基于Mx启动子和荧光素酶报告基因定量检测鸡Ⅰ型干扰素生物学活性的研究

为了探索并建立快速、敏感、准确的Ⅰ型干扰素生物学活性定量分析方法,本研究克隆了鸡Mx启动子（Mxp）,并在其下游连接荧光素酶（Luciferase,luc）报告基因,构建鸡Ⅰ型干扰素活性检测质粒pMxp-luc。以pMxp-luc瞬时转染鸡胚成纤维细胞系DF-1,24 h后用鸡IFN-α/β处理细胞,结果荧光素酶基因在Mx启动子的作用下获得转录表达;荧光素酶的表达量与干扰素的抗病毒活性有着良好的线性相关性,并在干扰素处理细胞6 h后就可以检测;对鸡IFN-α和IFN-β检测的敏感性分别约为抗病毒活性定量检测方法的10和100倍。该检测系统与传统抗病毒定量检测方法相比,具有快速简便、准确敏感、便于高通量检测等优势,在禽类乃至哺乳动物干扰素生物学基础和应用研究及产业化过程中具有重要应用价值。     

鸡肝脏型脂肪酸结合蛋白基因启动子活性分析

PCR扩增鸡L-FABP基因5′侧翼区约2kb的DNA片段,进行克隆并测序,构建了鸡L-FABP基因报告基因系列缺失载体,瞬时转染进入人肝癌细胞系,利用双荧光素酶报告基因系统测定了荧光素酶活性。在线分析软件发现鸡L-FABP基因启动子区存在HNF-1、SREBP-1、AP-1、C/EBP、Oct-1、TATA、CCAAT、GATA-1等调控元件,没有发现CpG岛。报告基因结果表明鸡L-FABP基因启动子-2 076bp/-20bp区域具有最强的启动子活性,-522bp/-20bp区域启动子活性最弱;C/EBPα可以显著的抑制鸡L-FABP基因的表达,这些结果为深入研究鸡L-FABP的表达调控机制奠定了基础。     

山羊DCT基因启动子活性区及其转录因子调控探究

旨在探究山羊DCT基因启动子活性区及相关转录因子对该基因的调控作用,为山羊DCT基因的表达调控提供理论依据。通过对山羊DCT基因5′侧翼区序列及第一外显子区序列进行生物信息学分析,并与人和小鼠DCT基因启动子序列进行比对,同时结合在线启动子预测结果,采用快速克隆的方法构建5个5′系列缺失序列的启动子报告基因载体,以此为基础构建3′缺失序列的6个报告基因载体,并构建SOX10、MITF和OTX2转录因子结合位点点突变的6个报告基因载体,以瞬时转染的方法转染A375细胞,双荧光素酶检测试剂盒检测缺失片段和点突变片段的启动子活性。结果表明,成功构建了山羊DCT基因11个不同长度的启动子报告基因载体,-990~+232bp的P3片段荧光素酶活性极显著高于其他片段(P0.01),基于P3构建的3′系列缺失片段中-881~-154bp的P8片段荧光素酶活性极显著高于其他片段(P0.01)。转录因子SOX10结合位点突变的载体荧光素酶活性极显著降低(P0.01),MITF和OTX2结合位点突变的载体荧光素酶活性极显著增强(P0.01)。山羊DCT基因启动子核心调控区位于-881~-154bp区域,转录因子SOX10对山羊DCT基因发挥正调控作用,而转录因子MITF和OTX2对山羊DCT基因的调控作用尚需深入研究。     

5-Azadc和TSA对鸡Nanog基因启动活性及ESC多能性维持的影响

旨在克隆如皋黄鸡Nanog基因启动子,并构建含有双荧光素酶报告基因的表达载体进行启动子活性分析,找出该基因启动子的核心调控区;探索甲基化抑制剂5-Azadc(5-Aza-2′-deoxycytidine)或曲古抑菌素(Trichostatin A,TSA)对Nanog基因启动活性及其ESC体外培养条件下多能性维持的影响,为初步阐明Nanog基因的表达调控机制提供理论依据。PCR扩增Nanog基因不同长度片段的启动子序列,定向克隆至pGL3-basic载体和pEGFP-N1构建重组载体;将重组载体转染DF-1细胞后,48h收集蛋白,采用双荧光素酶报告基因检测系统测定其转录活性,确定基本转录调控区;将重组载体转染DF-1细胞后添加5-Azadc或TSA对Nanog基因进行诱导表达,并通过双荧光素酶报告基因检测系统,分析其对Nanog基因启动子活性的影响。选取生长至第3代的ESC,培养基中添加最适浓度的5-Azadc和TSA,每隔两天观察细胞,分析其对ESC体外多能性维持的影响,并对诱导至第10天的细胞进行间接免疫荧光检测。结果表明,成功构建3个片段的双荧光素酶报告基因表达载体;双荧光素酶活性检测结果显示,pGL3/1967活性最强;分别添加或者联合添加5-Azadc和TSA均可使Nanog基因的转录活性增强;5-Azadc和TSA诱导对ESC体外培养条件下多能性维持的影响结果显示,诱导6d后,对照组细胞大量分化,细胞克隆无法维持,而5-Azadc和TSA诱导组克隆明显,5-Azadc+TSA联合诱导组细胞克隆数量显著多于对照组;诱导至第10天,对照组细胞完全分化,没有细胞克隆,而诱导组存在大量细胞克隆,联合诱导组克隆数量显著多于其他两组;SSEA-1间接免疫荧光结果显示,对照组没有明显的ESC克隆,而5-Azadc组和联合诱导组细胞克隆明显,综上表明,5-Azadc和TSA可有效地通过提高Nanog基因的表达而维持鸡ESC在体外培养过程中的多能性。     

牛MYOZ2基因启动子克隆及活性分析

旨在克隆测定牛肌原调节蛋白2基因(Myozenin2,MYOZ2)启动子的全长序列,进行活性区域分析,为牛MYOZ2基因功能和表达调控机理研究提供理论依据。通过5′RACE方法确定牛MYOZ2基因转录起始位点;采用PCR技术,以牛基因组为模板克隆MYOZ2基因启动子序列。利用在线软件分析启动子区域中可能包含的转录因子结合位点。依据分析结果重新设计引物,构建7个包含不同缺失片段的双荧光素酶报告基因载体,转染C2C12细胞系,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动子活性。结果表明,克隆得到牛MYOZ2基因启动子序列2 065bp,确定MYOZ2基因的转录起始位点;MYOZ2基因片段-84/+125荧光素酶相对活性极显著高于空载体pGL3-Basic(P0.01),MYOZ2基因片段-683/+125荧光素酶相对活性极显著高于基因片段-263/+125(P0.01)。MYOZ2基因启动子核心区域位于-84/+125bp,而且MEF2,SRF,MyoD,YY1等转录因子可能参与MYOZ2基因的转录调控。     

鸭CD8α基因启动子区的克隆及荧光素酶报告基因重组体的构建

旨在了解分化群α基因可能的调控序列及其转录调控机制。本研究利用基因组步移技术扩增鸭CD8α基因的启动子区序列,使用在线软件进行序列分析;分别将鸭肝炎易感组和抗性组的CD8α基因启动子区定向亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic中,利用酶切与测序技术进行鉴定;并瞬时转染细胞,采用荧光素酶报告基因系统检测启动子载体的活性。结果,扩增出一条长度为2 480bp的片段(包含第一外显子56bp,启动子区2 424bp)。经序列分析,鸭CD8α基因启动子区具有典型的TATA-box、GC-box和CAAT-box,其转录起始位点位于翻译起始密码子ATG上游-406bp处,且发现了CdxA、Nkx-2、GATA-1、SRY等41个潜在转录因子结合位点。经酶切与测序鉴定,成功构建了鸭CD8α基因荧光素酶报告基因重组体。荧光素酶报告基因检测系统显示,构建的鸭肝炎易感组和抗性组的报告基因启动子载体具有相当的活性。研究结果为进一步探讨CD8α基因的转录调控奠定了基础。     

调控民猪Tβ4基因转录因子的筛选与分析

为了筛选调控民猪胸腺β4(Tβ4)基因转录的增强子,探究该基因的表达调控机制,本研究以民猪基因组DNA为模板,通过PCR扩增Tβ4基因启动子区系列截短片段,与pMD18-T载体连接构建克隆质粒;通过双酶切和连接反应将系列截短片段定向连入pGL3-basic载体构建双荧光素酶重组质粒;将重组质粒转染PK15细胞系,利用双荧光素酶检测系统测定重组质粒的相对荧光素酶活性;根据相对荧光素酶活性的高低进一步筛选Tβ4基因的启动子核心区域;利用3个在线软件预测核心区域内的转录因子结合位点,根据预测结果,使用重叠PCR定点缺失转录因子结合位点构建突变载体,在PK15细胞中以野生型载体为对照检测突变载体的相对荧光素酶活性。结果表明,试验成功构建了6个Tβ4基因系列截短的启动子片段,其中5个片段具有明显的活性。经过两轮的双荧光素酶活性检测发现,-155～-105 bp区域为民猪Tβ4基因的启动子核心区域,经生物信息学分析发现,该区域存在E2F-1、MYBAS1和ELK-1转录因子的结合位点。利用定点缺失构建了3个转录因子缺失的突变载体,经双荧光素酶检测发现仅有ELK-1结合位点的缺失,会造成启动子活性的显著下降(P0.05)。据此推测ELK-1是民猪Tβ4基因转录的正调控元件。     

鸡Perilipin1基因启动子的克隆及分析

旨在研究鸡脂滴包被蛋白基因(Perilipin1,Plin)启动子的结构及特征。本研究采用PCR方法扩增了鸡Perilipin1基因5′侧翼区约2kb的DNA片段,并对其进行了克隆、测序及生物信息学分析;同时,构建了其全长及系列截短突变的报告基因表达载体,瞬时转染鸡胚成纤维细胞系(DF-1),用双荧光素酶报告基因系统测定了荧光素酶活性,确定了该基因的核心启动子区域。生物信息学分析结果表明,鸡Perilipin1基因的启动子区不存在典型的TATA box结构和CpG岛,但可能存在TFIID、Sp1、AP2、PPAR、RXR、SREBP1、C/EBP、GATA、ER、KLF5等多个转录因子结合位点;报告基因分析结果表明,本研究克隆的鸡Perilipin1基因启动子能够极显著地启动报告基因的表达(P0.01),并且随着启动子片段由5′端逐渐截短,报告基因活性表现出逐渐增强的趋势,其中-360/-11片段具有最强的报告基因活性。综上表明,鸡Perilipin1基因-360/-11区域的启动子片段具有最强的转录活性,包含该基因的核心启动子序列。     

猪THRSP基因5'侧翼区序列转录调控活性的鉴定

本研究旨在对猪THRSP基因5′调控区TP526序列进行转录调控活性的鉴定,以鉴别THRSP基因调控区的功能。提取猪耳组织基因组,利用PCR技术克隆THRSP基因5′调控区TP526序列,将其插入荧光素酶报告载体中(pGL3-Basic),构建猪THRSP基因5′调控区TP526序列调控的荧光素酶报告载体(pGL3-TP526/promot-er),经PCR鉴定后,转染293T细胞,利用双报告基因检测TP526序列的启动子活性。结果显示,pGL3-TP526/promoter调控的表达载体,其萤火虫与海肾荧光素酶荧光强度之比(1.816 2±0.253 3)显著高于pGL3-Basic(0.126 7±0.020 3),呈高效表达(P<0.01)。THRSP基因5′调控区TP526序列具有启动子调控活性。     

猪Nhlh2基因启动子活性及其表达调控的初步研究

旨在研究母猪Nhlh2基因启动子活性及其与转录因子之间的调控关系,为探索该基因的表达调控提供分子水平的依据,也为研究母猪繁殖机制提供一定的参考。本研究以猪卵巢组织DNA为模板,PCR扩增Nhlh2不同长度的启动子缺失片段,克隆到pGL3-basic载体构建启动子报告基因重组质粒,并将其转染到猪卵巢颗粒细胞,测定相对双荧光素酶活性值;通过染色质免疫共沉淀技术(ChIP),研究Nhlh2启动子与YY1、C/EBPβ蛋白之间的相互作用;随后构建转录因子超表达、突变载体和小干扰RNA(siRNA),利用双荧光素酶检测系统进行活性验证。经双荧光素酶报告系统检测发现,Nhlh2基因的P7(-238~+129)区域启动子转录活性最高,-654~-238片段范围可能存在负调控元件,-238~-20区域可能存在正调控元件;通过生物信息学分析和ChIP验证,Nhlh2启动子区-101~-85和-153~-140区域分别是转录因子YY1和C/EBPβ的结合位点;突变YY1和C/EBPβ的结合位点后,P7的双荧光活性显著上调;超表达YY1和C/EBPβ后,P7的双荧光活性显著下调;干扰YY1和C/EBPβ的表达后,P7的双荧光活性显著上调。本研究确定了猪Nhlh2基因的核心启动子区域为-238~+129,YY1和C/EBPβ分别结合在Nhlh2基因启动子区的-101~-85和-153~-140区域,抑制猪Nhlh2基因的转录活性。     

猪IFN-β启动子及其NF-κB结合位点萤光素酶报告载体的构建与活性检测

通过PCR的方法从猪基因组DNA中克隆IFN-β基因启动子片段,分别构建了含有猪β干扰素基因启动子萤光素酶报告质粒及其4个重复的NF-κB结合位点序列的萤光素酶报告质粒。脂质体基因转染法将萤光素酶报告质粒转染PK-15细胞,在poly(I∶C)或poly(dAT∶dAT)的刺激下,萤光素酶表达显著增加。本试验为进一步探讨猪β干扰素信号转导通路的研究奠定了基础。     

鸡脂蛋白酯酶基因启动子的克隆及活性分析

本文旨在研究鸡脂蛋白酯酶基因(lipoprotein lipase,LPL)启动子的结构和启动子活性。采用PCR方法扩增了鸡LPL基因5′侧翼区2kb的DNA片段,对其进行克隆、测序及序列分析后,构建了其全长及系列截断突变的报告基因表达载体,瞬时转染鸡胚成纤维细胞(DF-1),用双荧光素酶报告系统测定了荧光素酶活性。生物信息学分析发现,鸡LPL基因启动子区存在Oct-1、GCbox、CCAAT、GATA、AP1等调控元件,在启动子-575～+137bp区域内存在一个CpG岛。报告基因分析表明,鸡LPL基因的启动子-359～+163bp区域就具有启动子活性,启动子-601～+163bp区域具有最强的启动子活性。结果显示,鸡LPL基因受多种转录因子和上游序列的调控,本研究为深入研究鸡LPL基因的表达调控机制奠定了基础。     

猪肌肉生长抑制素基因启动子的克隆与鉴定

利用PCR方法从猪基因组DNA中扩增了1.2 kb的肌肉生长抑制素(myostatin)基因启动子序列。并进一步以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,构建了真核表达载体MSTNPro-EGFP;通过转染C2C12小鼠骨骼肌成肌细胞和猪成纤维细胞,对猪myostatin基因启动子的转录调控活性进行鉴定。结果表明:猪myostatin基因启动子可以启动GFP在C2C12细胞中的转录和表达,而将猪MSTNPro-EGFP载体转染猪胎儿成纤维细胞后并未观察到GFP的表达,说明myostatin基因表达的肌肉特异性源于启动子的转录特异性。     

牛MyoG基因启动子的克隆及功能的初步分析

本研究旨在比较日本和牛MyoG基因的不同长度片段启动子的活性强弱并初步探讨其中的机制。根据GenBank已公布的牛MyoG基因的启动子序列,设计特异性PCR引物扩增日本和牛MyoG基因的一系列启动子缺失序列,构建重组克隆载体pMD18-T-MyoGpro,对阳性克隆进行限制性酶切鉴定、测序及生物信息学分析,进而构建一系列启动子缺失片段的pGL3-MyoGpro双荧光素酶表达载体,转染牛肌源干细胞(MDSCs)和牛胎儿成纤维细胞,并进行双报告基因活性检测。结果表明,日本和牛MyoG基因的166～2 125bp启动子都能不同程度的启动双荧光素酶报告基因在牛肌源干细胞中的表达,且具有肌肉特异性。通过生物信息学分析得知日本和牛MyoG启动子序列中有1个TATA盒,15个E-box,并可能含有MyoD、MEF2、MEF3、MTBF、TEF1、PRDF、Sp1、多个SRF、ERE、GRE及多个Oct-1等转录因子调控结合位点,本试验通过比较不同长度启动子片段的活性并结合对上述转录因子的分析,认为这些转录因子可能对启动子活性起着重要的调控作用。对牛MyoG基因启动子的克隆与功能和序列分析为进一步研究MyoG基因的表达调控奠定了基础。     

山羊脂肪酸合酶基因(FASN)启动子结构与功能的初步分析

本研究旨在对山羊脂肪酸合酶基因(Fatty acid synthase,FASN)启动子进行结构与功能的初步分析,进而对其转录调控机制进行探讨。采用PCR技术从西农萨能羊基因组DNA中克隆FASN基因启动子,通过缺失分析,构建7个包含不同缺失片段的荧光素酶报告基因载体,转染山羊乳腺上皮细胞和MCF-7细胞,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动活性。结果表明,克隆得到FASN基因的启动调控序列2 589bp,生物信息学分析发现,该启动子序列含有典型的启动转录元件TATA-box和E-box,分别位于转录起始位点(+1)上游-41和-74bp处。报告基因分析表明,启动子核心区域定位在-293～-79bp,在线软件预测发现,该区域含有Sp1、NF-Y、USF和SREBP等转录因子结合位点。结果显示,FASN基因启动子前端存在负调控元件,Sp1、NF-Y、USF和SREBP等转录因子可能参与FASN基因的转录调控。     

牛CART基因核心启动子鉴定及转录调控分析

旨在筛选牛CART基因核心启动子区并鉴定调控CART表达的转录因子,探究其转录调控机制。本研究采集3头健康母牛下丘脑组织,提取基因组DNA,通过PCR扩增、测序获得牛CART启动子序列,EMBOSS、MethPrimer、New PLACE数据库分析启动子结构特征;构建4个包含不同截短长度的CART启动子报告基因载体,双荧光素酶报告基因活性检测鉴定核心启动子区;应用DNA pull down结合质谱分析(n=3),功能聚类及结合位点预测分析筛选核心启动子区候选转录因子;构建转录因子过表达载体,转染至293T细胞,分析转录因子对牛CART核心启动子区的转录调控功能(n=3)。结果表明,牛CART基因-1 200 bp～+22 bp区域存在CpG岛和TATA box、CAAT box等顺式作用元件;构建的4个截短启动子报告基因载体均具有转录起始活性,-292 bp～+22 bp片段转录起始活性最强,为牛CART基因核心启动子区;转录因子RFX5、CREB、RFX1、JUND、TEAD4、TFAP2D、RELA可与牛CART基因核心启动子区特异性结合;进一步研究证实RFX5、RFX1、TEA...     

调控民猪Tβ4基因转录因子的筛选与分析

为了筛选调控民猪胸腺β4（Tβ4）基因转录的增强子,探究该基因的表达调控机制,本研究以民猪基因组DNA为模板,通过PCR扩增Tβ4基因启动子区系列截短片段,与pMD18-T载体连接构建克隆质粒;通过双酶切和连接反应将系列截短片段定向连入pGL3-basic载体构建双荧光素酶重组质粒;将重组质粒转染PK15细胞系,利用双荧光素酶检测系统测定重组质粒的相对荧光素酶活性;根据相对荧光素酶活性的高低进一步筛选Tβ4基因的启动子核心区域;利用3个在线软件预测核心区域内的转录因子结合位点,根据预测结果,使用重叠PCR定点缺失转录因子结合位点构建突变载体,在PK15细胞中以野生型载体为对照检测突变载体的相对荧光素酶活性。结果表明,试验成功构建了6个Tβ4基因系列截短的启动子片段,其中5个片段具有明显的活性。经过两轮的双荧光素酶活性检测发现,-155~-105 bp区域为民猪Tβ4基因的启动子核心区域,经生物信息学分析发现,该区域存在E2F-1、MYBAS1和ELK-1转录因子的结合位点。利用定点缺失构建了3个转录因子缺失的突变载体,经双荧光素酶检测发现仅有ELK-1结合位点的缺失,会造成启动子活性的显著下降（P<0.05）。据此推测ELK-1是民猪Tβ4基因转录的正调控元件。     

猪速激肽3基因启动子活性及其表达调控的初步研究

为了确定猪速激肽3基因(tachykinin3,TAC3)核心启动子区域,探索作用于该区域的转录因子对TAC3的调控作用,以猪耳组织DNA为模板,PCR扩增TAC3基因5'端不同长度缺失片段,并构建至p GL3-basic载体,转染猪卵巢颗粒细胞,通过双荧光素酶活性分析确定核心启动子区域,染色质免疫共沉淀技术(Ch IP)验证转录因子与基因启动子区的作用,构建转录因子超表达载体和小干扰RNA(siRNA)转染至猪卵巢颗粒细胞,qRT-PCR检测TAC3基因mRNA表达变化。结果显示:成功构建了TAC3基因5'端不同长度缺失片段,通过双荧光素酶报告系统分析发现,-1 310/-544区域为TAC3基因的核心启动子区,-2 486/-1 633区域可能存在负向调控元件,-1 310/-544区域可能存在正向调控元件。Ch IP检测发现转录因子C/EBPβ和YY1分别结合在TAC3基因的-653/-639和-873/-856区域;超表达C/EBPβ和YY1后,TAC3基因启动子活性显著升高(P0.05)、mRNA表达水平显著上调(P0.01);干扰C/EBPβ后,TAC3基因mRNA表达水平显著下调(P0.01);干扰YY1后,TAC3基因启动子活性显著降低(P0.05)。结果表明:转录因子C/EBPβ、YY1结合在TAC3基因的核心启动子区域,促进TAC3基因的转录活性。