以番鸭呼肠孤病毒σC表达蛋白为抗原的ELISA方法的建立

将鸭呼肠孤病毒小外壳σC蛋白编码基因克隆于原核表达载体pET32a上,经EcoRⅠ和SacⅠ双酶切鉴定及序列分析,得到重组质粒pET32a-σC,转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,经SDS-PAGE和westem-blotting分析,融合蛋白能够与番鸭呼肠孤病毒感染康复鸭血清发生特异反应;以0.15m mol/LIPTG诱导,5h后融合蛋白δC表达量可达高峰,分子量为50ku;融合蛋白纯化后作为包被抗原,建立了检测鸭血清中的呼肠孤病毒抗体的间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测方法,最佳包被浓度为51μg/ml;标准阳性血清的最适稀释倍数为1：40;用该方法对50份鸭血清样品进行检测,并与琼扩抗体检测法相比较,证明该ELISA方法具有良好的特异性和敏感性,该研究为今后鸭呼肠孤病毒的诊断试剂盒的研制奠定了基础。     

番鸭呼肠孤病毒σC编码基因在昆虫细胞中的表达

经RT—PCR扩增了番鸭呼肠孤病毒S14株σC蛋白编码基因，将其克隆到pFastBacH—TA载体上，酶切鉴定及测序筛选出阳性重组载体pFastBacHTA-σC；将pFastBacHTA-σC转化到DH10Bac感受态细胞中，通过蓝白斑和PCR筛选获得重组转座子rBacmid—σC。在脂质体介导下将rBacmid—σC转染sf-9昆虫细胞，获得重组杆状病毒rBV—σC；SDS—PAGE和Western blot分析表明：在sf-9细胞中表达了分子量约37kD的σC蛋白，并且该蛋白能与原核表达σC蛋白免疫小鼠制备的血清发生特异免疫反应，为今后以表达的σC蛋白作亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

番鸭呼肠孤病毒σC编码基因在sf-9昆虫细胞中的表达

采用RT—PCR方法扩增了番鸭呼肠孤病毒S14株σC蛋白编码基因，将其克隆到pFastBacHTA载体上，经酶切鉴定及测序，筛选出阳性重组载体pFastBacHTA-σC；将pFastBacHTA-σC转化到DH10Bac感受态细胞中，通过蓝白斑和PCR筛选，获得重组转座子rBacmid-σC。在脂质体介导下将rBacmid-σC转染sf-9昆虫细胞，获得重组杆状病毒rBV-σc；SDS—PAGE和Western—blot分析表明，在sf-9细胞中表达了分子质量约37ku的σC蛋白，该蛋白能与原核表达的σC蛋白免疫小鼠血清发生特异性免疫反应，这为以表达的σC蛋白为抗原的亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

番鸭源呼肠孤病毒σC基因的表达与分析

为开展番鸭源呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)σC基因编码蛋白的相关研究,本研究采用RT-PCR技术从MDRV全基因组中扩增σC基因片段,与p ET24a载体连接,构建原核表达重组质粒p ET24a-C,转化BL21(DE3)感受态细胞后,IPTG诱导表达σC重组蛋白;并利用SDS-PAGE电泳和Western blot检测其表达情况和免疫原性。结果显示,扩增的σC基因序列与Gen Bank所发表的序列同源性为100%;σC重组蛋白能在大肠杆菌中大量表达,其分子量约为30 kDa,且能被MDRV阳性血清识别,具有良好的抗原结合活性。σC重组蛋白的成功表达,将对后续围绕该蛋白的功能鉴定、诊断用抗原制备或新型疫苗研制工作有所帮助。     

番鸭呼肠孤病毒ZJ99株σC蛋白基因的克隆与序列分析

参考已发表的番鸭呼肠孤病毒(mDRV)的S4序列设计了S4对扩增σC蛋白基N的引物，对mDRV ZJ99株的RNA抽提物进行RT—PCR扩增，获得了特异性的扩增片段。将PCR产物克隆测序，序列经同源性比较，发现mDRV ZJ99株σC蛋白基N序列与福建MW9710株对应基N的同源性为99．5％，与法国89026株对应基因的同源性为94．2％，与法国89330株对应基因的同源性为95．0％；相应的氨基酸序列同源性分别为98．9％、94．1％、93．7％。基于σC基因及其推导氨基酸序列的蛋白质结构及物理化学性质预测结果，与国外学者对mDRV σC蛋白的报道相似。     

禽呼肠孤病毒P17蛋白基因在大肠杆菌中的表达及其ELISA检测方法的建立

用设计合成的1对跨越禽呼肠孤病毒（ARV）P17非结构蛋白基因完整开放阅读框（ORF）的特异性引物，对ARVS1133株进行了RT-PCR扩增。扩增产物与pGEX-4T-1原核表达载体连接后，转化大肠杆菌BL21感受态细胞。经0．2mmol／LIPTG诱导，表达的融合蛋白分子质量为42.4ku，占茵体总蛋白的34％。表达产物P17蛋白经不同浓度尿素纯化后，纯度达到85％。Western-blotting显示，纯化的P17蛋白能与感染ARV的阳性血清反应，说明其具有抗原性。以此重组蛋白为包被抗原初步建立了用于鉴别检测ARV活病毒感染与灭活疫苗免疫的SPF鸡血清的ELISA。     

应用禽呼肠孤病毒σ_3融合蛋白为抗原的ELISA检测方法的建立

将表达的禽呼肠孤病毒(ARV)σ3融合蛋白纯化后作为抗原,建立了检测ARV抗体的间接ELISA方法,并对ELISA的反应条件进行了摸索,确定了抗原的最适包被浓度为3.98μg/mL,检测血清最适稀释倍数为1∶200,血清与抗原反应最佳反应时间为37℃作用2h,酶标二抗最佳作用时间为37℃作用1h,底物的最佳显色时间为25min。包被的抗原不与新城疫病毒、H5亚型禽流感病毒、传染性法氏囊病毒等阳性血清发生交叉反应。用该方法建立的ELISA诊断方法,具有很好的敏感性和特异性,为ARV的诊断和检测以及血清学调查提供良好的技术手段。     

禽呼肠病毒σC基因的表达及ELISA抗体检测方法的建立

将RT-PCR扩增得到的禽呼肠病毒(ARV)S1133毒株的σC基因克隆至pMD-18T-Simple载体,经酶切及测序鉴定,证明该基因片段为ARVσC基因。将该基因亚克隆至pET32a(+)成功构建了表达载体pET32a-σC。该重组质粒在大肠埃希菌BL21中经1.0mmol/L IPTG诱导5h得到最佳表达。pET32a-σC蛋白的分子质量为55ku,Western blot分析表明,该重组蛋白能与ARV阳性血清发生特异性反应,表明其具有良好的反应原性。将纯化好的ARVσC蛋白作为包被抗原,确定了该方法的抗原最适包被浓度为2μg/mL,血清的最适稀释度为1∶400。用建立的ELISA方法检测接种过ARV疫苗的65份临床血清样品,测得44份为阳性,阳性率为67.7%;未接种ARV疫苗的30份血清样品检测结果均为阴性。     

番鸭呼肠孤病毒S基因组的克隆与序列分析

对番鸭呼肠孤病毒S12和S14毒株S基因组（S1-4）中σA、σB、σNS和σC蛋白基因进行了克隆和测序。序列分析表明：鸭呼肠孤病毒（DRV）与禽呼肠孤病毒（ARV）的σA和σNS基因的核苷酸同源性分别为76．0％～77．1％和78．4％～79．6％，氨基酸同源性分别为89．5％～91．2％和91.6％～92．7％；而具有诱导群特异性和型特异性中和抗体的σB和σC基因的核苷酸同源性分别为60．3％～64．4%和2．7%～9．9％，氨基酸同源性分别为61．4％～62．0％和22．6％～26．7％；DRV和ARV抗原性存在差异。而DRVS12／S14与法国89026株σA、σB、σNS和σC基因的核苷酸同源性分别为90．0％、93．6％、87．9％～88．0％和93．1%，氨基酸同源性分别为97．1%、94．3%、95．7%～95．9%和93．7％。进化树分析表明，DRV与ARV形成不同的分支，DRV是正呼肠孤病毒属中不同于ARV的一种新的呼肠孤病毒。     

番鸭呼肠孤病毒MW9710σC蛋白基因克隆及其在E.coli中表达

应用RT2PCR扩增出番鸭呼肠孤病毒MW9710株的σC基因,序列分析表明σC基因核苷酸数为810bp,编码269个氨基酸,相对分子量为29.4ku,DNAstar软件分析MW9710株的σC核苷酸序列和法国番鸭呼肠孤病毒89026株有93%的同源性,而与禽呼肠孤病毒的同源性仅在21%～25%之间,表明番鸭呼肠孤病毒是一类不同于禽呼肠孤病毒的新病毒。将σC基因片段亚克隆到原核表达载体pET32a中,经IPTG诱导后在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效表达,Western2blot进一步验证了表达产物与番鸭呼肠孤病毒阳性血清反应,表明σC基因表达产物具有免疫原性,为下一步研制番鸭呼肠孤病毒诊断试剂盒和基因工程疫苗奠定基础。     

禽呼肠孤病毒σC蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

通过RT-PCR扩增禽呼肠孤病毒σC基因,经EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切处理后与pET-30a原核表达载体连接,获得重组质粒pET-30a--σC.将重组阳性质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后通过Westem blot分析表明重组目的蛋白获得表达,分子量约为42 ku,主要以包涵体形式存在.重组蛋白经纯化后免疫新西兰白兔,三次免疫获得抗σC蛋白的高效免疫血清.经ELISA检测,该血清抗体效价为1:105,并且能够与重组杆状病毒表达的σC蛋白发生特异性反应.禽呼肠孤病毒σC蛋白的表达与兔抗血清的制备为进一步研究该蛋白功能奠定了基础.     

番鸭呼肠孤病毒ZJ99株σC基因在甲醇酵母中的表达

将番鸭呼肠孤病毒ZJ99株σC基因插入到酵母表达载体pPIC9K内,转化大肠杆菌TG1,挑取阳性克隆,获得酵母表达重组质粒pPIC9K-σC。用DraⅠ酶切线性化重组表达质粒pPIC9K-σC和对照质粒pPIC9K,电转化至甲醇酵母GS115感受态细胞内,经G418抗性筛选和PCR鉴定,获得了2株pPIC9K-σC酵母阳性整合子和2株pPIC9K空载体对照酵母阳性整合子。分别挑取1株进行甲醇诱导表达,SDS-PAGE检测发现pPIC9K-σC酵母整合子在不同时段的诱导表达上清液中均有可见的目的蛋白条带,分子质量与预计大小相符,而对照pPIC9K酵母整合子的诱导表达上清液中没有相应的蛋白条带。说明番鸭呼肠孤病毒ZJ99株σC基因真核甲醇酵母表达体系构建成功,目的σC蛋白在酵母中能够有效地分泌表达。     

禽呼肠孤病毒σNS非结构蛋白基因的克隆和表达

采用RT-PCR技术扩增了禽呼肠孤病毒（ARV）S1133株与广西分离株R2 σNS非结构蛋白基因,将σNS基因克隆到质粒表达载体pGEX-4T-1上,获得的重组质粒经PCR、酶切鉴定以及测序分析,σNS基因的插入位置、大小和阅读框均正确,将阳性克隆命名为pGEX-S1133-σNS和pGEX-R2-σNS.构建好的重组质粒经37 ℃ 1 mmol/L IPTG诱导、SDS-PAGE分析超声裂解后的上清和沉淀,显示目的蛋白以包涵体方式表达,其蛋白质分子质量约为66.2 ku,约占菌体总量的31.5%～34.8%.Western-blotting分析表明,目的蛋白能够与ARV阳性血清发生特异性反应,表明该重组蛋白具有较好的抗原性.     

应用RT-PCR技术检测番鸭呼肠孤病毒

参考 Gen Bank中番鸭呼肠孤病毒 (m uscovy duck reovirus,MDRV ) S1基因序列 ,用计算机设计并合成了 1对引物 HP11、HP12 ,以此引物用 RT- PCR对番鸭呼肠孤病毒 S1基因进行了特异性扩增。结果表明 :引物 HP11、HP12能从所有供试的 4株分离毒 MDRV- MW9710、MW980 6、MW980 9、MW9810扩增出 30 0 bp S1基因 c DNA片段 ,而不能从禽呼肠孤病毒 (ARV) S1133株和番鸭胚成纤维 (MDEF)细胞培养物中扩增出任何片段 ;该 RT- PCR的检测灵敏度为 1pg的病毒核酸 ,特异性强 ,重复性好 ,对含毒细胞培养液和尿囊液只需用氯仿进行简单处理 ,即能检测出 MDRV核酸。因此认为 ,该 RT- PCR可以用于番鸭呼肠孤病毒的快速检测     

番鸭呼肠孤病毒σB和σNS基因克隆及序列分析

参考GenBank番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,DRV)σB和σNS基因序列设计合成引物,对番鸭呼肠孤病毒MW9710株σB和σNS基因进行RT-PCR扩增,并对PCR产物进行了克隆和测序。结果显示扩增产物分别为1154bp和1113 bp,与预期的目的片段大小一致。核苷酸序列经BLAST软件分析表明：番鸭呼肠孤病毒MW9710株σB基因与番鸭呼肠孤病毒法国89026株同源性为88．1%；氨基酸同源性为94．0%：σNS基因与法国89026株和89330株同源性分别为93．8%和93．1%；氨基酸同源性为95．9%和95．1%。而σB和σNS基因与禽呼肠孤病毒的同源性约为60%～80%。表明番鸭呼肠孤病毒是不同于禽呼肠孤病毒的独立基因群。     

乳胶凝集试验检测番鸭呼肠孤病毒方法的建立

用纯化的抗番鸭呼肠孤病毒病抗体致敏乳胶成功地建立了检测番鸭呼肠呼病毒的方法。通过试验，确定了抗体致敏乳胶的最佳浓度1：10(0．4242mg/mL)，最佳致敏温度37℃，最佳致敏时间2个小时。人工攻毒雏番鸭30只，用所建立的方法检测粪便。结果表明，攻毒后的第3天粪便中即可检测到病毒，直至攻毒鸭全部死亡都可从粪便中检测到病毒抗原；同样攻毒1日龄雏番鸭30只，剖检取心、肝、脾按常规方法处理，用所建立的方法的检测。结果表明，首先是脾脏在攻毒后第4天3只中有2只检测结果阳性，第5天2只死亡鸭中有一只肝检测结果阳性，脾脏2只都呈阳性，此后的病死鸭脾和肝均为阳性，而心脏则未见有阳性。这对，临床上诊断与防治番鸭呼肠孤病毒感染具有重要的参考意义。     

检测鸭呼肠孤病毒抗体间接ELISA方法的建立

RT—PCR扩增鸭呼肠孤病毒（Duckreovirus,DRV）的dB基因,克隆到pET-32a（＋）表达载体,再转化大肠杆菌Transetta（DE3）;含有重组质粒pET—σB的大肠杆菌经IPTG诱导,获得大小为55000的以包涵体形式表达的σB重组蛋白。Westernblotting显示,σB重组蛋白能够与兔抗DRV多抗血清特异性结合。以高亲和NI—NTA树脂在变性条件下纯化、梯度尿素复性的σB重组蛋白为包被抗原,建立了检测DRV抗体的间接ELSIA方法。分别以间接ELSIA方法和血清中和试验对DRV感染鸭血清和SPF鸭血清进行检测,两者的符合率为100％。该间接ELSIA方法对鸭瘟病毒、鸭病毒性肝炎病毒和禽流感病毒阳性血清均无交叉反应。     

番鸭呼肠孤病毒MW9710株δC蛋白基因的克隆和序列分析

根据已发表的番鸭呼肠孤病毒（DRV）δC蛋白基因的核苷酸序列设计引物，应用RT-PCR技术，扩增番鸭呼肠孤病毒δC蛋白基因，经T／A克隆，插入到pMD18-T载体上，测序分析结果表明MW9710株δC蛋白基因的开放阅读框为810nt，编码由269个氨基酸组成，分子量为29．4Ku的δC蛋白，应用BLAST等分子生物学软件分析，其与法国DRV89330株的δC蛋白基因的同源率达93％，所推导的氨基酸的同源率达93％，与ARV的核苷酸无同源性，推倒的氨基酸的最大同源率为26％。经Antheprot 5．0蛋白质软件分析表明：MW9710株δC蛋白具有较大的疏水性和抗原性，无跨膜区，为进一步研究该基因的表达和研制基因工程疫苗及诊断试剂奠定基础。     

番鸭呼肠孤病毒套式RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank上发表的鸭呼肠孤病毒基因组序列,利用生物学软件设计合成内外2对引物,建立了检测番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)的套式RT-PCR检测方法,并运用建立的检测方法对分离病毒与其他禽病病毒进行检测。结果显示,该方法能从MDRV中扩增到与预期大小相符的特异性目的片段,检测灵敏度达到0.1 pg病毒RNA,对禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)、鸡传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)、番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)、鹅细小病毒(goose parvovirus,GPV)、鸭病毒性肝炎病毒(duck hepatitis virus,DHV)等病毒样品的扩增结果均为阴性。因此,本研究为番鸭呼肠孤病毒病的快速检测及诊断研究提供参考。     

雏半番鸭呼肠孤病毒的致病性

从鸭体、禽胚和细胞 3个方面探讨了雏半番鸭呼肠孤病毒 FZ2 株的致病性。经试验表明 ,在实验室条件下 ,该株病毒可导致雏番鸭、雏半番鸭发病、死亡 ,对雏番鸭的致死率为 14 .3%～ 4 1.7% ,对雏半番鸭的致死率高达 38.5 % ,且死亡鸭表现出与自然感染呼肠孤病毒病死的雏番鸭、雏半番鸭相同的病变 ;人工感染幸存鸭大多生长发育明显受阻。该株病毒经尿囊腔途径接种 ,对番鸭胚、半番鸭胚、北京鸭胚、SPF鸡胚的致死率分别为 10 0 %、96 %、2 8%和 0 ,致死鸭胚的肝脏、脾脏表面见白色坏死点。经蛋传试验表明 ,该株病毒有可能经胚蛋垂直传染。以该株病毒在番鸭胚成纤维细胞 (MDEF)上连续传接 10代 ,结果细胞病变 (CPE)仍不明显 ,表明其不易适应 MDEF。由此可见 ,该株雏半番鸭源呼肠孤病毒具有较强的致病力