组织纤溶酶原激活物的分离纯化

用亲和层析法从猪心组织分离纯化纤溶酶原激活物(tissue type plasminogen activator,t—PA),以纤维     

固相两步法测定血浆组织型纤溶酶原活化物活性

本文参考国外文献建立了检测血浆t—PA活性的固相两步法。用该法测得t—PA含量与吸光度呈线性关系,相关系数γ=0.99。重复试验:在154份样品双份平行测定中,每份两次测定结果之差,最高相差15.     

固相──液相两步法测定血浆组织型纤溶酶原激活物( t—pA)活性及临床应用

用国产试剂建立了固相─液相两步法测定血浆组织型纤溶酶原激活物（ ｔ－ＰＡ）活性。对液相法与固相法作了比较。对保温时间以及重复试验等进行了探讨。本法避免了两步催化反应同时进行的缺点，易得到直线的定量关系，方法简单。重复性好，证明了国产试剂可靠，亦可制成试剂盒，便于临床检测应用。在临床检测中，老年对照组血浆ｔ—ＰＡ活性比正常青年组要低（Ｐ ＜０．０５）。与老年对照组比较，脑血栓形成组与心肌梗塞者有较明显降低（Ｐ＜０．０５），在伴有原发或继发性纤溶亢进的患者，如产后大出血、子痫、绒癌及中毒性休克患者的血浆ｔ－ＰＡ活性明显增高。     

结肠癌组织中中期因子、尿激酶型纤溶酶原激活物的表达及意义

目的了解结肠癌组织中中期因子（MK）、尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）表达及其与结肠癌临床病理特征的关系。方法收集55例病理学确证的结肠癌组织标本（病例组）和30例结肠癌癌旁的正常组织标本（对照组）,采用免疫组织化学方法（SP法）检测其MK、uPA的表达。结果病例组中MK、uPA表达率分别为56.36%、61.82%,对照组分别为13.33%、16.67%,两组的差异均有统计学意义（P〈0.01）。结肠癌组织中MK、uPA表达与癌组织的分化程度、浸润深度、淋巴结转移有相关性,而与性别和年龄无相关性。MK与uPA表达呈正相关（r=0.44,P〈0.05）。结论 MK、uPA表达与结肠癌侵袭、转移密切相关,二者联合检测可作为判断结肠癌发展及预后的指标。     

血浆中纤溶酶原抗原量与活性同时检测的临床意义

用本室建立的纤溶酶原活性发色底物检测法与抗原量火箭电泳检测法,对39例正常人与94例孕妇及各类病人血浆纤溶酶原活性与抗原量的相关关系进行分析,结果表明,相关数γ=0.91。增高组(孕妇)及降低组     

组织纤溶酶原激活物(tPA)的特性及其单克隆抗体的应用(综述)

自从Astrup等1947年首先提出“组织纤溶酶原激活物”(tissue—plasminogen activator,tPA)这个概念以来,高纯度的tPA制品已从猪心、猪卵巢、人子宫、Bowens黑色素细胞瘤株及重组DNA技术中获得。tPA对纤维蛋白具有高度亲和力,在体内血栓形成时能选择性地结合到血凝块上,激活纤溶酶溶解血栓,而不影响全身纤溶状态。正是由于tPA具有亲血凝块、无抗原性、半衰期短以及近年来可应用重组技术产生     

单向火箭电泳法测定人血浆纤溶酶原

本文从人血浆中分离纯化了纤溶酶原(plg),制备了兔抗人纤溶酶原抗血清,建立了单向火箭电泳法测定人血浆plg.本法测得39例正常人血浆plg含量为234.3±26.8mg/L,24例正常孕妇为317.±37.0mg/L,8     

组织型纤溶酶原激活剂cDNA真核表达质粒的构建与鉴定

将组织型纤溶酶原激活剂基因ｃＤＮＡ经多次亚克隆插入到真核表达载体ｐＳＶＬ的ＳＶ４０启动子和ｐｃＤＮＡ３的ＣＭＶ启动子下游,构建了重组表达质粒ｐＳＶＬ－ｔＰＡ和ｐｃＤＮＡ３－ｔＰＡ。经酶切和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定,ｔ－ＰＡ基因的插向正确,可用于哺乳动物细胞和个体表达系统中表达。     

微量发色底物法测定人血浆中纤溶酶原

我室利用发色三肽底物(东风试剂厂S—410450)建立了用酶标板检测人血浆中纤溶酶原活性的方法。用 尿激酶为激活物,较链激酶激活的读数虽低(约为1:25),但重复性好仍可满足临床要求。批内误差4.1％,批     

纤溶酶原的分离纯化与抗血清的制备

纤溶酶原的分离纯化:经硫酸铵分段盐析、透析、Lys—Sepharose4B亲和层析、超滤浓缩、Sephadex G—15脱盐,从90ml人血浆中可分离制得8.03mg的纤溶酶原。SDS—PAGE电泳显示单一区带,分子量84400     

尿激酶型纤溶酶原激活剂作用系统与肿瘤侵袭及转移

肿瘤细胞发生侵袭、转移与其自身分泌蛋白酶降解细胞外基质密切相关。目前 ,在已知的蛋白酶中 ,丝氨酸蛋白酶类备受关注。其中 ,尿激酶型纤溶酶原激活剂 (urokinase- typeplasminogen activator,u PA)与肿瘤转移的关系已成为当今研究的热点之一。它与其受体 (u PAR)、抑制剂 (PAI)所形成的作用系统在肿瘤侵袭转移中起着重要的作用 ,它不但激活纤溶酶原直接降解大多数的细胞外基质 ,而且还激活金属蛋白酶间接参与细胞外基质成份的降解作用。本文对 u PA作用系统中的主要组分及其在肿瘤、转移中作用的研究概况作一综述。1　 u PAu PA是…     

纤溶酶原激活物抑制剂-1在疾病诊断中的研究进展及在动物疾病诊断的应用前景

纤溶酶原激活物抑制剂-1(Plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)是尿激酶型纤溶酶原激活物(U-rokinase-type plasminogen activator,uPA)和组织型纤溶酶原激活物(Tissue-type plasminogen activator,tPA)的内...     

人组织型纤溶酶原激活剂原核表达载体的构建及在大肠杆菌中的初步表达

目的:构建人组织型纤溶酶原激活剂(tissue-type plasminogen activator,tPA)原核表达载体,检测其在大肠杆菌Escherichia coli中的初步表达.方法:以含有人tPA基因的质粒为模板,设计引物扩增出含有RGDS-tPA基因并构建到原核表达载体pET28a中,测序证实为正确的rtPA序列,并将pET28a-tPA转化至菌株E.coli BL21(DE3).用IPTG诱导rtPA在E.coli中表达,并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行验证.结果:琼脂糖凝胶电泳获得目的基因片段tPA的条带约在1 700bp处,鉴定为阳性重组体;聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定获得目的蛋白片段rtPA的条带约53KDa,为非活性的包涵体.结论:人组织型纤溶酶原激活剂原核表达载体构建成功,可在大肠杆菌中有效表达.     

对蚯蚓纤溶酶的性质和纤溶活性的研究

从蚯蚓组织中分离纯化出一种纤溶酶。研究表明,其最适pH值为80,最适温度为57℃,热稳定性较好,金属离子Na+,K+,Mg2+等可提高此酶的活力,而Hg2+,Ca2+等对此酶有一定的抑制作用。采用平板法测定此酶的血纤维蛋白溶解活性,证明此酶具有强烈的纤溶活性。     

发色底物法测定纤维蛋白溶酶原活性及其临床应用

本文对发色底物测定纤维蛋白溶酶原(Plg)活性的方法,动力法或称连续检测法和两点法或称终止法在方法学上的一些问题进行了探讨,并对某病例进行检测.两种方法比较示:动力法简便,节省试剂,便于自动     

人微小纤溶酶原cDNA在毕赤酵母中的高效表达及活性检测

【目的】人微小纤溶酶原是由261个氨基酸组成的肽链,位于人纤溶酶原第549～790位,含有纤溶酶原活性区域,被激活后具有纤溶活性,能够降解纤维蛋白。本文旨在优化人微小纤溶酶原cDNA在毕赤酵母中的表达条件。【方法】在NCBI中获取人微小纤溶酶原氨基酸序列,根据毕赤酵母密码子偏爱性原理,设计对应的DNA序列,然后进行人工合成。合成的基因序列经测序验证后酶切与表达载体pPICZαA连接形成重组表达质粒pPICZαA-mPlg,转入大肠杆菌JM109中扩增质粒,提取阳性菌落中的重组质粒,双酶切获得人微小纤溶酶原的表达单元,然后构建4拷贝(表达单元)pPICZαA-mPlg,单酶切线性化质粒。然后电转化导入感受态毕赤酵母SMD1168中,经表型筛选、PCR筛选阳性克隆,获得高表达人微小纤溶酶原工程菌。培养工程菌后,甲醇诱导工程菌细胞让人微小纤溶酶c DNA表达,用SDS-PAGE检查其分子量,发色底物法检测微小纤溶酶原活性,通过发酵条件优化提高人微小纤溶酶原的产量,用SP-Sepharose fast flow凝胶层析方法纯化目标蛋白。【结果】SDS-PAGE检测到符合人微小纤溶酶原分子量大小的蛋白条带,同时发色底物法检测出样品中含有纤溶活性,其水平达到90 U/mL。【结论】本文为后续进行大规模表达人微小纤溶酶原打下了基础。     

对蚯吲纤溶酶的性质和纤溶活性的研究

从蚯蚓组织中分离纯化出一种纤溶酶。研究表明,其最适pＨ的值为８．０,最适温度为５ ．７℃,热稳定性较好,金属离子Ｎa＾＋,Ｋ＾＋,Ｍg＾２＋等可提高此酶的活力,而Ｈg＾２＋,Ｃa＾２＋等对此酶有一定的抑制作用。采用平板法测定此酶的血纤维蛋白溶解活性,证明此酶具有强烈的纤溶活性。     

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)(1354-1802)的原核表达及抗血清制备

[目的]制备人组织型纤溶酶原激活剂t-PA(1354-1802)抗血清,并测定其效价,为深入研究t-PA基因功能奠定基础。[方法]利用基因克隆技术获得t-PA(1354-1802)催化域基因片段,然后将其重组到pET-32a(+)质粒中,进行鉴定及序列分析;将测序正确的阳性质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导、蛋白纯化及免疫兔试验。[结果]SDS-PAGE结果显示,37 kD处出现特异性条带;对该融合蛋白进行分离纯化后免疫新西兰兔,制备t-PA蛋白抗血清,Western blot分析表明,抗血清可与标准品t-PA蛋白特异性结合,间接ELISA方法检测抗血清的效价可达到1∶12 800。[结论]成功制备了t-PA(1354-1802)抗血清,为t-PA基因功能的深入研究奠定了基础。     

尿激酶型纤溶酶原激活剂系统在鼻咽癌细胞系及其两个克隆株中的表达和意义

目的：研究尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)系统3种主要成分(uPA、uPAR、PAI—1)在一鼻咽癌细胞系(CEN—2Z)及其它的两个克隆株(CNE—2Z—H5、CNE—2Z—H5—9)中的作用。方法：应用逆转录聚合酶反应(RT—PCR)方法检测uPA系统各因子在基因转录水平的表达。结果：uPA，uPARmRNA在CNE—2Z—H5—9中表达最高，在CNE—2Z中表达最低；PAI—1mRNA在CNE—2Z—H5—9中无表达，在CNE—2Z，CNE—2Z—H5有表达，但差异无显若性。结论：uPA、uPAR可能促进鼻咽癌细胞侵袭、转移，PAI—1可能起抑制作用。     

高纤溶活性黄芪豆豉发酵条件的优化

[目的]确定黄芪与大豆共发酵制备一种具有高纤溶活性黄芪豆豉的最优发酵工艺。[方法]以黄芪水提液浸泡大豆作为发酵基质,以淡豆豉来源的4株枯草芽孢杆菌作为发酵菌株,以纤溶酶活性为考察指标,通过对发酵菌株的筛选、黄芪提取液的浓度和比例以及发酵时间的考察,筛选最优发酵工艺。[结果]黄芪豆豉的最优发酵工艺:黄芪水提液浓度为75 mg/mL,黄芪水提液与大豆的比例为1∶1(mL∶g),最优发酵菌株为DCT-1,于37℃发酵36 h。[结论]黄芪与大豆共发酵制备黄芪豆豉,既提高了豆豉的纤溶酶活性,又兼具黄芪的补气功效,提供了一种具有益气活血作用的食疗产品。