盐单胞菌C6与耐盐有关DNA片段的克隆和序列分析

提取盐单胸菌（Ｈａｌｏｍｏｎａｓ）Ｃ６的总ＤＮＡ,用Ｓｑｕ３ＡⅠ部分酶切,回收１５－３０ｋｂ的ＤＮＡ片段,以ｐＬＡＦＲ３为载体在大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α中构了该菌的基因文库。以Ｃ６的基因文库为供体,以费氏中华根瘤菌（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｆｒｅｄｉｉ）盐敏感菌株ＲＣ３－３＇为受体,在辅助质凿ｐＲＫ２０１３的协助下进行三亲本杂交,在选择培养基上筛选到接合子ＲＷＨ１５和ＲＷＨ１７。质粒检     

慢生型大豆根瘤菌nfe基因的分子克隆

ｎｆｅＣ基因是从慢生型大豆根瘤菌中克隆到的,与竞争结瘤有关的基因。本研究从慢生型大豆根瘤菌菌株ＧＸ２０１的ｐＬＡＦＲ３为载体的基因文库中,筛选出与ｎｆｅ同源基因克隆。以转座子Ｔｎ５ｇｕｓＡ５诱变获得了ｇｕｓ基因表达的Ｔｎ５ｇｕｓＡ５插入突变质粒。     

山西省快生型大豆根瘤菌资源调查和鉴定

从山西省主要大豆产区的不同土壤和大豆品种中分离得到的38个快生型大豆根瘸菌株的鉴定表明,这些分离物的IAR除了氨苄青霉素外,均较慢生型为低。38个菌株被分为4个血清型,其中2个为新发现的,命名为2077和2120型。细胞成分N%含量为2.01-3.78,C%含量为50.52-55.53%,N/C值<10。所检测的7个菌株都有1-2个大质粒,且每个均有112 Md的大质粒。分离株的共生效应和结瘤竞争由于大豆品种不同而有显著差异。本研究表明,我国大豆起源地之一的山西省,快生型大豆根瘸菌的分布广泛,分离频率较高,菌株类型也多。     

联合固氮遗传工程菌的田间释放与风险评价

应用遗传工程技术分别将含有ｎｉｆＡ＾ｃＤＮＡ片段的质粒及含有Ｔｎ５：：ｎｉｆＡ的广泛宿主自杀性质粒ｐＳＺ３６转入了三个联合固氮菌，即粪产碱菌，阴沟肠杆菌及催娩克氏菌中；把Ｔｎ５：：ｎｉｆＡ－ｎｔｒＣ转入了粪产碱菌野生型菌株Ａ１５０１。这些转化结合子在高铵下表现出固氮活性，并能集聚在水稻根表，而野生型菌在相同条件下远离水稻根表。这些菌株的田间释放实验在严格控制条件下进行，应用＾１５Ｎ稀释技术测定其固     

高固氮基因工程大豆根瘤菌的研制及其增氮效应

通过构建快生型大豆根瘤菌Ｂ５２的基因文库和三亲本杂交，将增效因子ＤＮＡ片段导入优良的慢生型大豆根瘤菌２２－１０中，获得携带来自快生菌增效因子ＤＮＡ片段的工程菌株ＨＮ３２，经盆栽和小区试验，证明基因工程菌株ＨＮ３２比出发菌株２２－１０平均增产６％，比对照平均增产１３．２％～１６．９％，相当于每公顷施７５～１５０ｋｇ尿素．１９９２～１９９５年，在广西推广应用基因工程大豆根瘤菌ＨＮ３２２．１６万ｈｍ２，每公顷平均增产１９％，投入产出比１：３０。增加经济效益１４０９．８万元。     

用RAPDs研究大豆根瘤菌的遗传多样性

采用ＲＡＰＤｓ分子标记研究２８株中国大豆根瘤菌的遗传多样性，１２个随机引物扩增产物电濂昆计算机聚类分析，得出反映菌株基因组序列相似水平的树状图。由树状图得知：ＲＡＰＤｓ分析结果可以准确地将供试大豆根瘤菌分为快、慢两群。每群中又可以再划分为两个亚群。本研究的结果还表明来源于新疆的一群快生型大豆根瘤菌显著不同于其它地区的快生型大豆根瘤菌菌株，是独立的一群，与陈文新等用表型性状的研究方法得出的结论一致。     

一株大豆根系来源的不同类型土著B.japonicum菌株的共生特性

本文对未接种的大豆单株根系来源的不同类型Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ菌株共生效率进行了评价。结果表明，供试１２个菌株与６个大豆品种都形成有效共生，但不同菌株，品种和菌株－品种组合间均存在极显著差异，表现共生亲和多样性。菌株结瘤竞争力越强，其共生固氮效率越高。     

苜蓿中华根瘤菌042B与公共结瘤基因nodABC有关的大片段物？…

将苜蓿中华根瘤菌０４２Ｂ总ＤＮＡ提取,用Ｓａｕ３ＡＩ部分酶切后回收２０－３０ｋｂ长的片段,以ｐＬＡＦＲ３为载体,构建基因文库。用苜蓿中华根瘤菌ｎｏｄＡＢＣ作探针,经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交获得了三个阳性克隆Ａ,Ｂ和Ｃ,将这３个阳性克隆所携带的质粒分别命名为ｐＸＣＡ,ｐＸＣＢ,ｐＸＣＣ。在辅助质粒ｐＲＫ２０１３的帮助下,将这３个质粒分别转入ｎｏｄＣ＾－突变株ＡＫ１６５７后接种苜蓿,携带ｐＸＣＢ质粒的接合     

不带抗药性基因的nifA质粒的构建

本研究克隆了萤光假单胞菌ＡＳ１．５５（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＡＳ１．５５）的亮氨酸基因（ｌｅｕ＾＋）ＥｃｏＲＩ片段（－６．６ｋｂ）,并获得含有该片段的重组质粒ｐＢＲ３２２－ＬＥＵ。从ｐＢＲ３２２－ＬＥＵ质粒中分离出ｌｅｕ＾＋ＥｃｏＲＩ片段,将其插入到ｎｉｆＡ质ｐＭＣ７１Ａ的ＥｃｏＲⅠ位点使氯霉素抗性基因失活,从而构建了不带抗药性基因ｎｉｆＡ质粒ｐＭＣ７１Ａ－ＬＥＵ。     

苏云金芽胞杆菌新菌株S184 cry1Ab基因的克隆

通过对ＧｅｎＢａｎｋ中ｃｒｙ１类基因序列的保守区进行分析,设计一对针对其保守区的引物Ｙ５－１（ＡＧＧＡＣＣＡＧＧＡＴＴＴＡＣＡＧＧＡＧＧ）和Ｙ３－１（ＧＣＴＧＴＧＡＣＡＣ ＧＡＡＧＧＡＴＡＴＡＧＣＣＡＣ）,对苏云金芽胞杆菌（Ｂａｘｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ,Ｂｔ）新菌株Ｓ１８４质粒ＤＮＡ进行扩增,得到一大小为１．５ｋｂ的ＤＮＡ片段,序列分析显示该片段与ｃｒｙ１因基因高度同源。以此片段为     

PCR技术在快生型大豆根瘤菌菌株鉴别上的应用

以基因外重复的回文因子（ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｅｘｔｒａｇｅｎｉｃｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ，ＲＥＰ）和肠杆菌基因间重复一致序列（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｌｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃｃｏｎｓｅｎｓｕｓ，ＥＲＩＣ）的碱基顺序设计出的引物为引物，用ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）技术分别扩增了８株快生型大豆根瘤菌（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）的总ＤＮＡ，得出了具有菌株特异性的扩增产物电泳图谱，称ＲＥＰ－ＥＲＩＣＰＣＲ指纹图谱，将所得图谱进行性状编码后，用计算机数值分类系统进行平均连锁聚类分析，得出这８个菌株的聚类树状图。这一聚类结果与用其它方法聚类结果基本一致，说明ＲＥＰ－ＥＲＩＣＰＣＲ是一种鉴别快生型大豆根瘤菌菌株的经济、快速而又可靠的新方法。     

稻瘟菌侵染诱导性水稻脂氧合酶的同工酶鉴定及性状分析

稻瘟菌侵染水稻后，诱导感染叶中脂氧合酶的活性上升。本研究通过ＤＥＡＥ－Ｔｏｙ－ｏｐｅａｒｌ和ＣＭ－Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ离子交换柱层析，比较感染叶和健全叶中脂氧合酶的同工酶组成及活性变化，首次分离并鉴定出与稻瘟病抗性相关的两个诱导性同工酶即ＣＭｌｏｘ１和ＣＭｌｏｘ２。其中，亲和性稻瘟菌小种（００７）接种稻叶中ＣＭｌｏｘ１和ＣＭｌｏｘ２的活性分别是未接种健康对照的１．３和３．７倍；非亲和性小种（１３１）     

慢生型大豆根瘤菌菌株GX201的脯氨酸脱氢酶基因(putA)的分子克隆

根据已报道的脯氨酸脱氢酶基因（ｐｕｔＡ）序列,通过ＰＣＲ方法,从慢生型大豆根瘤菌菌株ＧＸ２０１的总ＤＮＡ中扩增到—ＰＣＲ产物。序列分析表明,该ＰＣＲ产物的长度为４１８ｂｐ,与已报道的ｐｕｔＡ基因具有９３．５％的同源性。以广谱寄主范围质粒ｐＬＡＦＲ３为载体,在大肠杆菌ＤＨ５α中构建了ＧＸ２０１的基因文库,并以该ＰＣＲ产物为探针,从基因文库中筛选到一重组质粒ｐＧＸＮ３００。     

产过敏素的耐氨固氮工程菌的构建

阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae)E26(pMC73A）是带有耐氨质粒的固氮工程菌。本研究通过三亲杂交的方法将带有梨火疫病菌hrp基因簇的重组粘粒pCPP430导入E26(pMC73A)。接合子在番茄叶片上出现也对照DH5（pCPP430）一样典型的过敏反应症状，而出发菌E26(pMC73A)测 没有过敏反应；从接合子抽提到2条质粒DNA带，一条与pCPP430位置相同，大小约50kb，另一条与pMC73A位置相同，大小约7kb；接合子质粒DNA的酶切图谱正好是pCPP430和pMC73A酶切图谱的叠加；用地高辛标亡的hrpN DNA上进行Southerm hybridization分析，在接合子的质粒酶切产物中得到预期的杂交带，而出发菌E26（pMC73A）无任何杂交信号。通过质粒抽提、酶切验证、Southern hybridization分析以及在番茄叶片上的过敏反应测定、均表明生产植物抗性诱导蛋白的耐氨固氮工程菌构建成功。     

芽孢杆菌(Bacillus spp.)拮抗基因的分子标记

用ＢＯＸ－ＰＣＲ指纹图谱进行了１８４个格兰氏生菌株,其中有４１个菌株与标准菌种Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ之间的ＤＮＡ指纹图谱相似性大于７０％,在离体条件下,测定这些菌株对水稻纹枯菌的拮抗性能。选出４个代表菌株（Ｇ４３３、Ｇ４３４＾－、Ｇ３９６＾＋、Ｇ２９２＾＋）用于筛选ＲＡＰＤ－ＰＣＲ的有效引物、先后共测试了１２４个随机引物,有８个随机引物能够产生明显与拮抗基因相关的ＤＮ     

用接合转移方法构建杀虫防病荧光假单胞菌

以经过改造的含有转座子Ｔｎ５的自杀质粒ｐＳＵＰ２０２１为载体，通过接合转移将苏云金杆菌杀虫蛋白基因ｃｒｙ Ｉ Ａ（ｃ）片段插入生防细菌荧光假单胞菌Ｐ３０３菌株染色体组。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析分别证实杀虫基因的导入和杀虫蛋白的表达。室内生物测定结果表明新构建的ＰＴ２１０、ＰＴ２１２等荧光假单胞菌工程菌菌株不仅保持了野生型自然菌株对小麦全蚀病良好的抑菌活性，而且表现出对小菜蛾和玉米暝     

Frankia共生固氮基因的分离与克隆

利用ＤＮＡ－ＤＮＡ杂交方法，分离细枝木麻黄的Ｆｒａｎｋｉａ菌株Ｃｏ０１的ｎｉｆ克隆ｐＣｃ１ＧＸ，赤杨内生菌株Ａｔ４的ｎｉｆ克隆ｐＡｔ１ＧＸ及沙棘的ＦｒａｎｋｉａＨｒ１８的ｎｉｆ克隆ｐＨｒ１８ＧＸ、ｐＨｒ１１－③ＧＸ。用基因功能互补法，从Ｆｒａｎｋｉａ菌株Ａｔ４的基因文库中分离到二个可能可互补豌豆根瘤菌ｎｏｄ基因功能的克隆ｐＡｔ２ＧＸ、ｐＡｔ３ＧＸ，并制作了ｐＡｔ２ＧＸ、ｐＡｔ３ＧＸ的亚克隆，予进一步实验，获得充分的证据证明ｐＡｔ２ＧＸ、ｐＡｔ３ＧＸ是否带有Ｆｒａｎｋｉａ菌株Ａｔ４的ｎｏｄ基因．     

利用付里叶转换──红外光谱（FT－IR）鉴别大豆根瘤菌初探

利用付里叶转换──红外分光光度计制作了标准大豆根瘤菌菌株２２－１０，２７－５０，ＵＳ－ＤＡ１１０及１５００６的ＦＴ－ＩＲ图谱。结果表明，所得图谱分辨率高、重复性好，并且不同菌株的图谱在指纹区（波数８００～１０００）有明显差别，这说明各菌株的ＦＴ－ＩＲ图谱是高度特异的，这种特异性可用于菌株鉴别．     

固氮粪产碱菌（Alcaligenes faecalis）表面蛋白变构作用的研究

采用电子自旋共振技术（ＥＳＲ），以马来酰亚胺自旋标记粪产碱菌野生型（Ａ１５０１）、胞外多糖突变株（ｅｘｏ＾－和ｅｘｏ＾＋＋）及工程菌（ｎｉｆ某Ａ和ｎｔｒＣ－ｎｉｆＡ重组子），监测由粪产碱菌表面多肽及些膜蛋白构象变化引起的ＥＳＲ波谱的变化。结果表明，粪产碱菌野生型菌株细胞表面特性显著不同于胞外多糖突变株及工程菌，根系粘质及ＮＨ４＾＋都能引起粪产碱菌表面蛋白的构象变化，标记后菌体ＥＳＲ参数τｃ的变化与     

3种寄生真菌发酵液对大豆胞囊线虫4号生理小种毒力研究

镰孢菌(Fusarium spp.)、厚垣轮枝菌(Verticillium chlamydosporium)和淡紫拟青霉菌(Paecilomyces lilacinus)在连作大豆田中普遍存在。本研究从大豆田土壤中分离了这3个属的真菌,实验室条件下探讨了3个属12个菌株的发酵液对大豆胞囊线虫4号生理小种胞囊、卵孵化抑制作用和对大豆胞囊线虫2龄幼虫的致死作用。结果显示,3个属12个菌株的发酵液对大豆胞囊线虫4号小种都具有抑制作用,抑制其胞囊和卵孵化,并对二龄幼虫具有致死作用。12个菌株发酵原液对胞囊孵化抑制率在50. 6%～85. 6%,对卵孵化抑制率在51. 3%～69. 7%,稀释5倍、10倍、20倍和50倍发酵液也对胞囊孵化和卵孵化也具有抑制作用。12个菌株发酵液对大豆胞囊线虫2龄幼虫均具有致死作用,原液在处理1h就开始出现致死毒性,48 h到72 h致死作用达到高峰。供试菌株中以镰孢菌的F-9菌株、淡紫拟青霉菌的P-E菌株和厚垣轮枝菌V-25菌株发酵液对大豆胞囊线虫抑制作用显著。该结果可为开发大豆胞囊线虫生防菌提供依据。