利用CHD基因鉴定鸽子性别的研究

为了能够快速并准确地鉴定鸽子性别,试验利用CHD基因鉴定引物,通过PCR技术对鸽子CHD基因进行特异性扩增,经琼脂糖凝胶电泳,分别从待检鸽子PCR产物中检测到2条带和1条带,并对待检鸽子性别进行解剖印证,结果显示,2条带为雌鸽,1条带为雄鸽;对获取的雌、雄鸽子PCR产物回收纯化后,与pMD19-T载体连接并转入K12感受态细胞,挑取阳性克隆进行测序分析,发现所检序列确为CHD-Z、CHD-W基因;此外,在优化退火温度时发现,雌性鸽子扩增序列600 bp处,扩增效果易受退火温度影响,且与雄鸽该处的扩增效果存在差异,利用雌雄鸽子PCR扩增效率的不同也能达到鉴别鸽子性别的目的。结果表明:本研究验证了利用CHD基因来鉴别鸽子雌雄的方法,其准确率为100%。发现CHD基因特定位点的PCR扩增效率受性别影响,由此发展出基于PCR扩增效率的性别鉴定方法。本研究为鸽子的性别早期鉴定和准确鉴定提供了参考。     

鸽生长激素受体基因多态性与生长性状及体组成的相关分析

根据鸽生长激素受体（GHR）基因CDS序列设计引物进行PCR扩增,克隆了鸽GHR基因内含子9序列,通过Gen-Bank中Blastn比对表明,与鸡内含子9（AF372659）同源性为70．01％。利用PCR-SSCP技术和DNA测序方法检测GHR基因内含子9、外显子10和3’-UTR的单核苷酸多态性。本试验共检测出3个多态位点,经最小二乘法分析,多态位点与两群体鸽生长性状及体组成均不相关。     

饲料中牛羊源性成分的定性检测——定性聚合酶链式反应法(PCR)法

目的:为防止疯牛病和痒病的传播。方法:研究提供了一种利用从动物饲料中提取牛羊动物基因组DNA的方法,并依据牛、羊基因组DNA的特异性序列片段,利用种属特异性的引物,通过PCR扩增这一特定的DNA序列,通过电泳分离PCR产物,以长度的PCR产物作对照。结论:实现了对动物饲料中牛、羊源成分的检测。     

基于鸽新城疫病毒M基因实时定量PCR检测方法的建立

研究通过比对鸽源和鸡源新城疫病毒M基因的序列,找到其差异位点并在保守区设计引物和TaqMan探针,建立了一种可以特异性检测鸽新城疫病毒的实时荧光定量PCR方法。以鸽新城疫病毒M基因阳性质粒为模板制作标准曲线并对检测方法的指标进行系统评价。结果显示,该方法的标准曲线为方程为:y=-3.334logX+37.837,相关系数R2=0.992;重组质粒标准品检测下限为1×101 copies/μL,比普通PCR灵敏100倍;特异性试验显示,该方法与鸡新城疫病毒不同毒株及其他常见禽类病毒无交叉反应;重复性试验的组间及组内的变异系数均小于2%,说明本研究建立的实时定量PCR检测方法敏感性高、特异性强、重复性好,可应用于鸽新城疫病毒的早期检测,为鸽新城疫病毒的防控提供了技术支持。     

鸽（Columbam）ESRα扩增及序列分析基因的

利用PCR技术扩增出鸽雌激素受体ESRα的部分cDNA片段,测定其核苷酸序列并推导氨基酸序列,对鸽ESRα基因部分cDNA序列和不同物种进行同源性比对,并构建聚类树。试验结果表明,鸽ESRα基因序列与麻雀具有96％的相似性,火鸡和原鸡均为93％,大熊猫、黑猩猩、牛以及人在该基因上的同源性均达到了79％,大鼠和小鼠为78％,显示了该基因在不同物种之间具有很强的保守性。通过对鸽ESRα基因进行同源性比对和序列分析,为深入研究鸽的就巢泌乳机制提供理论参考。     

一起鸽群新城疫强毒感染的诊断

为对发病鸽群进行诊断,采集发病鸽群血清,检测血清中新城疫抗体,同时提取病鸽脑组织总RNA样本通过RT—PCR进行新城疫病毒F基因检测,并从病鸽脑组织中分离鉴定新城疫病毒。结果表明,该发病鸽群为新城疫强毒感染。     

鸽(Columbam)ESRα基因的扩增及序列分析

利用PCR技术扩增出鸽雌激素受体ESRα的部分cDNA片段,测定其核苷酸序列并推导氨基酸序列,对鸽ESRα基因部分cDNA序列和不同物种进行同源性比对,并构建聚类树.试验结果表明,鸽ESRα基因序列与麻雀具有96％的相似性,火鸡和原鸡均为93％,大熊猫、黑猩猩、牛以及人在该基因上的同源性均达到了79％,大鼠和小鼠为78％,显示了该基因在不同物种之间具有很强的保守性.通过对鸽ESRα基因进行同源性比对和序列分析,为深入研究鸽的就巢泌乳机制提供理论参考.     

快速诊断鸽瘟方法的研究

从疑似鸽瘟的6例临床病例中分离到5株鸽Ⅰ型副黏病毒（SCP1-SCP5），经本实验室建立的检测中、强毒力新城疫（NDV）病毒的SYBR GREENⅠRT—PCR（RRT—PCR）方法诊断，确诊为中、强毒力新城疫毒感染，用常规RT—PCR扩增SCP1包括F蛋白裂解位点的基因片段，并进行克隆、序列测定。分析表明，SCP1编码F蛋白的基因片段裂解位点处的序列为^112K-R-^114Q—K—R-^117F，与新城疫强毒在这一区域的序列相符；与21株已报道的NDV进行核苷酸同源性比较，并建立进化树，聚类为基因Ⅵ型。     

鲁西黄牛calpain基因PCR-RFLP的初步分析

对鲁西黄牛m-calpain的30kD大小的调节亚基的DNA序列通过PCR扩增得到1800bp大小的产物，这个产物序列包括从外显子4到外显子8的5’末端的全部序列（包括它们之间的内含子序列）。利用限制性内切酶Hhn I对PCR产物进行酶切，在31头鲁西黄牛群体中检测到2个等位基因A和B，2个等位基因的频率分别为0．39和0．61，检测N3种基因型AA、BB和AB，3个基因型的频率分别为0．1、0．4和0．5。     

鸽白细胞介素8基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鸽白细胞介素8（interleukin-8,IL-8）基因实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank上公布的鸽IL-8基因序列,在保守区域设计1对特异性引物,以鸽子淋巴细胞提取的核酸为模板扩增鸽IL-8基因部分片段并克隆到pMD18-T载体上。提取重组质粒通过系列制备标准品,建立鸽IL-8基因SYBR GreenⅠ染料法实时荧光定量PCR标准曲线,并进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,实时荧光定量PCR熔解曲线呈单一熔解峰,试验线性相关系数为1.0,IL-8基因的扩增效率为103%。敏感性结果显示最低可检测到16个拷贝数;用该方法检测其他鸽白细胞介素细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-18）和双蒸水的结果均为阴性。批间、批内变异系数均≤1.52%。因此,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法可用于鸽IL-8 mRNA的检测,为病毒感染宿主细胞后细胞因子表达的定量分析奠定基础。     

不同羽色鸽种MC1R基因的扩增与序列分析

黑素皮质素受体1(Melanocortin-1 Receptor,MC1R)是一种7跨膜结构G蛋白耦联受体,在鸟类羽色形成中起着重要作用。为探讨MC1R对太湖鸽特殊羽色形成的影响,本实验利用PCR和直接测序法对太湖鸽、乌鸽和白卡奴鸽MC1R基因编码区进行扩增,并对不同鸽种MC1R基因序列进行差异性分析。结果表明:鸽MC1R基因编码区全长942 bp,共编码313个氨基酸,存在7个跨膜结构;白卡奴鸽与乌鸽的MC1R基因编码区核酸序列基本一致,黑羽和棕羽太湖鸽的MC1R基因序列没有差异,而太湖鸽与其他2个鸽种分别于279bp(A>G)和520bp(G>A)处存在碱基差异,其中G520A造成了氨基酸(Ser174Gly)的改变,推测该位点突变与太湖鸽特殊羽色形成有关。     

Sequence and phylogenetic analysis of interleukin (IL)-1beta-encoding genes of five avian species and structural and functional homology among these IL-1beta proteins

Interleukin (IL)-1beta-encoding regions of chicken, duck, goose, turkey and pigeon were cloned and sequenced. Each IL-1beta-encoding region of chicken, duck, goose and turkey is 804 nucleotides long and encodes IL-1beta protein that is 268 amino acids. Pigeon IL-1beta-encoding region is 810 nucleotides long and encodes IL-1beta protein that is 270 amino acids. Two one-nucleotide and one four-nucleotide insertions of pigeon IL-1beta-encoding region sequence were found, resulting in two amino acid insertions in pigeon IL-1beta. Pairwise sequence analysis showed that the sequence identities of IL-1beta-encoding genes ranged from 77% to 99%, which were also found for IL-1beta protein sequence identities, with an average level of both sequence identities of 89%. Phylogenetic analysis indicated that IL-1beta-encoding regions and the encoded proteins of chicken, duck, goose and turkey clustered together and evolved into a distinct phylogenetic lineage from that of pigeon which evolved into a second lineage. The results from the binding reaction of antiserum against each recombinant IL-1beta (r IL-1beta) protein to homologous or heterologous rIL-1beta, the enhancement levels of K60 mRNA expression in rIL-1beta-treated DF-1 cells or the reduction levels of K60 mRNA expression in DF-1 cells treated with rIL-1beta that was preincubated with homologous or heterologous antiserum showed that all five rIL-1beta were functional active and shared significantly structural and functional homology.     

鸽黑素皮质素受体4基因多态性与生长性状及体组成的相关研究

通过比对GenBank中鸡、鹅黑素皮质素受体4（MC4R,melanocortin receptor）基因DNA序列,找出保守序列设计引物,克隆了鸽的MC4R基因编码区985bp序列,与鹅、鸡、短尾猊、北极狐和犬类的同源性分别为94%、94%、91%、84%和84%。利用PCR-SSCP技术和DNA测序方法检测两群体鸽MC4R基因编码区序列的单核苷酸多态性,共检测出两个多态位点,最小二乘分析表明,T933C基因型对肉鸽群体活重、屠体重、全净膛有显著影响（P＜0.05）,对野生鸽群体生长性状无影响（P＞0.2）,多重比较显示,该位点AA基因型个体的活重、屠体重、全净膛显著高于BB基因型个体（P＜0.05）。MC4R基因可能是影响鸽生长性状和体组成的主效基因或与主效基因相连锁。     

鸽白色念珠菌药物敏感性及ITS1和Als1序列分析

为研究防控集约化养殖场鸽嗉囊炎,本研究对鸽白色念珠菌(C.Albicans)PGG菌株进行了6种抗真菌药物的药敏试验,并进行ITS1和Als1序列测序及分析。结果表明,C.Albicans对常用抗真菌药两性霉素B、咪康唑、氟康唑、酮康唑、伊曲康唑和制霉菌素均敏感;PGG菌株的ITS1序列约243 bp,Als1序列980 bp,分析比对表明C.Albicans PGG的Als1序列(JQ034421)与人源白色念珠菌株SC5314的Als1序列(XM 712984)的同源性为99%。     

华南地区肉鸽源沙门氏菌的鉴定及遗传进化分析

本试验从华南地区发病肉鸽肠道和肝脏中用BS培养基分离、纯化沙门氏菌,并进行多项生化试验和血清型鉴定试验,结果显示各项生化检测指标均符合沙门氏菌的特点;血清型鉴定试验结果表明该分离菌属沙门氏菌属A-F群。进一步对该分离菌的16S rRNA片段测序及遗传进化分析,确定该分离菌为沙门氏菌菌株,与鼠伤寒沙门氏菌同源性为100%。对该分离菌进行动物回归试验,结果表明该沙门氏菌菌株为华南地区肉鸽的致病菌株。该结果为进一步研究华南地区肉鸽沙门氏菌的致病机理和防控奠定了基础。     

Phylogenetic Analysis of HN Gene of Eight Pigeon NDV Isolates in Guangxi

[Objective] The paper was to provide a basis for scientific prevention and control of pigeon Newcastle disease(ND).[Method] The HN gene of eight pigeon NDV strains isolated from different pigeon farms in Guangxi were amplified by RT-PCR,sequenced and analyzed.The molecular evolution characteristics of HN gene of pigeon NDV isolates in Guangxi was discussed.[Result] The nucleotide sequence length of HN gene of the eight NDV isolates was 1 716 bp,encoding 571 amino acids.They belonged to virulent group C,and the gene length characteristic of HN gene accorded with virulent strain.Analysis of nucleotide homologies indicated that the eight NDV isolates shared higher homology with genotype VIb,ranging from 90.4% to 99.5%.Phylogenetic tree analysis demonstrated that the genetic relationship between the eight NDV strains in Gangxi and the NDV isolates from Guangxi,Guangdong,Jilin,Liaoning,Yunnan and Heilongjiang during 2011 and 2013 was close.They were located in the same cladogram branch.[Conclusion] We assume that the eight pigeon NDV isolates in Guangxi all belong to the gene class II genotype VI b NDV.     

Distribution of Prosaposin mRNA in the Central Nervous System of the Pigeon (Columba livia)

Bioassay and immunohistochemical studies have detected the presence of prosaposin in the central nervous system (CNS) of mammals. Here, first time, we have determined the partial cDNA sequence of pigeon prosaposin and mapped the distribution of its mRNA in the pigeon CNS. The predicted amino acid sequence of pigeon prosaposin showed 93 and 60% identity to chicken and human prosaposin, respectively. In situ hybridization, autoradiograms showed that the prosaposin mRNA expression was found in the olfactory bulb, prepiriform cortex, Wulst, mesopallium, nidopallium, hippocampal formation, thalamus, tuberis nucleus, pre‐tectal nucleus, nucleus mesencephalicus lateralis, pars dorsalis, nucleus isthmi, pars parvocellularis and magnocellularis, Edinger–Westphal nucleus, optic tectum, cerebellar cortex and nuclei, vestibular nuclei and gray matter of the spinal cord. These results suggest that the cDNA sequence of pigeon prosaposin is comparable to other vertebrates, and the general distribution pattern of prosaposin mRNA resembles those are found in mammals.     

1株鸽Ⅰ型副黏病毒的分离与鉴定

本试验采集病死鸽临床样品,用SPF鸡胚接种传代分离病毒后,通过血凝（HA）与血凝抑制（HI）试验、RT-PCR及F基因部分片段测序与分析对分离株进行鉴定,并通过测定鸡胚平均死亡时间（MDT）、1日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI）和动物回归试验评估分离株的毒力和致病性。结果表明,从病鸽组织病料中分离获得1株鸽Ⅰ型副黏病毒（PPMV-1）,命名为GXP120012。分离株GXP120012的F基因裂解位点112－117位的氨基酸组成为R-R-Q-K-R-F,符合强毒株特征;GXP120012与PPMV-1参考毒株pi/CH/LLN/110713的核苷酸序列同源性高达98.9%,并处于同一遗传分支,基因型为Ⅵ型。该分离株的MDT为102 h,ICPI为0。动物回归试验发现,分离株GXP120012对鸽具有较强的致病性,而对鸡没有致病力。本试验结果为今后鸽新城疫的分子流行病学研究和疾病防控提供理论依据。     

鸽圆环病毒福建株全基因组序列分析

运用PCR技术从福建省某地发病信鸽组织中获得鸽圆环病毒（Pigeon circovirus,PICV）福建株（简称fj1株）全基因组序列,并对鸽圆环病毒福建株基因组核苷酸组成、结构及其遗传进行分析。结果表明,所获fj1株全基因大小2037 nt,包含有2个主要的开放阅读框（open reading frame,ORF）：ORF-V1（41～994nt）编码复制相关结构蛋白（the replicated-associated protein,Rep）,ORF-C1（1987～1166nt）编码核衣壳蛋白（the putative capsid protein,Cap）;在V1和C1的5＇端之间存在一个与圆环病毒滚环复制有关的高度保守的环状发夹结构。fj1株与GenBank登录所有鸽圆环病毒核苷酸同源性在84.5%～93.8%之间,与中国浙江鸽圆环病毒分离株zj1和zj2核苷酸同源性分别为88.7%和88.9%。从遗传进化上看,中国3株鸽圆环病毒均处在Cap蛋白起始密码子＂ATG＂分支,但分居不同亚群。