猪冷冻精子的体外受精与单精子胞浆内注射

用猪冷冻精子进行体外受精和单精子胞浆内注射(ICSI),并研究添加L-半胱氨酸及不同成熟培养法对猪ICSI胚胎发育的影响。结果表明:用猪冷冻精子生产的ICSI胚胎卵裂率及囊胚发育率分别为68.3%和11.4%,均低于用冷冻精子进行体外受精(IVF)所获得的卵裂率和囊胚发育率(分别为76.9%和19.2%,P<0.05)。在培养液中添加1.71mmol·L~(-1) L-半胱氨酸培养3 h,无论是卵裂率、桑椹胚发育率,还是囊胚发育率,均未得到明显改善(P>0.05);采用含0.4%BSA的NCSU-23培养液进行猪卵母细胞成熟培养,ICSI胚胎卵裂率虽明显高,但各组所获胚胎发育率均无显著差异(P>0.05),表明所用卵母细胞的成熟方法并未对ICSI胚胎发育产生明显的影响;用颗粒细胞或卵丘细胞共培养ICSI胚胎后,卵裂率有明显提高(P<0.05),但各组囊胚发育率无统计学差异。     

不同解冻方法对猪精液冷冻效果的影响

以姜曲海种公猪冷冻精液为研究对象,观察了使用2种不同解冻方法对精液品质及体外受精胚胎发育的影响.试验结果表明,冷冻精液从液氮取出后,使用37℃水浴30s解冻在精子运动度、质膜完整率、顶体完整率和体外受精胚胎发育率方面均显著优于在室温放置20s后迅速投入37℃水浴10s解冻(P＜0.05).而与新鲜精液体外受精卵裂率和4细胞胚胎发育率相比,37℃水浴30s解冻方法与对照组无显著差异(P＞0.05).表明37.C水浴30s解冻方法优于室温放置20s后迅速投入37℃水浴10s解冻方法.     

玻璃化冷冻对猪卵母细胞体外发育能力的影响

采用猪未成熟(GV期)和体外成熟(MⅡ期)卵母细胞分组进行冷冻保护剂毒性试验,试验组经冷冻液处理,对照组不用冷冻液处理。结果表明,GV期与MⅡ期卵母细胞相比,两者经冷冻保护剂处理后,其存活率、体外受精胚卵裂率均无显著差异(P>0.05);试验组GV期卵母细胞存活率、体外成熟率及体外受精胚卵裂率虽略低于对照组(85.9%,72.4%和50.9%对91.3%,73.9%和53.3%),但差异不显著(P>0.05);试验组MⅡ期卵母细胞存活率虽显著低于对照组,但卵裂率与对照组无显著差异(P>0.05)。表明所用冷冻液及其处理程序,对卵母细胞无明显毒性。分3组对猪卵母细胞进行冷冻保存试验:I组为对照组;II组为GV期卵母细胞冷冻组;III组为MⅡ期卵母细胞冷冻组。结果表明,经开放式拉管(Open pulled straw,OPS)法玻璃化冷冻后,GV期和MⅡ期卵母细胞均获得较高的形态正常率,但GV期卵母细胞冷冻后存活率要显著高于MⅡ期卵母细胞(P<0.05)。经玻璃化冷冻后,GV期卵母细胞的体外成熟率和卵裂率均明显低于新鲜卵母细胞(42.6%和7.79%对73.9%和53.3%,P<0.05),MⅡ期卵母细胞冷冻-解冻后未获得卵裂。在GV期卵母细胞冷冻组,154枚卵母细胞冷冻后经体外成熟、体外受精及体外培养,共有12枚发生卵裂,其中6枚发育至8-细胞,3枚发育至16-细胞,3枚发育至桑椹胚。本研究表明,所用冷冻方案更适合于猪GV期卵母细胞的冷冻保存。     

不同促精子活动剂对水牛卵母细胞体外受精及随后胚胎发育的影响

主要探讨精子活动促进剂对水牛Bubalus bubalis卵母细胞体外受精及随后胚胎发育的影响. 来自屠宰场水牛卵巢的卵母细胞和卵丘细胞复合体,在体积分数为5%CO2 的培养箱中培养24～26 h,然后通过体外受精测定其受精和胚胎发育能力. 试验1解冻的精子用50 g/mL的胰蛋白酶处理30 min,然后进行受精;试验2受精在含不同浓度咖啡因 (0, 2.5, 5.0 和 10.0 mmol/L)的受精液中进行;试验3在含不同浓度的钙离子载体A23187 (0, 0.1, 1.0 和 2.5 μmol/L)的受精液中进行体外受精;试验4在PHE、咖啡因和A23187不同组合(空白, PHE, PHE+2.5 mmol/L咖啡因+2.5 μmol/L A23187和PHE+2.5 μmol/L A23187) 的受精液中进行体外受精. 试验结果表明,精子用胰蛋白酶处理后的受精卵囊胚发育率显著下降 (12.5%和2.6%,P<0.05),而用咖啡因和钙离子载体A23187处理,对卵母细胞的卵裂率和囊胚发育率没有明显影响. 在体外受精中PHE和钙离子载体的组合使用能提高受精卵的胚胎发育率,而高浓度的咖啡因则降低卵母细胞的卵裂率和胚胎发育率.     

不同解冻温度对精子活力的影响

温度是精子最敏感的外界因素之一。人们的注意力多集中在稀释液和冷冻方法的研究,对冷冻精液的解冻方法和技术的研究不足。但实践证明,牛精液冷冻效果好坏与解冻温度有很大关系。长期以来,人们沿用冷冻精液的解冻温度38～40℃解冻冷冻精液。为此,可以通过本试验了解不同解冻温度对牛冷冻精子复苏的影响,找出适宜牛细管冷冻精液的最佳解冻温度。     

猪卵泡卵母细胞体外受精研究

采用３种获能方法（常规获能法、肝素获能法、钙离子载体获能法）进行猪冷冻附睾精子的外获能研究，其相应的受精率分别为４２．５％，３２．０％，３０．８％，卵裂率分别为１８．６％，１５．７％，１６．１％，受精率、卵裂率间均无显著差异。精子与ＳＭＴ－ＰＧＨ基因质粒混合培养后引起卵裂率下降，实验组的卵裂率（７．５％）显著地低于对照组的水平（２１．０％）．３９℃与３７℃下受精，其受精率分别为３８．８％，１８．７     

猪卵母细胞体外受精影响因素的研究

探讨了m TBM中咖啡因浓度、精子上浮时间和精卵孵育时间对猪卵母细胞体外受精胚胎早期发育的影响。结果表明:咖啡因的添加浓度对猪卵母细胞体外受精胚胎的囊胚率无显著影响,但添加3 mmol/L咖啡因组的精子入卵率显著高于添加5 mmol/L咖啡因组和未添加咖啡因组的(P<0.05);随着精子上浮时间的延长,受精卵卵裂率和囊胚率均呈先上升后下降的趋势,上浮1.0 h组的卵裂率和囊胚率显著高于上浮1.5 h组和2.0 h组的(P<0.05);精卵共孵育时间对精子入卵率无显著影响,但受精9 h处理组的囊胚率显著低于受精3 h组和6 h组的。     

猪卵母细胞体外受精影响因素的研究

探讨了m TBM中咖啡因浓度、精子上浮时间和精卵孵育时间对猪卵母细胞体外受精胚胎早期发育的影响。结果表明:咖啡因的添加浓度对猪卵母细胞体外受精胚胎的囊胚率无显著影响,但添加3 mmol/L咖啡因组的精子入卵率显著高于添加5 mmol/L咖啡因组和未添加咖啡因组的(P0.05);随着精子上浮时间的延长,受精卵卵裂率和囊胚率均呈先上升后下降的趋势,上浮1.0 h组的卵裂率和囊胚率显著高于上浮1.5 h组和2.0 h组的(P0.05);精卵共孵育时间对精子入卵率无显著影响,但受精9 h处理组的囊胚率显著低于受精3 h组和6 h组的。     

猪卵泡卵母细胞体外受精研究

采用３种获能方法（常规获能法、肝索获能法、钙离子载体获能法）进行猪冷冻附睾精子的体外获能研究，其相应的受精率分别为４２．５％，３２．０％，３０．８％，卵裂率分别为１８．６％，１５．７％，１６．１％。受精率、卵裂率间均无显著差异。精子与ＳＭＴ－ＰＧＨ基因质粒混合培养后引起卵裂率下降，实验组的卵裂率（７．５％）显著地低于对照组的水平（２１．０％）．３９℃与３７℃下受精，其受精率分别为３８．８％。１８．７％；多精受精率分别为８９％，３０．７％；卵裂率分别为２６．９％，３．７％，３９℃组的受用率、卵裂率均显著高于３７℃组水平，而多精受精率则极显著地低于３７℃组。发育培养液Ａ液、Ｂ液中的卵裂率分别为２４．３％，１３．０％，两者无差异。在兔输卵管内培养猪体外受精卵，卵裂率为４６．７％，极显著地高于对照组水平（１０．９％）．受精卵体外培养１６～１７ｈ后离心，可观察到１８．４％的原核形成率，这与受精卵体外培养的卵裂率（１９．５％）相当。     

猪精子的体外获能与体外受精

通过5个实验研究了应用咖啡因，肝素和I－A23187促进猪精子体外获能的效果，比较了不同受精次数和不同种类的精液进行猪卵子体外受精的效果，试验表明，用肝素和咖啡因协同作用，猪精子体外获能的效果好，采用2－3次受精法进行体外受精可以提高受精率，使用新鲜精液，新鲜附睾精液或冷冻附睾精液进行体外受精，其效果差异不显著。     

猪体外胚胎生产的研究进展

与牛羊等动物的体外胚胎生产（in vitro production，IVP）技术相比，猪IVP技术尚不成熟。猪IVP主要存在卵母细胞的细胞质成熟差、多精子受精率高和胚胎质量差的问题，这严重制约了该繁殖生物技术在转基因猪生物反应器领域的应用。笔者在查阅近10年的国内、外相关研究后，从如何优化猪卵母细胞的体外成熟（in vitro maturation，IVM）、体外受精（in vitro fertilization，IVF）和胚胎的体外培养（in vitro culture，IVC）3个方面进行了探讨。     

生长激素和胰岛素对猪卵母细胞体外成熟及卵裂的影响

研究了生长激素(STH)、胰岛素(insulin)单独或者联合作用对猪卵母细胞体外成熟及孤雌激活后卵裂的影响。结果表明:STH、胰岛素对卵母细胞体外成熟及孤雌激活后卵裂呈现双重效应。在mNCSU-23基础液中添加0.15μg/mLSTH组的成熟率和卵裂率显著高于对照组及0.01,0.05,0.1,2μg/mL组(P<0.05);添加5μg/mL,8μg/mL胰岛素组的成熟率显著高于对照组及0.5,2,10μg/mL组;添加5μg/mL胰岛素组的卵裂率也显著高于对照组及0.5,2,8,10μg/mL组;0.15μg/mLSTH与2μg/mL胰岛素联合添加组的成熟率和卵裂率最高,同其他组相比,差异显著。     

奶牛卵母细胞体外受精和胚胎培养研究

[目的]探讨适合于奶牛体外胚胎生产的最佳条件。[方法]以奶牛卵母细胞为试验材料,研究不同温度、运送时间对奶牛卵母细胞成熟的影响,并比较在相同培养条件下孤雌激活和体外受精对奶牛卵母细胞胚胎发育的影响。[结果]卵巢在37—42℃运输后的成熟率（11．3％）明显低于20—30℃、30-37℃的成熟率（79．3％,85．1％）,20～30℃、30～37℃组间差异不显著;运送时间6h后的卵母细胞成熟率（53．2％）明显低于4h内、4—6h的成熟率（85．6％,77．8％）,4h内、4～6h差异不显著;孤雌激活和体外受精胚胎在相同条件下的卵裂率（72．41％,68．18％）、8细胞率（45．24％,47．22％）、囊胚率（25．60％,18．89％）差异均不显著。[结论]卵巢在30℃左右4h内运回实验室最适宜,而孤雌激活和体外受精胚胎在相同条件下发育率差异不显著。     

不同培养体系对牛卵母细胞体外受精的影响

[目的]探讨适合于牛卵母细胞体外受精以及受精卵体外培养的最佳培养体系。[方法]通过对成熟的牛卵母细胞分别采用传统培养体系（对照组）和过渡培养体系（试验组）进行体外受精和受精卵体外培养,研究了不同组合的培养体系对受精率和卵裂率的影响。[结果]以受精液为TALP液,受精卵培养液为60%TALP液＋40%M-199液＋5%FCS的过渡培养体系能够提高牛体外成熟卵母细胞的受精率和卵裂率,分别为77.8%和55.6%。[结论]受精液为TALP液,受精卵培养液为60%TALP液＋40%M-199液＋5%FCS的过渡培养体系为牛卵母细胞体外受精以及受精卵体外培养的最佳培养体系。     

猪卵丘卵母细胞复合体和裸卯中卵母细胞发育及基因表达差异的研究

【目的】研究探讨卵丘细胞的完整性在支持和促进猪卵母细胞成熟过程中发挥的重要作用以及卵丘与卵母细胞互作的分子机理。【方法】对具有完整致密卵丘细胞包裹的和无卵丘细胞包裹的猪卵母细胞进行了体外成熟培养试验,应用mRNA差异显示（DDRT-PCR）和半定量反转录PCR技术（RT—PCR）,对这2类猪卵母细胞中mRNA的差异表达进行研究,得到了14条差异表达条带,经过回收、克隆、测序后,再运用半定量（RT-PCR）进行检测。【结果】体外培养的裸卵细胞的各项成熟指标均低于卵丘-卵母细胞复合体。3个基因（PELP1,Myo5b and CAST）和一条新EST序列在有卵丘和无卵丘的猪卵母细胞中表现出差异表达。分离得到的差异表达基因在雌激素受体调节、细胞膜间的信息传导和细胞器物质运输等过程中发挥重要的作用。【结论】这些差异基因可能参与了卵丘细胞与卵母细胞间的相互作用,对卵母细胞的成熟具有重要作用。     

猪卵丘卵母细胞复合体和裸卵中卵母细胞发育及基因表达差异的研究

 【目的】研究探讨卵丘细胞的完整性在支持和促进猪卵母细胞成熟过程中发挥的重要作用以及卵丘与卵母细胞互作的分子机理。【方法】对具有完整致密卵丘细胞包裹的和无卵丘细胞包裹的猪卵母细胞进行了体外成熟培养试验,应用mRNA差异显示（DDRT-PCR）和半定量反转录PCR技术(RT-PCR),对这2类猪卵母细胞中mRNA的差异表达进行研究,得到了14条差异表达条带,经过回收、克隆、测序后,再运用半定量（RT-PCR）进行检测。【结果】体外培养的裸卵细胞的各项成熟指标均低于卵丘-卵母细胞复合体。3个基因（PELP1,Myo5b and CAST）和一条新EST序列在有卵丘和无卵丘的猪卵母细胞中表现出差异表达。分离得到的差异表达基因在雌激素受体调节、细胞膜间的信息传导和细胞器物质运输等过程中发挥重要的作用。【结论】这些差异基因可能参与了卵丘细胞与卵母细胞间的相互作用,对卵母细胞的成熟具有重要作用。     

猪卵母细胞冷冻保存研究

【目的】本研究试图通过比较猪卵母细胞超低温冷冻保存方法、冷冻承载工具、冷冻卵母细胞的类型，从而有效地保存猪卵母细胞;【方法】利用屠宰场卵巢采集的卵母细胞，以台盼蓝染色、二乙酸荧光素（FDA）染色鉴定卵母细胞冷冻后的成活率，以体外成熟和体外受精鉴定卵母细胞冷冻后的发育能力，研究了不同冷冻方法和不同冷冻保护剂对猪卵母细胞的冷冻效果。【结果】（1）程序化法冷冻保存中，9%乙二醇（EG），10%二甲基亚砜（DMSO），10%甘油（Gly）均对猪MII期卵母细胞有冷冻保护作用，极显著高于对照组（FDA染色成活率33.8%，25.8%，23.5% vs 2.5%，P <0.01），且以9%EG的效果最好，显著高于另外两组（ 33.8% vs 25.8%，23.5%, P <0.05）。（2）玻璃微细管（GMP）法是猪卵母细胞超低温冷冻的较好方法，以普通的麦管（Straw）法进行的程序化冷冻为对照组，GMP管法显著提高猪卵母细胞的冷冻成活率（分别为63.3%和34.5%，P<0.05）。（3）在玻璃化冷冻方法中，不同的冷冻液载体对猪卵母细胞冷冻成活率有影响。以EFS40为冷冻液，Straw和GMP管作冷冻液载体，卵母细胞的成活率分别为45.0%和65.9%，二者差异显著（P <0.05）。（4）用Straw的程序化冷冻法和用GMP管的玻璃化冷冻法对猪GV期卵母细胞冷冻均有效，但二者差异显著（成活率分别为30.0%和59.7%，P<0.05）。冷冻后继续培养，分别有2.8%和6.3%的卵母细胞周围颗粒层发生扩散。（5）冷冻对MII期卵母细胞的发育潜能影响较大，用新鲜精液使其受精，仅有4.9%的受精卵分裂，极显著低于对照组的49.5%（P<0.01）；发育至4-细胞期的比例为1.7%，但未能发育至8-细胞期以上胚胎。【结论】选用MⅡ期卵母细胞、以GMP管为冷冻承载工具、应用玻璃化冷冻方法能够较好地保存猪卵母细胞，为进一步完善猪卵母细胞超低温冷冻保存技术体系提供了参考依据。     

猪卵母细胞胞质内单精子注射影响因素的研究

探讨了猪卵母细胞胞质内单精子注射(ICSI)的有关影响因素。结果表明:在本实验室条件下,在体外成熟液中添加30 ng/mL的EGF可以明显促进ICSI胚胎的后续发育(P<0.05);当精子操作液中PVP浓度为20%时可以显著促进ICSI胚胎的后续发育(P<0.05);操作液中添加5μg/mL的CB对ICSI胚胎的发育没有显著影响。     

哺乳动物卵泡卵母细胞的体外受精

对近年来哺乳动物受精机理及其体外受精的研究进展加以详细的概述，对精子获能及体外受精的适宜条件进行了探讨。