳定的酸性蛋白；对该蛋白的二级结构进行预测，显示其主要由无规则卷曲(41.94%)、α-螺旋(35.29%)、延伸链(15.35%)和β-转角(7.42%)组成；该基因在水稻不同组织均有表达，且在叶鞘中的表达量最高。结果表明，OsRLCK167基因在进化过程中具有高度的保守性，在水稻中具有功能多样性。     

佛波酯对猪中性粒细胞巨噬细胞表面分子抗原-1的作用及有关信号机制研究

【目的】研究佛波酯诱导猪中性粒细胞黏附分子巨噬细胞表面分子抗原-1表达的作用及有关信号机制。【方法】采用密度梯度离心法分离纯化猪外周血中性粒细胞,以流式细胞术检测中性粒细胞巨噬细胞表面分子抗原-1表达,分别以实时荧光定量PCR、Western Blot法检测信号蛋白p38丝裂原活化蛋白激酶、胞外信号调控激酶的基因表达和磷酸化活性。【结果】20、30 nmol/L的佛波酯能极显著促进猪中性粒细胞巨噬细胞表面分子抗原-1的表达(P<0.01)。与对照相比,佛波酯在0.5、6 h可明显增加猪中性粒细胞p38丝裂原活化蛋白激酶的基因表达量(P<0.05,P<0.01);在0.5、3和6 h可极显著增加猪中性粒细胞胞外信号调控激酶的基因表达量(P<0.01)。与对照相比,佛波酯在1、5和30 min可极显著促进p38丝裂原活化蛋白激酶磷酸化活性(P<0.01);在0.5、1、5和30 min可明显促进胞外信号调控激酶磷酸化活性(P<0.05,P<0.01)。【结论】佛波酯能诱导猪中性粒细胞黏附分子巨噬细胞表面分子抗原-1的表达,其机制至少与上调p38丝裂...     

拟南芥蛋白激酶基因BIN2的原核表达纯化及其酶活性分析

为了研究蛋白激酶BIN2(BR-insensitive-2)的底物及其在BR信号通路中的作用机制,通过One Step Cloning方法将BIN2基因克隆至SUMO表达载体,利用SUMO标签促进目的蛋白表达和折叠的特性,对BIN2蛋白进行原核表达和纯化,进而检测BIN2的激酶活性。结果表明,纯化得到的BIN2具有自身磷酸化活性,并测得其酶活大小和动力学曲线。为进一步研究BIN2蛋白的作用机制提供了基础材料。     

植物LRR类受体蛋白激酶的研究进展

植物中富亮氨酸重复片断类受体蛋白激酶(LRR RLK)属于跨膜类受体蛋白激酶,由胞外LRR结构域、单次跨膜区以及胞内激酶结构域三部分组成。在不同植物中,LRR RLK作为信号识别受体参与CLV、BR、Ax21等信号转导过程,在植物生长发育、激素调节以及逆境应答反应等方面中发挥重要的作用。综述了近年来LRR RLK的相关调控功能及其作用机制的研究进展,并为进一步探索LRR RLK的功能及应用提供参考。     

拟南芥CPK11对开花调控因子FD的磷酸化作用

CPKs是植物中一类重要丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,参与多种植物生物学反应。利用原核表达技术纯化制得质量较高His6-CPK11融合蛋白;Western blot免疫印迹技术分析表明纯化His6-CPK11蛋白可被anti-His单克隆抗体特异识别;体外激酶试验证实His6-CPK11可磷酸化开花途径转录因子FD蛋白,可为CPKs家族成员参与FD蛋白磷酸化修饰提供支持。     

三叶青两个受体蛋白基因的克隆及功能分析

植物细胞受体类蛋白是一类重要的结构蛋白，在环境信号感知及细胞间信息传递中起重要作用。本研究克隆了三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)的两个受体蛋白基因ThRLP1与ThRLK1,并对其进行了生物信息学分析、器官特异性表达分析和在块根发育不同时期的表达分析，以明确两基因与三叶青芽发育和块根形成的相关性。生物信息学分析表明，所克隆的两个基因中一个为细胞外受体类蛋白基因(ThRLP1),其氨基酸序列具有特征的亮氨酸重复序列，亚细胞定位推测在细胞壁；另一个为质膜受体类蛋白激酶基因(ThRLK1),推测氨基酸序列中具有特征的丝氨酸/苏氨酸激酶的催化结构域，亚细胞定位推测在细胞核。器官特异性表达分析发现ThRLP1在块根中的表达量显著低于其他器官，ThRLK1在块根中的表达量显著低于枝蔓但高于其他器官，两个基因的表达水平并没有显示出与芽发育有相关性；块根发育不同时期表达量分析表明，ThRLP1在块根初始膨大期的表达量显著低于其他时期，ThRLK1表达量随块根发育进程而提高，ThRLK1基因的表达与块根发育进程呈现出一定的正相关性。所克隆的两个受体蛋白...     

差异显示法克隆水稻抗白叶枯病相关蛋白激酶基因

利用已知植物的蛋白激酶及抗病基因氨基酸序列，设计含激酶保守功能域的简并引物，运用ｍＲＮＡ差异显示技术显示经病原菌诱导的抗性品系及感病品系愈伤组织ｍＲＮＡ表达差异，并对差异片段分子克隆。     

应用GST pull-down技术筛选番茄SIVQ6互作蛋白

【目的】含有VQ基序(VQ)的蛋白质是植物特异性蛋白质,具有保守的"FxxhVQxhTG"氨基酸序列,调节植物生长和发育。番茄SlMPK1在高温胁迫过程中发挥重要作用,酵母双杂交(Y2H)显示SlVQ6蛋白能够与SlMPK1相互作用,通过GST pull-down技术进一步验证SlMPK1与SlVQ6的互作以及SlVQ6的互作网络,为研究SlVQ6介导的高温应答信号通路奠定基础。【方法】通过pGEX-4T-1-PC-VQ6质粒构建,以含有目的基因SIVQ6的菌液为模板,设计特异性引物,扩增目的基因序列,将获得的目的基因VQ6克隆到载体pGEX-4T-1的Bam HⅠ和NotⅠ的酶切位点之间,将获得的重组质粒pGEX-4T-1-PC-VQ6转入TOP10克隆菌株经IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)诱导表达,通过GST柱亲和纯化获得目标蛋白PC-VQ6,进而获得预期GST-SlVQ6融合蛋白,通过体外磷酸化进一步确定SlVQ6是否是SlMPK1的下游底物;以GST-SlVQ6为诱饵蛋白固定于GST Sepharose Beads上,与番茄叶片总蛋白孵育后洗脱,收集洗脱液进行SDS-PAGE凝胶电泳验证,通过LC-MS/MS检测SlVQ6可能互作的候选蛋白,并对筛选的SIVQ6互作蛋白通过GO、KEGG和蛋白互作网络进行生物信息学分析。【结果】成功构建pGEX-4T-1-PC-SlVQ6基因重组表达质粒,并获得带有GST标签的GST-SlVQ6融合蛋白,其分子量大小约为54 kD;将GST-SlVQ6和His-SlMPK1进行体外磷酸化试验,SlMPK1能够磷酸化SlVQ6,而作为阴性对照的GST与SlMPK1无相互作用,且SlVQ6不存在自磷酸化的现象,表明GST-SlVQ6和His-SlMPK1具有相互作用,且SlVQ6是SlMPK1的下游底物;以GST-SlVQ6融合蛋白为诱饵蛋白(空GST为阴性对照),利用pull-down试验筛选番茄叶片组织蛋白中与SlVQ6蛋白结合的蛋白,经SDS-PAGE分离、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)鉴定以及Mascot与蛋白数据库检索,共鉴定出37个与SlVQ6结合的蛋白,包括蛋白激酶Receptor for Activated C Kinase 1B(RACK1B),通过GO、KEGG和蛋白互作网络的生物信息学分析,表明这些蛋白参与多种信号通路,其中8个核糖体蛋白可能与高温胁迫密切相关。【结论】SlVQ6是SlMPK1的底物蛋白,且37个蛋白可能与SlVQ6互作,这些蛋白与胁迫反应有着密切的联系,可能会在提高番茄植株高温耐受性等方面发挥重要作用。     

拟南芥开花抑制基因TFL1的蛋白表达及纯化

TFL1基因是植物中的一个开花抑制基因,与促进植物开花的FT是同源基因,但是二者发挥相反的功能。本研究为了获得TFL1融合蛋白,首先将TFL1基因构建到PGEX-4T-3表达载体上,获得TFL1基因的原核表达载体PGEX-4T-3-GST-TFL1,转化大肠杆菌表达菌株BL-21(DE3)。在37℃,0.5mmol/L IPTG条件下诱导出了大小为46kD的GST-TFL1融合蛋白。经过GST纯化基质纯化后,获得了质量较高、并且能被TFL1抗体特异识别的GST-TFL1蛋白,为进一步研究TFL1的互作蛋白及其抑制植物开花的分子机制提供了一个十分有力的工具。     

差异显示法克隆水稻抗白叶枯病相关蛋白激酶基因(英文)

利用已知植物的蛋白激酶及抗病基因氨基酸序列,设计含激酶保守功能域的简并引物,运用ｍＲＮＡ差异显示技术显示经病原菌诱导的抗性品系（ＩＲ２６）及感病品系（金刚３０）愈伤组织ｍＲＮＡ表达差异,并对差异片段分子克隆．Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果提示克隆片段确受白叶枯病病菌诱导表达且该基因仅在抗性品系ＩＲ２６中存在高水平表达．     

蛋白激酶R的原核表达、纯化及多克隆抗体制备

【目的】构建蛋白激酶R的原核表达系统并制备其多克隆抗体.【方法】利用RT-PCR方法从人的A549细胞中扩增蛋白激酶R(PKR)基因,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,经纯化后制备特展异性多克隆抗体.【结果】PKR基因经测序鉴定后转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞,经终浓度0.5mmol/L IPTG诱导表达GST-PKR融合蛋白,SDS-PAGE分析表明融合蛋白获得稳定表达.表达产物经Glutathione-sepharose 4B亲和层析初步纯化后,用凝血酶切除GST标签,而后经离子交换层析及分子筛在AKTA Explorer上进一步纯化,得到高纯度无标签的PKR蛋白.以纯化后的PKR蛋白为抗原免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,斑点杂交试验检测其效价达到1∶50 000以上,Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)表明制备的多抗与PKR蛋白的反应具有高度特异性.【结论】PKR蛋白在大肠杆菌中成功表达,且制备的多克隆抗体可用于PKR蛋白的检测,从而为研究PKR在病毒感染过程中的作用提供了重要的工具.     

视黄酸诱导HL-60细胞分化后胞浆及核中蛋白激酶C活性和底物的改变

本文观察视黄酸诱导HL-60细胞分化后胞浆及核中蛋白激酶C活性和底物的变化。视黄酸诱导分化后,胞浆中蛋白激酶C活性升高,而核中则降低;胞浆中蛋白激酶C的底物减少,而核中蛋白激酶C底物的种类没有改变,但21kD的蛋白激酶C底物的磷酸化明显减弱。进一步分析表明,21kD蛋白是0.75mol/L高氯酸可溶蛋白。结果提示胞浆和核中蛋白激酶C及其底物的变化,可能与视黄酸对HL-60细胞的诱导分化作用有关。     

恶臭假单胞菌UW4中趋化受体蛋白的克隆、表达及鉴定

植物根际促生菌因其能够促进植物生长、防治病害的优势日益受到广泛关注,其研究主要集中在假单胞菌类,假单胞菌类在植物根际的定殖主要与趋化作用相关。本研究通过生物信息学软件对恶臭假单胞菌UW4的甲基趋化受体蛋白(MCPs)进行筛选,然后对其进行克隆和表达,结果表明:克隆得到的MCP1可稳定表达,通过对恶臭假单胞菌UW4的甲基趋化受体蛋白的纯化及分析其与不同配体物质的热力学作用强弱,以期找出恶臭假单胞菌特异性的趋化受体,进一步阐明其趋化机理,为恶臭假单胞菌对植物的促生效应提供理论支撑。     

凡纳滨对虾类泛素折叠修饰蛋白Ufm1基因

【目的】了解类泛素折叠修饰蛋白(Ufm1)的结构特征和蛋白功能,为进一步探究Ufm1基因功能提供参考。【方法】以同一生长性状分离凡纳滨对虾家系的肌肉组织为材料,构建凡纳滨对虾生长性状差减cDNA文库,通过斑点杂交筛选获得Ufm1基因,经全长cDNA文库筛选获得Ufm1基因全长序列。【结果】Ufm1基因全长cDNA序列长714 bp,包含261 bp的开放阅读框,推测编码的蛋白质为86个氨基酸,预测的分子量为9.3 ku,等电点pI为6.55;其编码蛋白无信号肽,无跨膜区域,可能定位于细胞质中,属于亲水性蛋白,含有1个酪蛋白激酶II磷酸化位点、1个N-糖基化位点、2个蛋白激酶C磷酸化位点;序列同源性分析表明,不同进化地位物种的Ufm1基因存在较高的同源性。【结论】Ufm1基因在系统进化上高度保守,这为进一步探究Ufm1基因功能及原核表达等奠定了基础。     

小麦组蛋白H1基因保守序列原核载体的构建及表达

采用PCR技术扩增TAT-H1bs融合基因,并通过基因操作构建了融合基因的原核重组载体pET-28a-TAT-Hlbs。将阳性重组质粒转化至受体菌Rosseta(DE3)感受态细胞中,以IPTG诱导表达,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和Western-blot检测。结果表明:重组菌能够表达目的蛋白,软件分析结果表明表达蛋白约占菌体蛋白的40%,上清表达量约为20%。上清蛋白经纯化后,Western-blot结果显示,His-Tag单克隆抗体可以很好地与所表达的蛋白带特异性结合。所获得的融合蛋白以高效胞质可溶形式表达。