牛亚科4个群体MHC-DRB3.2座位酶切多样性分析

采用限制性内切酶HaeⅢ、BstYⅠ分别对鲁西黄牛、渤海黑牛、盱眙水牛和中国荷斯坦奶牛MHC-DRB3.2基因的半巢式PCR产物进行酶切.结果表明:4个群体均在HaeⅢ酶切位点上表现多碱基突变,盱眙水牛等位基因数少于其他3个群体;鲁西黄牛、渤海黑牛和中国荷斯坦奶牛在BstYⅠ酶切位点上表现多碱基突变,而盱眙水牛未检测到突变;x2适合性检测表明鲁西黄牛、盱眙水牛2个群体在Hae Ⅲ酶切位点上碱基突变偏离Hardy-Weinberg平衡状态,中国荷斯坦奶牛在BstYⅠ酶切位点上碱基突变也偏离Hardr-Weinberg平衡状态,而鲁西黄牛和渤海黑牛在BstyⅠ酶切位点碱基突变已经或基本接近Hardy-Weinberg平衡;根据DA遗传距离和Roger遗传距离的NJ法和UPGMA法对4个群体进行亲缘关系聚类,鲁西黄牛和渤海黑牛首先聚为一类,其次是中国荷斯坦奶牛,盱眙水牛最后加入.结果显示:用牛的PCR-RFLP体系可进行水牛的MHC-DRB3.2基因的研究;盱眙水牛MHC-DRB3.2基因的突变率低于黄牛.     

牛亚科5个群体β-Lg基因PCR-RFLP分析

应用PCR-PFLP技术,分析荷斯坦奶牛、鲁西黄牛、闽南黄牛、渤海黑牛和青海牦牛5个群体741头个体β-乳球蛋白（β-Lg）基因第4外显子和β-Lg 5′侧翼区2个基因座的多态性。结果表明：前4个群体β-Lg A、B基因频率分别为0.4125/0.5875、0.1419/0.8581、0.0333/0.9667和0.1857/0.8143,β-Lg 5′侧翼区A、B基因频率分别为0.412 5/0.5875、0.7286/0.2714、0.7328/0.2672和0.8637/0.1364;牦牛β-Lg B和E基因频率为0.0732/0.9269,未发现其他等位基因。适合性检验表明：β-Lg第4外显子在荷斯坦奶牛、鲁西黄牛和渤海黑牛3个群体中已达Hardy-Weinberg平衡状态,而闽南黄牛未达到平衡状态;β-Lg 5′侧翼区位点荷斯坦奶牛群体接近平衡,其余群体均已达平衡。群体遗传学分析表明：除闽南黄牛β-Lg 5′侧翼区为低度多态外,2个位点在其余群体内均为中度多态,荷斯坦奶牛这2个位点的杂合度和期望杂合度最高,闽南黄牛最低。提示这一研究成果为开展地方遗传资源保护奠定了基础。     

牛HSFl和HSBPl基因多态性分析

利用DNA测序技术对牛HSFl和HSBPl进行SNPs位点扫描,共发现4个新SNPs,包括HSFl 1451(G/T)位点、HSBP1第二内含子324(G/C)、589(C/T)和651(C/G)位点.利用CRS-PCR和PCR-RFLP技术对867头荷斯坦牛、85头鲁西黄牛和28头渤海黑牛进行基因多态性分析.X2检验表明,HSFl 1 451(G/T)位点和HSBPl 589(C/T)位点在荷斯坦牛和鲁西黄牛群体中已达到Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05),而HSBPl 324(G/C)和651(C/G)位点的突变在荷斯坦牛群中均未达到Hardy-Weinberg平衡状态(P＜0.05).HSFl 1 451位点(G/T)AA基因型频率最高,优势等位基因为A,而HSBPl 3个SNPs频率最高的基因型分别为AB、AA和BB,589(C/T)位点的优势等位基因为A,而324(G/C)和651(C/G)位点均为B.HSBP1 651(C/G)位点不同基因型的分布在三个牛品种中存在差异,在荷斯坦牛中AA型频率最低,而在鲁西黄牛和渤海黑牛中AA型频率最高,推测该基因型与耐热性有关.该结果将为奶牛耐热分子育种提供理论参考.     

利用PCR-RFLP方法检测中国荷斯坦牛STAT4基因内含子20多态性

以浙江省金华市伊康乳业奶牛场核心群357头中国荷斯坦牛为试验材料,旨在建立一种中国荷斯坦牛STAT4基因内含子20的单核苷酸多态性的简便检测方法。首先采用PCR-SSCP检测,结合DNA测序方法对STAT4基因内含子20的遗传多态性进行分析,并根据突变形式将PCR-SSCP检测方法转化为PCR-RFLP检测方法。结果发现STAT4基因内含子20内存在由g.95879 G>A和g.96013 G>C组成的完全连锁的单倍型模块。根据96013 G→C的突变可形成一个SduⅠ酶切多态位点的特性,建立了该单倍型的SduⅠ酶切检测体系。利用该体系检测到中国荷斯坦牛群体STAT4内含子20内存在GGGG,GAGC和AACC 3种不同的基因型,基因型频率分别为0.0784,0.4538和0.4678,而GG和AC基因频率分别为0.3053和0.6947。     

荷斯坦奶牛BoLA-DRB3基因PCR-RFLP多态性分析

分别采用HaeⅢ和BstYI内切酶,以PCR-RFLP方法检测了新疆地区引进的澳大利亚荷斯坦奶牛BoLA-DRB3基因的多态性。结果显示:在HaeⅢ酶切分析中检测到6种基因型,3个等位基因,其中基因型AB频率最高,等位基因A为优势基因;在BstYI酶切分析中共检测到3种基因型,2个等位基因,其中基因型AA频率最高,等位基因A为优势基因。经χ2适合性检验,BoLA-DRB3基因的HaeⅢ酶切位点的碱基突变偏离Hardy-Weinberg(P<0.01)平衡状态,而BstYI酶切位点碱基突变达到Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。     

4个不同地理群体中华鳖pomc基因PCR-RFLP分析

为探讨不同地理群中华鳖的pomc基因的多态性,建立区分中华鳖不同地理群的分子遗传标记,采用PCR-RFLP的方法扩增得到4个不同地理群(太湖鳖群体、沙鳖群体、台湾鳖群体和黄河鳖群体)中华鳖的pomc基因,比较4个地理群中华鳖的pomc基因的同源性,构建遗传进化树,对其亲缘关系进行分析,并用AccⅡ、BscBⅠ、AsuⅠ和TscⅠ4种限制性内切酶对pomc基因进行酶切分析。结果显示： 4个不同地理群的中华鳖均能扩增出786 bp的pomc基因。亲缘关系分析表明：在遗传上台湾鳖和沙鳖亲缘关系较近,而太湖鳖与黄河鳖亲缘关系较近。用酶切分析pomc基因扩增产物,结果表明:用AccⅡ内切酶对4种中华鳖pomc基因进行酶切,其中沙鳖切出303 bp和483 bp 2个条带,而其他3个种属的中华鳖只有1个786 bp的条带。用BscBⅠ酶对4种中华鳖pomc基因进行酶切,其中台湾鳖和沙鳖切出351 bp和435 bp 2个条带,而其他2个种属的中华鳖只有1个786 bp的条带。用AsuⅠ酶对4种中华鳖pomc基因进行酶切,其中台湾鳖和黄河鳖切出349 bp和437 bp 2个条带,而其他2个种属的中华鳖只有1个786 bp的条带。用TscⅠ酶对中华鳖pomc基因进行酶切,其中黄河鳖和太湖鳖切出349 bp和437 bp 2个条带,而其他2个种属的中华鳖只有1个786 bp的条带。这4个限制性内切酶的联合使用分析,可使这4个地理群的中华鳖在分子水平都得到明确的鉴定。从这4个地理群的中华鳖pomc基因核苷酸序列的显著差异和酶切位点的变化,进一步证明pomc基因可以作为区分这4个不同地理群中华鳖的分子遗传标记。     

猪NCOA1基因PCR-RFLP多态性分析

[目的]研究猪NCOA1基因的PCR-RFLP多态性,为猪的分子育种和标记辅助选择提供理论依据。[方法]以81头山东寿光六和原种猪场的长白猪为研究对象,采取常规酚-氯仿抽提法从猪耳组织提取基因组DNA,以基因组DNA为模板进行PCR扩增获得440bp的NCOA1基因目的片段,利用限制性内切酶RsaⅠ对PCR产物进行酶切和琼脂凝胶电泳检测,并计算各等位基因频率和基因型频率。[结果]琼脂糖电泳检测酶切产物出现3种基因型：AA型（1条带：440bp）、AB型（3条带：440、282、158bp）、BB型（2条带：282、158bp）;基因型频率分别为0.54、0.43和0.03;A和B2个等位基因的基因频率分别为0.76和0.24。[结论]该研究猪群中,A为优势等位基因,AA基因型频率较高。     

中国5个牛种leptin基因外显子3的多态性分析

利用改进的DNA提取方法和PCR-RFLP技术,对南阳牛、秦川牛、西镇牛、鲁西牛(地方黄牛品种)和荷斯坦奶牛等5个牛品种的263头个体lep tin基因外显子3多态性进行了分析。结果表明,牛lep tin基因外显子3长度为330 bp,存在H aeⅢ和Ap aⅠ限制性内切酶的酶切位点,但在这2个酶切位点上无多态性,2种酶酶切片段长度均为70 bp和260 bp。说明牛lep tin基因外显子3在H aeⅢ和Ap aⅠ2个酶切位点上具有保守性。     

牛HSF1和HSBP1基因多态性分析

利用DNA测序技术对牛HSF1和HSBP1进行SNPs位点扫描,共发现4个新SNPs,包括HSF1 1451(G/T)位点、HSBP1第二内含子324(G/C)、589(C/T)和651(C/G) 位点。利用CRS-PCR和PCR-RFLP技术对867头荷斯坦牛、85头鲁西黄牛和28头渤海黑牛进行基因多态性分析。χ2检验表明,HSF1 1451(G/T)位点和HSBP1 589(C/T)位点在荷斯坦牛和鲁西黄牛群体中已达到Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05),而HSBP1 324(G/C)和651(C/G)位点的突变在荷斯坦牛群中均未达到Hardy-Weinberg平衡状态(P＜0.05)。HSF1 1451位点(G/T)AA基因型频率最高,优势等位基因为A,而HSBP1 3个SNPs频率最高的基因型分别为AB、AA和BB, 589(C/T)位点的优势等位基因为A,而324(G/C)和651(C/G)位点均为B。HSBP1 651(C/G)位点不同基因型的分布在三个牛品种中存在差异,在荷斯坦牛中AA型频率最低,而在鲁西黄牛和渤海黑牛中AA型频率最高,推测该基因型与耐热性有关。该结果将为奶牛耐热分子育种提供理论参考。     

东北民猪SLA-DQA基因的PCR-RFLP多态性分析

采用克隆测序和PCR-RFLP的方法对SLA-DQA基因的整个编码区进行了扫描和多态性分析。结果表明该基因的第2外显子是整个基因的高变区,突变率达到5.6%,其中80%为有效突变,但没有发现新的等位基因;PCR-RFLP结果表明外显子2用限制酶EcoR I酶切可获得3种基因型:254 bp(AA)、254 bp/88 bp/ 166 bp(AB)、88 bp/166 bp(BB),用限制酶PvuⅡ酶切可获得3种基因型:254 bp(AA)、254 bp/129 bp/125 bp (AB)、129 bp/125 bp(BB),外显子3用限制酶FbaⅠ酶切可获得3种基因型:282 bp(AA)、282 bp/130 bp/152 bp (AB)、130 bp/152 bp(BB),外显子4用限制酶Hin1Ⅰ酶切可获得3种基因型:184 bp(AA)、184 bp/83 bp/101 bp (AB)、83 bp/101 bp(BB);Hardy-Weinberg平衡分析表明民猪在EcoRⅠ位点处于平衡状态(P<0.05),而在PvuⅡ位点处于不平衡状态(P>0.05),FbaⅠ和Hin 1Ⅰ位点处于极不平衡状态(P>0.01)。     

羊驼皮肤KAP3.2基因3′端序列的cDNA克隆及序列分析

利用大规模筛选表达序列标签(ESTs)方法,从羊驼皮肤cDNA文库中筛选出角蛋白关联蛋白(Ker-atin Associated Protein,KAP)KAP3.2基因的3′端序列,Genbank序列号为EV554632。利用生物信息学方法对此序列进行分析,结果表明,该基因片段大小为454bp,完整的ORF编码35个氨基酸;通过对其功能域分析得出,不含信号肽,在系统进化上,羊驼与人和黑猩猩的遗传距离较近。     

猪PGC1基因PCR-RFLP多态性研究

通过PCR-RFLP方法,检测外来品种大约克猪和江苏省地方品种梅山猪、二花脸猪、姜曲海猪以及培育品种苏钟猪共144头,结果表明,PGC1基因序列经AluⅠ酶切后存在AA、AT和TT 3种基因型,其中大约克猪中AA基因型占优势,A等位基因频率为0.7;江苏省地方品种猪中,TT基因型占绝对优势,T等位基因频率平均为0.99,梅山猪和二花脸猪均为TT型。PGC1基因的PCR-RFLP基因型分布χ2检验结果表明,大约克猪与苏钟猪、梅山猪、二花脸猪、姜曲海猪差异极显著;苏钟猪与梅山猪、二花脸猪、姜曲海猪差异极显著;梅山猪、二花脸猪、姜曲海猪三者之间无显著性差异。     

鲁西黄牛H-FABP基因的多态性及其与肉质性状关系的分析

利用PCR-RFLP方法在鲁西黄牛H-FABP基因内发现了1个变异酶切位点,为in tron 2上的H aeⅢ-RFLP。利用最小二乘线性模型对不同分子标记基因型效应值间肉品质大理石花纹评分和嫩度性状差异显著性检验,结果表明:鲁西黄牛H-FABP基因中BB纯合基因型对牛肉嫩度剪切力值有较大的影响(P<0.05);对大理石花纹评分来说,3种基因型AA、AB和BB之间差异不显著。     

奶牛乳铁蛋白基因启动子区PCR-RFLP分析与乳房炎的相关性

采用CMT方法检测奶牛的乳房炎发病情况.筛选 90头分别设为对照组(健康奶牛)、隐性乳房炎组 (试验组Ⅰ )和临床乳房炎组(试验组Ⅱ),每组 30头.检测每头奶牛的NAGase活性,并用限制性片段长度多态性 (RFLP)分析技术,检测乳铁蛋白(Lf)基因启动子区域的RFLP多态性.结果表明:不同组别的奶牛之间NAGase活性差异显著 (P<0. 01),且Lf基因启动子区域存在RFLP多态性,说明该多态性与乳房炎存在一定关系,可能是奶牛乳房炎的一个分子标记.     

秦川牛TNFSF11基因多态性及与体尺性状的相关性

为研究秦川牛TNFSF11基因多态性及其与秦川牛体尺性状的相关性,以399头同等饲养条件下的18～24月龄健康秦川母牛为研究对象,采用PCR-RFLP技术结合DNA测序技术检测TNFSF11基因的SNPs位点,并将其与秦川牛体尺性状进行关联分析。结果表明,DNA测序发现在TNFSF11基因第3内含子即34 080bp处(C331区域)和第3内含子34 096bp处(C332区域)分别发生C→T突变和T→C突变;PCR-RFLP分析发现,秦川牛TNFSF11基因C331区域经创造酶切位点后可以被限制性内切酶HincⅡ特异切割为有GG、GH和HH 3种基因型,C332区域可以被内切酶BseLⅠ特异切割为MM、MN和NN 3种基因型;与测序结果比对显示,秦川牛TNFSF11基因C331、C332各酶切基因型与测序结果显示相一致。卡方检验显示,C331位点在所检测牛群中处于Hardy-Weinberg平衡状态(P0.05),而C332位点则处于Hardy-Weinberg极度不平衡状态(P0.01);且C331处GH基因型为优势基因型,G等位基因为优势等位基因,处于中度多态状态;C332处基因型MM为优势基因型,M等位基因为优势基因,处于中度多态状态;关联分析表明,C331位点不同基因型个体间在腰高、腰角宽和胸围方面差异显著(P0.05),C332位点在体斜长和腰高方面差异显著(P0.05)。经连锁不平衡检测发现,两位点存在一定的连锁特性(r2=0.213),将两突变位点进行单倍型分析可知,HHMM基因型各性状均显著高于其他基因型组合,且多标记位点的组合效应值高于单标记位点。说明TNFSF11基因对秦川牛体尺性状有显著的影响,可以作为秦川肉牛新品系培育早期选择的候选基因,其中组合HHMM可能是影响秦川牛体尺胴体性状的最佳基因型组合,在选育中应加大其选择力度。     

6个牛品种在FSHR基因位点的遗传关系及其多态对双胎性状的标记

用PCR-RFLP技术,对秦川牛、中国荷斯坦牛、晋南牛、南阳牛、延边牛、中国西门塔尔牛6个牛品种176个个体的促卵泡素受体(FSHR)基因5′端进行多态性分析,4种内切酶对PCR产物的单酶切结果发现,Pst ,Sin 和Hae 3种内切酶的酶切产物均为单态,而Taq 的酶切产物出现多态性,表现为3种基因型(AA,BB,AB),品种间基因频率和基因型频率均有较大差异。对3个有单双胎记录牛的品种分析发现,秦川牛双胎母牛的等位基因A(0.5500)及基因型AA(0.5000)的频率高于单胎母牛(A:0.3500,AA:0.3000);而荷斯坦牛双胎母牛的等位基因B(0.5937)及基因型BB(0.6875)的频率均高于单胎母牛(B:0.5416,BB:0.4167),在后代中有同样的趋势;在中国西门塔尔牛的双胎母牛、随机母牛及种公牛3种类群中,双胎母牛和种公牛的等位基因B(0.5909,0.5417)和杂合子基因型AB(0.8182,0.9167)的频率高于随机母牛(B:0.3182;AB:0.4546)。根据Nei氏标准遗传距离聚类分析,表现为西门塔尔牛和延边牛首先聚在一起,然后晋南牛、秦川牛、荷斯坦牛、南阳牛依次加入。