ILTV gB基因与鸡IL-18基因共表达DNA疫苗的免疫原性

本试验构建了能分别或同时表达ILTV gB和IL-18基因的重组质粒pIRES-gB、pIRES-IL18、pIRES-gB/IL18。将重组质粒通过腿部肌肉多点注射免疫21日龄雏鸡,35日龄加强免疫1次,二免后2周用ILTV HN1株进行攻毒。pIRES-gB/IL18和pIRES-gB+pIRES-IL18免疫雏鸡后均能促进外周血T淋巴细胞亚群数量和血清中特异性抗体水平的增加,能明显增强ILTV DNA疫苗对强毒的攻击保护,但pIRES-gB/IL18免疫组要优于pIRES-gB+pIRES-IL18混合免疫组及其他对照组,差异显著或极显著。结果表明,鸡IL-18能明显增强ILTV DNA疫苗的免疫原性。     

PRRSV GP5蛋白及猪IL-18基因共表达核酸疫苗免疫原性试验

本试验通过分子克隆技术分别构建了单独表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5基因以及PRRSVGP5基因和猪IL-18基因共表达的重组核酸疫苗质粒（pEGFP—GP5和pEGFP—ILl8-GP5）,并进行仔猪免疫原性研究,对构建的PRRSV核酸疫苗所诱导的体液免疫和细胞免疫水平进行检测,进一步研究了PRRSV核酸疫苗免疫效果以及猪IL-18基因对PRRSV核酸疫苗免疫调节作用的影响。同时,调查了商业上应用不同类型的PRRSV疫苗诱导的免疫效果,并与核酸疫苗免疫效果进行比较。结果表明,IL-18作为免疫佐剂在疫苗免疫猪后诱导的病毒特异性细胞免疫反应方面具有很好的调节作用,共表达IL18-GP5蛋白能够明显的改善DNA疫苗的免疫效力,增强抗PRRSV的免疫保护。因此,DNA疫苗做为一种新一代疫苗可用于对抗高致病性PRRSV感染。     

融合表达猪圆环病毒2型ORF1和ORF2基因真核质粒的构建及对小鼠的免疫原性

用PCR法扩增出猪圆环病毒2型的Rep蛋白基因（933bp）和Cap蛋白基因（705bp）,将其定向克隆于真核表达载体pcDNA3.1（＋）的多克隆位点上,构建真核表达质粒pcDNA-ORF1-ORF2。将构建好的重组质粒pcD-NA-ORF1-ORF2按100μg/只腿部肌肉注射BALB/c小白鼠,同时设pcDNA-ORF1、pcDNA-ORF2、pcDNA3.1-（＋）、PCV2全毒疫苗和PBS为对照,共免疫2次,间隔2周。分别于首免后第0、7、14、21、28、42天用MTT法检测小鼠脾淋巴细胞的增殖效应,用ELISA法检测小鼠的抗体水平;并于首免后第0、7、14、21、28天测定脾淋巴细胞中各细胞亚群的比例,对该核酸疫苗的免疫原性进行初步评价。结果显示,重组质粒能诱导鼠体产生较强的细胞免疫和体液免疫,并从免疫后第7天起所测各组数据均显著高于（P〈0.05）或极显著高于（P〈0.01）其他试验组。结果表明,将ORF1和ORF2基因共同用于PCV2核酸疫苗的研发具有很好的前景,为研究新型猪圆环病毒疫苗奠定了基础。     

河北省猪圆环病毒2型ORF2基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因的核苷酸序列，设计了1对特异性引物。采用此引物从PCV2疑似病料的3个样品中扩增出了0RF2片段。将扩增片段克隆入pMD18-T载体中，筛选获得了含有相应片段的阳性重组质粒pMDHB—ORF2。对质粒中的插入片段测序后，应用DNAStar序列分析软件，对所测PCV2序列与GenBank中的国内外PCV毒株进行了同源性比较。结果，3个样品间ORF2基因的核苷酸同源性为100％；它们与浙江分离株之间核苷酸序列的同源性极高，达99．5％。     

猪2型圆环病毒ORF2基因的克隆及原核表达

采用PCR方法从已构建好的猪圆环病毒2型(PCV2)全基因重组质粒(pMD18-T-PCV2)中扩增出大小为579bp的ORF2基因,克隆到表达载体pET-32a,经IPTG诱导,成功表达了ORF2基因编码的结构蛋白。表达的重组蛋白为融合蛋白,分子量40Ku,表达量20%左右。经Western-blot检测,重组蛋白可被PCV2阳性血清识别。     

表达PCV2 CAP蛋白和猪IL-18重组PRV PGO18株的生物学特性

为了探讨表达猪圆环病毒2型(PCV2)CAP蛋白和猪IL-18的重组猪伪狂犬病病毒PGO18作为疫苗候选株的潜在价值,对其在ST细胞上的培养特性,ST、VERO、IBRS-2、PK-15和IPEC细胞上增殖情况,生长特性,遗传稳定性,对小鼠安全性及其理化特性等生物学特性进行了研究。结果表明,重组病毒PGO18株与亲本株猪伪狂犬病病毒HB98具有相似的培养特性和生长特性,在ST、VERO和IBRS-2细胞上的增殖滴度TCID50与亲本株(107.75/0.1mL)相当,遗传稳定性良好,安全性试验表明对小鼠是安全的;理化特性试验说明该病毒具有猪伪狂犬病病毒的通性。     

IBV M基因与IL-18基因共表达DNA疫苗的免疫原性

将禽传染性支气管炎病毒(IBV)的M基因和禽白介素18(IL-18)基因分别插入双顺反子质粒pIRES-EGFP/DsRed中,构建IBV M和IL-18基因的共表达质粒pIRES-M/IL18及表达M基因的pIRES-M质粒。通过脂质体转染Vero细胞,利用RT-PCR及间接免疫荧光检测质粒在体外的表达。将构建的质粒用脂质体包裹后,通过腿部肌肉多点注射免疫7日龄雏鸡,28日龄加强免疫1次;免疫前后均采血检测ELISA抗体效价和外周血CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞的数量;二免后2周用IBV肾型强毒进行攻毒。结果显示,pIRES-M/IL18、pIRES-M质粒均在Vero细胞中有效地转录并表达目的蛋白。从免疫后7 d起,pIRES-M/IL18免疫组产生的抗体水平及外周血T淋巴细胞亚群数量均高于pIRES-M组。pIRES-M/IL18、pIRES-M组对强毒的攻击保护率分别为65%和40%。以上结果表明,禽源IL-18基因与IBV M基因共表达可增强鸡体对DNA疫苗的免疫应答,提高对IBV强毒的抵抗力。     

2株猪圆环病毒ORF2基因的克隆测序

对分离到的2株猪圆环病毒PCV-2型的ORF2基因进行了扩增,将获得的PCR产物分别与T载体连接,获得了2个毒株的ORF2基因阳性克隆。序列分析表明,这2个分离株与其他中国分离株同源性高达99%以上,同处于一个基因簇,但和中国BF分离株同源性却只有92.3%。而荷兰分离的NL-PMWS-2株与中国分离株的同源性却在99%以上,表明中国流行的PCV-2和国外分离株有密切关系。     

猪圆环病毒2型HN0712株ORF2基因的原核表达

根据已测猪圆环病毒2型湖南分离株（HN0712）全基因序列,设计一对克隆和表达HN0712株ORF2全基因（709bp）的引物,利用原核表达载体pET-32a（＋）获得重组pET—ORF2质粒。经IPTG诱导后成功地在BL21宿主菌中表达分子质量约为48．2ku的融合蛋白。Western blot分析表明,该融合蛋白具有较好的反应原性。     

猪圆环病毒2型ORF3基因的原核表达

用原核表达系统表达猪圆环病毒2型ORF3基因,分析ORF3蛋白的抗原性。根据GenBank上公布的猪圆环病毒2型(PCV-2)核苷酸序列进行分析,针对ORF3基因设计并合成1对特异性引物,PCR扩增该基因,并将此片段克隆入原核表达载体pET-32a(+)上,命名为pET32a-ORF3,转化大肠杆菌Rosetta-blue(DE3)pLacⅠ感受态细胞,1.0mmol/L IPTG37℃诱导表达。结果表明,PCR扩增得到315bp的片段,重组蛋白大小约为29ku,与预期大小相符。Western blotting分析结果表明,重组蛋白能与抗His-tag的单克隆抗体反应,不与PCV-2阳性血清发生反应。猪圆环病毒2型ORF3基因能在大肠杆菌中成功表达,但与阳性血清之间没有反应原性,为进一步研究PCV-2ORF3蛋白的功能及特性奠定基础。     

白细胞介素-12对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用

犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒重要的结构蛋白和抗原蛋白。利用VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应。为进一步提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平,本研究在小鼠体内尝试了利用白细胞介素12（IL-12）基因表达载体提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平。首先采用RT-PCR方法从小鼠脾淋巴细胞中分别扩增IL-12大亚基（P40）和小亚基（P35）cDNA基因;然后在真核表达载体pcDNA3.1A上通过引入内部核糖体进入位点（IRES）序列,分别将P40基因和P35基因插入到IRES序列的上下游,构建成IL-12（P40和P35双亚基）基因表达载体,pcDNA-P40-IRES-P35。将上述表达载体与本室构建的VP2表达载体通过磷酸钙方法转染HEK 293T细胞进行瞬时表达,以确定构建的表达载体能否介导相应基因在真核细胞中进行分泌表达。然后用VP2载体单免疫和VP2载体和IL-12载体共免疫方法对小鼠进行免疫（用pcDNA3.1A作为对照）。免疫后在特定时间通过ELISA方法检测小鼠血清抗VP2蛋白的抗体水平,并通过淋巴细胞增殖实验检测免疫后35d小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应。结果表明,扩增的小鼠IL-12P40和P35亚基基因与GenBank的参考序列基本一致。Western-blot检测结果表明,重组IL-12和VP2均能够在HEK293T细胞中进行分泌性表达。ELISA检测结果表明利用IL-2载体与VP2载体共免疫小鼠,其血清中抗VP2的抗体水平明显高于VP2载体单免疫组（P〈0.01）,抗体水平在第35天高达1：5120。淋巴细胞增殖试验结果表明,免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数均明显高于对照组（P〈0.01）,VP2载体与IL2载体共免疫组的刺激指数明显高于VP2载体单免疫组（P〈0.05）。由此可见,在小鼠体内,IL-12基因表达载体可明显提高CPV VP2基因疫苗的免疫应答水平。     

猪圆环病毒2型ORF2和ORF1-2串联基因重组腺病毒对小鼠的免疫效果

为了研究含有猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2,PCV2)基因的重组腺病毒作为基因工程疫苗的潜在应用价值,利用本实验室构建的PCV2的ORF2和ORF1-2串联基因的重组腺病毒对小鼠进行了免疫并对其免疫效果进行了研究。分别用表达ORF2和OFR1-2基因的重组腺病毒Ad-ORF2、Ad-ORF1-2经肌肉途径免疫Balb/c小鼠,对免疫后小鼠的血清抗体和脾淋巴细胞中各细胞亚群的比例及其增殖反应、自然杀伤活性和特异性杀伤活性进行了检测和比较。结果表明,用表达ORF2基因和ORF1-2串联基因的重组腺病毒Ad-ORF2、Ad-ORF1-2经肌肉途径免疫Balb/c小鼠后,随着免疫次数的增加,小鼠产生的针对PCV2ORF2基因的特异性抗体水平不断升高,第3次免疫后2周达到最高,但第3次免疫后4周有所下降;免疫重组腺病毒的试验组小鼠的脾淋巴细胞增殖活性、CTL杀伤活性和NK细胞杀伤活性与免疫空载体的对照组和免疫PBS的对照组比较均有显著的差异(P<0.05)。本研究为PCV-2基因工程疫苗的深入研究及应用奠定了基础。     

猪圆环病毒2型ORF2基因克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

猪圆环病毒2型（Porcine　circovirus　type　2，PCV2）是仔猪断奶后多系统衰竭综合征（PWMS）的病原。它不但可以引起断奶仔猪发生衰竭、死亡，更为严重的是PCV2的感染可以造成免疫抑制，引起其他各种病原的继发感染，造成的间接损失难以估计。目前，PCV2己经成为严重阻碍养猪业发展的主要病原之一。     

猪圆环病毒2型ORF2重组蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)ORF2重组蛋白单抗,以纯化复性的ORF2重组蛋白作为免疫原,按常规方法免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,经ELISA筛选出了3株分泌PCV2ORF2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为1C7A4、4F3F5和4G8F7.3株细胞的培养上清中抗体效价分别为1:3 125、1:3 125、1:15 625,小鼠腹水效价分别为1:390 000、1:390 000、1:1 950 000;Western blot显示,3株单克隆抗体均能与PCV2ORF2重组发生特异性反应;辣根过氧化酶偶联4G8F7制成的酶标单抗,测定结果显示其最佳工作浓度为1:2 000.结果表明本研究利用体外重组表达PCV2ORF2融合蛋白制成的杂交瘤能够稳定分泌效价高、特异性强的单克隆抗体.     

PRRSV GP5和PCV2 ORF2双基因共表达重组腺病毒的构建及鉴定

为构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因和猪圆环病毒2(PCV2)ORF2双基因共表达重组腺病毒.将扩增的PRRSV GP5基因和PCV2 ORF2基因通过IRES元件串联,构建重组腺病毒穿梭质粒.Pme Ⅰ酶切线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,同源重组后筛选重组腺病毒质粒,经Pac Ⅰ酶切后转染293 A细胞进行包装,获得重组腺病毒.PCR鉴定表明重组腺病毒含有GP5和ORF2基因,western blot检测结果表明GP5基因和ORF2基因在293 A细胞内获得表达.     

ORF2基因缺失的PCV2的构建与部分生物学特性

设计了1对特异性引物,从疑似PMWS（断乳仔猪多系统衰竭综合征）的病料中经PCR直接扩增出PCV2全基因组,再与载体pMD18-T Simple连接后形成重组质粒pMD18-T Simple-PCV2（命名为P-S-PCV2）。用ORF2特异的限制性内切酶EcoRⅠ对P-S-PCV2进行酶切、补平连接反应,构建了ORF2基因缺失突变的重组质粒（命名为P-S-PCV2-B）。用SacⅡ酶对基因缺失突变的重组质粒进行酶切,获得的线性化的基因突变PCV2基因组在体外进行自身环化,形成了相应的基因缺失病毒粒子（命名为PCV2-B）。用PCV2-B缺失突变株进行了细胞转染、动物致病性和免疫原性、T淋巴细胞亚群的动态变化等部分生物学特性的研究,结果显示,PCV2-B转染IBRS-2细胞后,电镜观察可见病毒颗粒,PCR-RFLP检测有突变株生长。PCV2-B接种仔猪后无临床典型大体病变,PCR-RFLP检测淋巴结中有PCV-B突变病毒的感染。PCV2-B免疫仔猪后抗体没有升高;CD3＋和CD4＋整体水平下降,第2周与对照组差异显著;CD8＋与对照组差异不显著。结果表明,ORF2基因缺失突变的PCV2仍具有复制感染能力,免疫原性减弱,细胞免疫被部分激活。     

ORF9基因缺失突变PCV2的构建与部分生物学特性

设计1对针对猪圆环病毒2型（PCV2）全基因组的特异性引物,从疑似断乳仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的病料中经PCR直接扩增出PCV2全基因组,再与载体pMD18-T Simple连接后构建重组质粒pMD18-T Simple-PCV2（命名为P-S-PCV2）。用ORF9特异的限制性内切酶Bpu10Ⅰ对P-S-PCV2进行酶切、补平连接反应,构建了ORF9基因缺失突变的重组质粒（命名为P-S-PCV2-J）。用SacⅡ对基因缺失突变的重组质粒进行酶切,获得的线性化基因突变PCV2基因组在体外进行自身环化,形成了相应缺失基因DNA（命名为PCV2-J）。用PCV2-J缺失突变株进行细胞转染、动物致病性和免疫原性、T淋巴细胞亚群的动态变化等部分生物学特性的研究。结果显示：PCV2-J转染IBRS-2细胞后,电镜观察可见病毒颗粒,PCR-RFLP检测有突变株生长;PCV2-J接种仔猪后无临床典型大体病变,PCR-RFLP检测淋巴结中有PCV2-J突变病毒的感染;PCV2-J免疫仔猪后的抗体水平在第2周开始上升,与对照组相比差异显著,CD3＋下降,与对照组无差异,CD4＋下降,第1周与对照组差异显著,CD8＋与对照组差异不显著。结果表明,ORF9基因缺失突变的PCV2仍具有复制感染能力,但免疫原性减弱。     

犬GM-CSF基因对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用

犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒重要的结构蛋白和抗原蛋白.利用VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应.为进一步提高VP2 DNA疫苗的免疫活性,本实验利用犬粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因作为生物佐剂研究其对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用.首先通过RT-PCR方法从犬淋巴细胞中扩增GM-CSF基因,并将其插入到pcDNA3.1栽体上,分别构建该基因的两个分泌型真核表达载体,即非融合表达载体pcDNA-cGMCSF和与Myc His融合的表达栽体pcDNA-cGMCSF/MH.用pcDNA-cGMCSF/MH载体转染HEK293T细胞以确定GM-CSF基因能否在真核细胞中进行分泌表达.然后用本室构建的VP2基因表达栽体单免疫小鼠,用VP2表达载体与pcDNA-cGMCSF共免疫小鼠(pcDNA3.1空载体作为阴性对照).免疫后用ELISA方法检测不同时间小鼠血清的抗体水平.用MTT法检测小鼠免疫后35 d时淋巴细胞的增殖活性,同时用ELISA试剂盒检测小鼠淋巴细胞γ干扰素的表达水平.结果表明,本试验构建的表达载体能够介导重组GM-CSF在真核细胞中进行分泌表达.免疫实验表明,利用GM-CSF基因与VP2基因共免疫小鼠,抗体的水平明显高于VP2基因单免疫组(P＜0.01).共免疫组小鼠淋巴细胞的刺激指数和γ干扰素的表达水平均明显高于单免疫组(P＜0.05).由此可见,GM-CSF表达载体可明显提高CPV VP2 DNA疫苗的免疫应答水平.