农杆菌介导棉花茎尖遗传转化体系优化

生根困难和转化效率较低是农杆菌介导棉花茎尖遗传转化体系的应用瓶颈。本研究以柯字棉312为研究材料,探讨茎尖遗传转化中植物生长调节剂、生根诱导时间、无菌苗型、针刺处理等对茎尖生根率、茎尖形态以及抗性苗产生率等的影响。结果表明,1.5 mg/L NAA能够有效提高生根率,促进茎尖伸长;生根诱导时间是生根率的重要影响因子;经多次针刺处理的正常苗抗性苗率较高;培养5 d的正常苗茎尖生长速度和状态优于黄化苗。     

棉花茎尖农杆菌转化体系的建立

[目的]建立高效的以草甘膦为选择剂的棉花茎尖农杆菌遗传转化体系。[方法]以中棉35号、中棉27号、石远321和珂字312号4个陆地棉品种茎尖为遗传转化受体材料,采用农杆菌介导转化法,结合草甘膦筛选,探讨了影响棉花茎尖遗传转化效率的几个重要因素。[结果]棉花茎尖对草甘膦极为敏感,所有品种棉花茎尖均在60μmol／L草甘膦浓度下停止生长。对茎尖用OD600=1．0菌液浸染20min、预培养2d、恢复培养1周和共培养72h的处理能显著提高棉花遗传转化效率。对所有成活转基因棉株进行PCR检测的结果表明,所有植株均能扩增出目的基因aroA—M1 1．3kh的特定条带。[结论]该研究为进一步加速转基因棉花的产业化进程奠定基础。     

农杆菌介导的海岛棉茎尖再生体系及其遗传转化影响因子的研究

采用根癌农杆菌LBA4404和EHA105介导,对海岛棉的茎尖再生体系及其转化影响因子进行了研究。茎尖培养与棉花体细胞胚胎发生相比,不同基因型的茎尖再生频率差异不明显;在9种不同的激素组合中,以6-BA0.5 mg/L NAA0.1 mg/L与1/2MSB5 IBA 0.1 mg/L对茎尖的再生效果较好;获得较高转化频率的海岛棉培养条件为:海岛苗茎尖在OD600值为0.6~0.8农杆菌菌液中感染20~30 min,共培养3 d后进行转接,在含有不同激素和抗生素的各类培养基中进行抑菌和筛选继代培养,选择压以50~150 mg/L梯度进行;农杆菌以EHA105菌株的转化效果较好;抗性苗用SDS-CTAB法提取其总DNA,进行PCR扩增检测,有7株PCR检测呈阳性反应。由此,初步证明外源抗虫基因已经进入到再生植株的细胞核中。     

农杆菌介导的VgDGAT1a基因棉花茎尖转化体系优化研究

为了将斑鸠菊(Vernonia galamensis)二酰甘油酰基转移酶基因(VgDGAT1a)导入棉花,创制转基因高油棉花种质,优化建立农杆菌介导的棉花茎尖转化体系,以‘中棉所49’茎尖为外植体,以HptⅡ基因为筛选标记,VgDGAT1a为目的基因,用农杆菌介导法,研究外植体培养时间、浸菌侵染时间、共培养时间及吸光度A600值等对棉花茎尖转化的影响。结果表明,在外植体培养3～5d、生长点纵切、菌液吸光度A600值0.6～0.9、浸菌40～60min、浸菌后暗培养1d和使用MSB+活性炭1g/L+头孢霉素400mg/L作为生根培养基的条件下能高效获得再生转化植株,从而为转基因高油棉花种质的创制提供了一种有效的方法。     

农杆菌介导的马铃薯茎段遗传转化体系优化研究

以甘肃主栽品种的茎段为外植体,研究了不同转化条件(菌液浓度、感染时间、预培养及共培养时间)对转化效率的影响,以及选择压和培养基对抗性出芽的影响,初步建立了马铃薯品种“陇薯3号”和“台湾红皮”的遗传转化体系并获得了转化植株。卡那霉素生根筛选和PCR鉴定结果表明,再生的转化植株假阳性率比较高,要获得预期的转基因植株群体需加大遗传转化工作中转基因植株的数量。     

农杆菌介导棉花遗传转化影响因素的研究

为优化农杆菌介导棉花胚性愈伤的遗传转化体系,我们以2个栽培棉花品种新陆中36、新陆中45的胚性愈伤组织作为受体材料,利用农杆菌介导法转化Bt基因,研究愈伤组织状态、菌液处理浓度、侵染时间及共培养条件等因素对转化率的影响。结果表明:(1)预培养15~20天呈颗粒状、生长旺盛、分散性好的胚性愈伤组织适于转化,其中以继代18天的新陆中36愈伤组织转化率最高,为80%,不同基因型间存在差异。(2)菌液浓度0.4~0.5 OD600,农杆菌侵染10~15分钟是这两种胚性愈伤组织的最佳侵染时间。(3)50 mg/L是卡那霉素对抗性胚性愈伤起到有效筛选的最佳浓度。通过本研究实现了对受体材料、农杆菌侵染浓度、侵染时间和共培养条件的进一步摸索,棉花抗性胚性愈伤再生培养体系得到进一步的优化。     

农杆菌介导羽衣甘蓝转化体系的建立

以羽衣甘蓝皱白1带柄子叶为外植体,通过农杆菌介导法,研究影响羽衣甘蓝转化的若干因素,建立稳定的遗传转化体系.结果表明,外植体通过2 d的预培养,OD600值为0.3的菌液浓度,侵染时间5 min,2 d的共培养,延迟筛选3 d有利于获得较高的转化效率.PCR检测表明,外源基因已整合到羽衣甘蓝基因组中.     

农杆菌介导的丹参遗传转化体系研究进展

丹参是我国传统的大宗药材,被广泛用于治疗心脑血管疾病。随着我国心脑血管疾病发病率的逐年攀升,丹参的种质资源也急需有新的提高,转基因技术作为基因功能研究和转基因育种的重要手段在丰富和优化丹参种质资源方面取得了显著成效。通过利用转基因技术中常用的农杆菌介导法来转入外源基因以及探求丹参有效成分合成代谢相关基因功能,以期获得高产、高抗丹参植株的方法已较为成熟,目前研究工作主要集中于不同遗传转化体系的建立和优化。本文就丹参遗传转化体系构建的转化原理、影响因素和研究现状三方面作出详细综述,为今后丹参基因功能研究和新品种培育提供一定参考。     

根癌农杆菌介导的马铃薯茎段遗传转化条件的研究

以马铃薯茎段作为受体转化材料.通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法,对影响马铃薯遗传转化的多种因素(抗生素质量浓度、农杆菌质量浓度、共培养时间等)进行研究.结果表明,卡那霉素(kanamycin,Kan)梯度在抗性愈伤组织诱导、芽分化过程中以100 mg·L-1为宜,但在生根过程中以50 mg·L-1为宜,菌液质量浓度以OD600为0.5,共培养时间为3 d,抑菌剂的选择以羧苄霉素(carbenicillin,cb)更适合.对转基因植株进行PCR检测表明,目的基因已整合到马铃薯基因组中.     

农杆菌介导棉花和玉米非组培转化方法探索

采用农杆菌介导植物萌发种子基因转化方法，在棉花和玉米上转化外源目的基因，进行非组培转化法的探索。结果表明，针刺对棉花和玉米种子的萌发没有影响，但对2种作物的出苗率有明显抑制作用。转化过程中，棉花的共培养时间不宜超过24 h，玉米不宜超过48 h。经大田筛选及PCR检测，棉花未获得转化植株，玉米获得转化植株共7株，转化率达0．14％，其中加入AS（乙酰丁香酮）的处理获得6株，不加AS处理获得1株。     

不同基因型矮牵牛高频再生体系建立的研究

为建立不同矮牵牛品种的高频再生体系,以10个矮牵牛品种为材料,研究了不同基因型、不同生长调节剂配比、不同接种方式、叶片不同部位和不同外植体对不定芽再生的影响。研究结果表明:基因型是影响不定芽再生的重要因素之一,从10个品种中筛选获得了5个品种的高频再生体系;6-BA和NAA及其配比极显著影响矮牵牛不定芽再生率和平均不定芽再生数量,其中0.2 mg.L-1NAA极显著的促进了矮牵牛不定芽再生,其次是0.1 mg.L-1NAA,而高浓度NAA抑制不定芽再生;不同品种适宜的分化培养基不同,筛选获得了不同品种适宜的分化培养基;不同接种方式对不同品种不定芽再生影响不同,其中不同接种方式对黄金紫罗兰的不定芽再生有极显著影响,对黄金肉红、珊瑚红则没有影响;叶片不同部位极显著影响黄金紫罗兰星条不定芽的再生,对其它品种没有影响;叶片外植体是矮牵牛不定芽再生的最佳外植体。     

利用玉米茎尖技术转化TR1-EPSPS

茎尖转化法是目前发展较快的农杆菌转化技术。本研究利用茎尖转化法将载体pCambia-35S-TR1-EPSPS转入玉米的自交系中,通过草甘膦除草剂筛选得到46株抗除草剂的玉米幼苗,通过PCR验证,这些幼苗中有9株含有外源载体片段。     

发根农杆菌介导不同基因型大豆转化效率的筛选

基因型是影响发根农杆菌转化大豆的主要因素之一,为筛选转化效率高的大豆基因型,利用不同基因型大豆的下胚轴接种发根农杆菌K599(含GUS基因),待长出毛状根后,根据不同基因型大豆发根诱导率和发根数的差异,选择适宜大豆基因型进行GUS基因的组织化学染色和RT-PCR分析。结果表明,34个大豆基因型发根诱导率和发根数有很大差异,选择发根诱导率大于60%以及发根数大于1.6条的20个大豆基因型毛状根进行GUS基因组织化学染色,其中Y091、Z184、P108、L010等4个大豆基因型的GUS基因转化效率较高,分别为96.2%、91.7%、87.5%、86.4%;进一步对以上4个大豆基因型毛状根进行RT-PCR分析,结果表明,GUS基因均得到了正确转录。表明大豆基因型Y091、Z184、P108、L010是发根农杆菌转化大豆较为理想的受体材料。     

农杆菌介导的木薯遗传转化体系的优化

以木薯腋芽为外植体,通过添加不同含量的2,4-D和picloram摸索诱导体细胞胚及FEC的最佳激素条件;利用优化的再生体系,以木薯脆性胚性愈伤组织(FEC)为受体,对农杆菌侵染FEC的侵染浓度、侵染时间以及侵染后潮霉素抗性筛选浓度进行了研究。结果表明,12 mg·L~(-1)的picloram能较快诱导出体细胞胚及FEC;农杆菌菌液浓度OD600=0.4并侵染30 min为FEC转化效率及植株再生率的最佳条件;共培养后,通过逐渐增加潮霉素筛选浓度(0,5,8,15 mg·L~(-1))能更有效地提高植株的再生率。     

根癌农杆菌介导花生遗传转化体系的建立

通过农杆菌介导法以花生下胚轴为外植体转化花生品种四粒红。经过共培养、抑菌和筛选培养,在含有0.8 mg/L Basta的培养基获得67株抗性再生植株。经PCR检测,获得5株阳性植株,bar试纸条检测至少有2株转基因植株为阳性。该体系操作简易、高效,可作为利用基因工程对花生进行研究和遗传改良的一种技术手段。     

油菜农杆菌介导转化体系的优化

以甘蓝型油菜湘油15号为试验材料,对农杆菌转化体系中外植体预培养时间、培养基中AgNO_3浓度、农杆菌侵染时的菌液浓度、共培养基pH值等进行了优化研究,确立了优化的遗传转化条件。结果表明,外植体在农杆菌侵染和共培养前预培养3 d,可明显提高子叶外植体和下胚轴外植体出愈率和抗性芽苗分化率,有利于获得较高的转化效率;在基因转化中,AgNO_3的最佳使用浓度为30μmol/L,最佳的农杆菌侵染菌液OD_(600)为0.4,共培养基pH值5.4是油菜农杆菌介导转化中优化的转化条件。     

不同基因型荞麦遗传转化体系初探

本研究旨在利用遗传转化基础,打破荞麦杂交困难、种质创新难的瓶颈,提升荞麦研究水平。本试验以甜荞‘PI647061’和苦荞‘ZNQ152’为材料,设置正交实验对下胚轴进行组织培养,并通过农杆菌介导法侵染愈伤组织,用组织化学染色观察GUS基因的瞬时表达。试验结果表明：MS+2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L 6-BA可使下胚轴出愈率达90%以上。10种不同基因型荞麦下胚轴在MS+0.5 mg/L NAA + 1.0 mg/L 6-BA中分化率最高,再生率最高达52.6%。以携带遗传转化载体pRI201-AN-GUS的农杆菌LBA4404侵染愈伤组织,经选择培养后获得再生幼苗,进而在叶片中成功观察到GUS基因表达的蓝色斑点,转化阳性率为1.23%。本研究为探索关于荞麦优良基因的转化及建立有效的遗传再生体系提供了理论和实践基础。