乳杆菌乳糖酶的基因异源表达及酶学性质分析

采用简并引物PCR和TAIL-PCR方法,从乳杆菌Lactobacillus sp. B164中克隆得到一个乳糖酶基因bg42-164。基因全长2 031 bp,编码676个氨基酸和一个终止密码子,预测分子量76 kDa,无信号肽序列。将bg42-164连接pET-30a(+)载体并转入大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达后可检测到乳糖酶活力。SDS-PAGE分析乳糖酶BG42-164的蛋白分子量为76 kDa,使用组氨酸标签亲和层析方法进行蛋白纯化,并对纯化的乳糖酶BG42-164进行了酶学性质分析。该酶最适反应温度为50℃,经50℃处理30 min后,剩余酶活力保留80%以上,pH 6.0时该酶的水解活力最高。牛奶水解试验表明,乳糖酶BG42-164对乳糖的水解效果良好,5 mL牛奶中添加250 U酶蛋白,在50℃条件下2 h乳糖水解率为100%。该酶温度范围宽,乳糖水解效果好,为其在低乳糖奶生产中应用奠定了理论基础。     

嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶酶学性质研究

对获得的嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶进行了酶学性质测定.结果表明:普鲁兰酶最适温度为60℃,此温度下处理90min,残存酶活在70%以上,70℃酶的半衰期大于50min;最适pH 5.6,在pH 4.5~6.0的范围50℃保温24h仍具有较高活性;Km为0.036μmol/L,Vmax为20.16μmol/min;Mn2+、Mg2+和Ca2+对酶有激活作用,其中以Mn2+的激活作用最强,而Cu2+和Zn2+则有抑制作用.研究表明嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶是高温酸性酶,对底物有较强亲合力和催化活性,在淀粉糖化工业中有良好的应用前景.     

苏云金芽孢杆菌普鲁兰酶编码基因amyX的鉴定与重组酶性质研究

[目的]研究苏云金芽孢杆菌konkukian亚种amyX基因在大肠杆菌中的表达及表达产物的性质。[方法]以苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)染色体DNA为模板,PCR扩增得到amyX普鲁兰酶结构基因,再与大肠杆菌表达载体pET28a连接,构建能表达普鲁兰酶的重组大肠杆菌。重组菌经IPTG诱导,表达有活性的普鲁兰酶,初步分析重组普鲁兰酶的酶学性质。[结果]结果表明,苏云金芽孢杆菌基因组序列有两条基因(pulA和amyX)可能编码普鲁兰酶。温度为50℃,pH为6.0时,重组酶不能水解淀粉,属于I型普鲁兰酶。[结论]amyX基因能在大肠杆菌细胞内成功表达,表达产物具有典型的I型普鲁兰酶的特性。     

耐酸、耐热普鲁兰酶产生菌的筛选及酶学性质研究

利用选择性筛选方案从啤酒厂附近土壤样品中获得两株耐酸、耐热普鲁兰酶产生菌(PPL3和PPLA),16S rRNA基因系统发育分析结果显示,PPL3和PPL4均为芽孢杆菌。酶学性质分析结果显示,最适pH值和最适温度均为7.0和90℃,粗酶液在pH值为5.0和90℃的条件下放置10 h后残余酶活仍分别保持在85%和80%以上,对酸和热表现出很好的稳定性。     

芽孢杆菌BSC6-1中纤维素酶基因的异源表达及酶学性质

从土壤中筛选获得1株高产纤维素酶的芽孢杆菌BSC6-1,为了进一步研究其纤维素酶的性质,克隆表达来自BSC6-1的新的纤维素酶基因Celbsc6,并通过纯化后用于酶学性质的研究。结果表明:成功在大肠杆菌中异源表达,该基因的表达产物为50kDa的蛋白。在70℃条件下酶活力保持80%以上,当pH 7~8时内酶活力保持在94%以上。证明,重组纤维素酶Celbsc6具有良好的热稳定性和pH稳定性。最佳的酶促反应条件为55℃和pH 7.5,镁离子浓度10mmol/L。在该条件下Celbsc6的米氏常数,Km值为7.89×10-3 g/mL,最大反应速率Vmax为0.11μmol/(L·s)。     

一种新型糖苷水解酶的异源表达及酶学性质研究

为得到MtGH6最优的表达宿主,构建了质粒pET21a–MtGH6、pBES–MtGH6、pPICZαA–MtGH6,以大肠埃希菌BL21、枯草芽孢杆菌RIK1285及毕赤酵母GS115为工程菌,对MtGH6进行异源表达及分离纯化,并对表达MtGH6的3个宿主菌的生长状况、产酶量、纯化回收率、酶活力等参数进行比较分析。结果表明：大肠埃希菌BL21及枯草芽孢杆菌RIK1285在生长稳定后,OD值维持在1.5,而毕赤酵母GS115生长稳定后,OD值维持在2.0;毕赤酵母GS115生产的MtGH6为77mg/L,纯化回收率为15.40%,产酶量和纯化回收率均高于大肠埃希菌BL21、枯草芽孢杆菌RIK1285生产的MtGH6;由毕赤酵母GS115表达的MtGH6的酶活力为15.60U/mg,由大肠埃希菌BL21及枯草芽孢杆菌RIK1285表达的MtGH6分别为7.45、10.06U/mg,说明毕赤酵母GS115是MtGH6的最优表达宿主;对其分泌的MtGH6的酶学性质展开研究,结果表明在降解微晶纤维素的反应中,该酶最适pH为8.0,最适温度为60℃,添加0.5 mmol/L Mn2+可使其活性...     

产普鲁兰酶菌株ZXYG5的分离鉴定及其普鲁兰酶活性

通过以支链淀粉为唯一碳源的分离培养基和以普鲁兰糖为唯一碳源的鉴别培养基复筛,从烟草甲(Lasioderma serricorne)肠道中分离得到一株产普鲁兰酶菌株,编号为ZXYG5.该菌株在以普鲁兰糖为碳源的产酶培养基35℃、160 r·min~(-1)条件下发酵42 h时,普鲁兰酶活性达到最大值4.2 U·m L~(-1).通过光学显微镜和扫描电子显微镜的形态观察、生理生化特性和16S r DNA保守序列分析,将菌株ZXYG5初步鉴定为泛菌属Pantoea sp.,命名为Pantoea sp.ZXYG5.该菌株具有较高的初始产普鲁兰酶活性,可作为常规诱变育种和全基因组育种的良好备选菌株.     

细菌Ⅰ型普鲁兰酶的研究进展

Ⅰ型普鲁兰酶以内切的方式专一性作用于普鲁兰糖或者支链多糖的α-1,6糖苷键,生成产物麦芽三糖或线性多糖。在工业应用中,Ⅰ型普鲁兰酶与其他糖苷水解酶协同作用于不同糖类底物,可得到类型多样的终产物,因此在食品、化工、制药等行业中有很重要的作用。目前对Ⅰ型普鲁兰酶的研究不仅包括筛选高产酶的菌株,还需得到酶学性质优良的酶蛋白,以适合工业生产工艺。综述了细菌来源的Ⅰ型普鲁兰酶的研究概况,包括酶学性质、基因的分离与克隆、微生物生产,并讨论了该酶在工业生产中的应用及其研究前景。     

漆酶基因异源表达及其酶活性的研究进展

近年来由于漆酶在生物漂白和农作物秸秆利用等方面具有广阔的应用前景,对漆酶的研究越来越受到国内外学者的重视。然而,自然界漆酶的产量和酶活较低,难以适应工业化生产需求。此外,漆酶的产酶效率低,成本高。实现漆酶的异源高效表达是解决这一问题的有效途径。目前,国内外已有多种来源的漆酶基因被成功克隆,并在不同的宿主细胞中实现异源表达,但迄今为止漆酶基因异源表达结果仍然不理想,离真正实现漆酶的高效表达还有一定距离。     

一种新颖的毕赤酵母酸性蛋白酶基因的克隆和异源表达以及酶学性质研究

采用基因克隆方法获得酸性蛋白酶基因,在毕赤酵母KM71表达系统中进行表达,并将重组酵母酸性蛋白酶rPrA经过浓缩后研究其酶学性质,初步探究了rPrA对大豆蛋白和酪蛋白的水解情况.结果表明:经过异源表达后的重组毕赤酵母酸性蛋白酶分子量约为44 ku,在pH3.0的发酵条件下酶活最高,可达46.92U/mL.该酸性蛋白酶的最适pH值为3.0,最适温度为35℃.Mn2+对该酶活性有激活作用,多种金属离子对该酶有抑制作用;0.1 mmol/L的Pepstain A即可完全抑制酶活,说明此重组酶的活性中心有天冬氨酸残基.对大豆蛋白和酪蛋白的初步水解试验可知,当E/S为4 000 U/g时,此重组酶对大豆分离蛋白和酪蛋白的水解度分别为9.0％和8.34％.优化发酵条件以及与多种蛋白酶进行复配,该重组蛋白酶将在蛋白水解中有很好的应用前景,有望应用到畜禽饲料加工行业.     

柿单宁酶PsnTanA异源表达及酶学特性表征

单宁酶在食品、饲料和制药等领域具有巨大应用潜力。本研究通过对柿树单宁酶基因PsnTanA进行密码子优化,使得该基因的GC含量由60.2%调整到57.1%,CAI值由0.62调整到0.76,优化前后基因序列的一致性为78.3%。单宁酶PsnTanA经大肠杆菌BL21表达后,重组酶PsnTanA在40℃和pH 7.0下表现出最大活性,比酶活力为1.53 U/mg,表观分子量约为39 kD。多种金属离子抑制了重组酶PsnTanA的活力,并随着金属离子浓度的增大而增强,其中Cu²⁺和Fe³⁺表现出的抑制效应最为明显,部分有机试剂也表现出类似的现象。以没食子酸正丙酯为底物时,单宁酶PsnTanA的Km值和Vmax值分别为1.43 mmol/L和3.28 mmol/(L·min)。除此之外,研究发现单宁酶PsnTanA能够有效降解高粱、茶和绿豆单宁等底物。本研究不仅丰富了现有单宁酶资源,也为进一步为单宁酶在食品和饲料中的应用提供了必要的理论支撑。     

黑曲霉MAN1基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质分析

为了通过基因工程的方法在大肠杆菌中生产β-甘露聚糖酶.以β-甘露聚糖酶生产菌黑曲霉为材料,通过RT-PCR扩增获得β-甘露聚糖酶基因MAN1的cDNA片段,将该片段克隆连至pMD18-T并测序.Blast比对结果表明,该序列与GenBank中编号XM001400053的序列相似性为100％,将pMD18-MAN1与PE...     

近暗散白蚁 β-葡萄糖苷酶RpBgl7的异源表达及酶学性质研究

为研究近暗散白蚁(Reticulitermes perilucifugus)β-葡萄糖苷酶RpBgl7,利用生物信息学分析β-葡萄糖苷酶RpBgl7的家族及结构特点,构建RpBgl7的重组表达载体pCold-TF-RpBgl7,在大肠杆菌中过量表达并纯化,分析其最适反应条件和酶动力学参数。结果表明,RpBgl7属于糖苷水解酶1家族,具有2个保守的谷氨酸催化残基Glu187和Glu394。RpBgl7在BL21(DE3)中过量表达,经过镍离子亲和层析1步纯化可得到高纯度RpBgl7重组蛋白。以4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷为底物,测得RpBgl7的最适pH值为6.0,最适温度为70℃;动力学参数K_m=0.13 mmol/L,k_(cat)=3.15 s~(-1)。RpBgl7可耐受Na~+、K~+、Mg~(2+)、Cu~(2+)和Ba~(2+),而Ca~(2+)、Hg~(2+)和Fe~(3+)明显抑制RpBgl7的酶活力。     

原生质体紫外诱变选育普鲁兰酶高产菌株

[目的]对酸性普鲁兰酶产生菌的原生质体制备条件及诱变育种进行研究。[方法]对盐球菌（Halococcus sp.）Z1的原生质体制备和再生条件进行了研究,并对其原生质体进行紫外诱变选育普鲁兰酶高产菌株。[结果]菌体经培养14 h后,在36℃、2.8 mg/ml溶菌酶作用下酶解1.5 h,其原生质体形成率和再生率分别为87.4%和19.4%。采用紫外线对原生质体进行诱变,筛选得到9株普鲁兰酶活性比出发菌株高的突变株,其中D9-08的酶活达6.37 U/ml,比诱变前提高了0.96倍,经10次传代遗传性稳定。[结论]利用原生质体紫外线诱变手段进行酸性普鲁兰酶产生菌的育种是一条可行并具有较好效果的途径。     

毕赤酵母异源表达β-葡聚糖酶酶学特性的研究

根据酵母密码子的偏好性对来自某异源菌种的葡聚糖酶基因进行化学合成改造,用电转化方法整合到毕赤酵母基因组中进行表达,并对表达出的内切β-葡聚糖酶进行相关酶学特性研究。结果表明:酶的最适pH为4.5,最适温度为40℃C;酶的pH稳定性范围与缓冲溶液类型有关,为4.0—6.0;Al~(3+)对酶有激活作用,但Mn~(2+)和Cu~(2+)则会抑制酶的活性;此酶对羧甲基纤维素钠(CMC-Na)有较强的分解能力;胃蛋白酶对该酶有抑制作用。     

β-甘露聚糖酶基因的克隆表达及酶学性质

以能水解魔芋葡甘聚糖的野生筛选菌种枯草杆菌A33为材料，通过PCR技术从A33基因组中扩增β-甘露聚糖酶基因编码序列．经过克隆、测序及BLAST比对分析，证实该基因编码β-甘露聚糖酶，属于β-甘露聚糖酶家族中的一员，该基因已往册GenBank．将该基因克隆到原核表达载体pRSET—A中并转入大肠杆菌表达系统BL21（DE3）pLysS，经过诱导获得了此酶的高效表达．其表达量达到37．78U／mL。酶学特性分析表明其作用的最适pH为5．0．最适温度为60℃．     

黑木耳漆酶基因在毕赤酵母中的表达及其酶学性质研究

应用SignalP 3.0 Server软件对黑木耳漆酶基因lac1(GenBank No.AY450405)编码的蛋白质序列进行分析,发现在其N端存在18个氨基酸的信号肽序列。通过RT-PCR克隆了lac1基因,分别构建带有自身信号肽的lac1基因毕赤酵母表达载体pPICN-lac1和以α因子信号肽替换自身信号肽的lac1基因毕赤酵母表达载体pPIC9-lac。将这两个载体转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115细胞,获得基因工程菌GS115-pPICN-lac1与GS115-pPIC9-lac。SDS-PAGE分析和酶活性测定结果表明,在转化后者中漆酶基因得到了有效分泌表达,而在转化前者中漆酶基因未能得到有效分泌表达。进一步研究确定GS115-pPIC9-lac菌株液体发酵的最适pH为4.0,在此发酵条件下,其分泌表达的漆酶最高酶活为0.149U·mL-1。酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为40℃,最适反应pH为5.0,在最适反应条件下其pH稳定性和热稳定性均较好。     

热稳定6-磷酸-β-葡萄糖苷酶TteBglB异源表达、分离纯化及酶学性质分析

6-磷酸-β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.86)催化6-磷酸-葡萄糖苷类化合物(如6-磷酸-纤维二糖、6-磷酸-纤维素寡糖)产生6-磷酸-葡萄糖而使纤维素完全分解,在微生物碳源利用过程中起重要作用。腾冲嗜热厌氧杆菌是一株嗜热厌氧微生物,提供了丰富的热稳定性蛋白基因资源。从该菌株中克隆编码6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的基因Ttebgl B,并在E.coli BL21(DE3)进行了异源表达。结果表明,TteBglB催化反应的最适p H为6.0、最适温度为70℃,在pH 4~10或70℃时有着良好的稳定性;同时证实,TteBglB属于糖基水解酶家族1(GH1)成员,可不依赖Mn2+、Ni2+、Co2+或Fe2+等二价金属离子而发挥催化作用。以pNPβG6P为底物时,催化反应的Km为0.054 mmol/L,Kcat为81.47/min,Vmax为0.003992 mmol/min,酶比活为18.093 U/mg。     

水稻几丁质酶的表达及其酶学基本性质

利用甲醇诱导重组Pichia pastoris在发酵罐中表达几丁质酶,在发酵过程中根据溶氧变化控制甲醇流加速度.结果显示,蛋白表达量随菌体密度的增加而增加,酶活最高达56 U/ml.该几丁质酶具有良好的耐热性和pH适应性,在pH 2.0和pH 5.0有2个最适反应pH;在pH 3.0稳定性最好;40 ℃为其最适反应温度;在60 ℃保温3 h仍保持81%的酶活性;该几丁质酶对病原菌生长有一定程度抑制作用.     

启动子及信号肽筛选提高普鲁兰酶在地衣芽孢杆菌中的表达

普鲁兰酶(pullulanase)是一种淀粉脱支酶,在淀粉糖化加工等工业生产中具有重要的应用价值。选用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) BL10作为表达宿主,为了提高其中的普鲁兰酶产量,对来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 168和地衣芽孢杆菌BL10中的15种不同信号肽以及4种不同启动子进行筛选,构建了不同的重组工程菌株,最终发现在以P43为启动子、apr为信号肽的条件下,上清液中普鲁兰酶的表达量最高,酶活可达12 U/m L,且测得其最适反应温度为60℃,最适p H为4.5。结果表明通过对启动子及信号肽进行筛选是提高重组工程菌株中目的蛋白表达量的一种有效手段。