牛X、Y精子差异表达基因筛选与性控DNA疫苗的研究

本课题按照课题计划任务书的进度要求，已完成流式分离≥99％纯度奶牛X、Y精子样本准备和纯度验证以及奶牛精子总RNA提取纯化的关键技术研究，高纯度牛X精子和Y精子作为材料，采用固相支持物磁珠扣除杂交和低丰度mRNASuperSMART技术构建Y—X扣除杂交cDNA质粒库，克隆菌落PCR鉴定后，     

一种改进的固相扣除杂交法直接克隆全长差异表达基因

该文集多种分离差异表达基因方法的优点于一体,自行优化了一种基于固相扣除杂交和聚合酶链式反应(PCR)技术直接克隆全长差异表达基因的策略．该策略中的所有操作步骤,包括poly (A)+mRNA的分离,cDNA的合成和扣除杂交都是在磁珠上进行的,操作简单易行．扣除杂交是用结合在磁珠上的以oligo(dT)为引物合成的对照材料（Driver）的cDNA第一链,直接扣除加有接头的处理材料（Tester）cDNA第二链中的共有序列．多次反复使用Driver一链与Tester二链进行杂交,能有效去除Tester二链中的共有序列.磁珠的分离能最小限度地减少每次杂交造成的损失．最后一轮扣除后的Tester二链中,含有大量差异表达序列,用Tester二链特有的接头引物进行扩增,能进一步提高扣除效率．该文选用此扣除方法,成功分离到了低温驯化沙冬青幼苗和对照苗2个群体的18个差异表达克隆,其中有4个克隆是全长cDNA序列．经序列分析发现,这些基因都与低温相关,进一步说明,该方法可用于克隆未知差异表达基因．      

Sry基因探针FISH检测奶牛XY精子纯度

为探讨荧光原位杂交技术（FISH）在评价奶牛精子纯度方面的应用价值，制备地高辛标记Sry基因探针，对分选X、Y精子及常规精子标本进行RNA水平的精子荧光原位杂交分析。结果显示，荧光原位杂交测定分选X、Y精子及常规精子纯度分别为94.6%、93.3%、50.3%，与对应精子纯度比较差异不显著（P>0.05），杂交信号多出现在精子尾部中段。可见：建立的Sry基因探针FISH方法评价奶牛精子纯度鉴定结果准确可靠，为其他精子纯度评价方法提供可靠的技术支持。     

牛冠状病毒N蛋白的原核表达及核酸适配体筛选

[目的]对牛冠状病毒N蛋白进行原核表达,利用指数富集的配基系统进化技术筛选N蛋白的核酸适配体,为该病诊断方法的建立奠定基础.[方法]根据牛冠状病毒基因序列,设计N蛋白编码基因特异性引物,扩增目的基因并通过酶切、连接、转化构建原核表达载体pET-28a-N,优化N蛋白表达条件,镍柱纯化获得高纯度高浓度的N蛋白.利用微孔板法,经过包被、封闭、加文库、洗脱、提取、PCR、胶回收和反筛等步骤从原始核酸适配体文库中筛选出N蛋白特异性适配体,连接T载体转入DH5a感受态细胞后,经菌落PCR鉴定和测序获得与N蛋白特异性结合的适配体序列,测定其结合常数,并利用在线软件预测其二级结构.[结果]成功表达出约55 kD的重组蛋白;经微孔板法筛选出67条适配体序列,其中N-12、N-33和N-45出现多次重复,经测定3条核酸适配体均具有环状、发卡结构,利于与目标蛋白稳定结合.[结论]筛选的3条核酸适配体有望用于牛冠状病毒病早期诊断用酶联适配体方法的建立.     

金边也门铁花叶性状差异表达基因的 cDNA-AFLP分析

[目的]筛选金边也门铁花叶性状相关差异表达基因,为深入探索也门铁叶色形成的分子调控机制打下基础.[方法]基于cDNA扩增片段长度多态性分析技术(cDNA-AFLP),利用64对EcoR I和Mse I选择性扩增引物组合分析金边也门铁叶片绿色与黄色部分组织cDNA,经筛选、回收、克隆、测序和BLAST比对分析获得差异表达基因.[结果]利用64对引物组合共扩增出1726条可分辨的条带,并获得58条差异表达的转录衍生片段(TDFs),其中12条TDFs为特异性表达.12条特异性TDFs中,5条TDFs具有同源序列,另外7条TDFs无同源序列,为未知功能基因.在叶片黄化部位特异表达同源性为96%的TDFs序列M8E3B-2和M8E3B-3与大丽花花叶病毒Holland包涵体蛋白基因、紫茎泽兰明脉病毒基因、洋丁香黄化卷叶病毒基因等花椰菜花叶病毒科病毒基因具有较高的同源性.[结论]M8E3B-2和M8E3B-3两条TDFs序列或来源于一种花椰菜花叶病毒科病毒基因,且有可能参与了金边也门铁花叶叶色性状的形成过程.     

打顶烟草根尖组织抑制性消减cDNA文库的构建及其序列分析

[目的]构建烟草打顶后根尖组织的消减文库,寻找调控烟碱生物合成的相关候选基因.[方法]以打顶株为测验子(tester)、以非打顶株为驱赶子(driver),利用抑制性消减杂交(suppression subtractivehybridization,SSH)和反向Northern杂交技术构建和筛选烟草打顶前后根尖组织消减文库,并对差异表达克隆进行生物信息学分析.[结果]构建了具有高消减效率的cDNA文库.PCR验证消减文库阳性克隆的插入片段为200-1 000 bp.经反向Northern杂交,从850个克隆中筛选到560个杂交信号差异明显的克隆,测序后得到273条有效序列.对273个已知功能基因的ESTs进行分类,生物碱合成类占4%、植物激素代谢类占3%、信号转导和转录因子类占18%、胁迫和防御类占32%、蛋白质代谢占9%,碳代谢占6%、其它代谢占15%,功能未知类占13%.RT-PCR结果显示,NTAT84和NTAT71序列在烟株打顶后转录活性均升高.[结论]应用SSH技术构建了烟草打顶前后根尖组织消减cDNA文库.     

毛白杨酵母单杂交体系的建立

[目的]通过建立酵母单杂交文库筛选出与毛白杨特异性调控元件结合的候选蛋白,为研究毛白杨木材合成相关基因奠定基础.[方法]采用模板基因PCR方法,分别将ABRE-box、AC-box及-317-Box三次重复序列连接至pAbAi诱饵质粒上,再将诱饵载体转入酵母中;使用磁珠法获得mRNA,采用SMART技术合成cDNA,以cDNA为模板进行LD-PCR并将产物纯化后与pGADT7-Rec载体共转化诱饵酵母,同时进行文库的构建与筛选.[结果]以pBI121质粒为模板扩增获得的ABRE/AC/-317-GUS片段约为650 bp.以Kpn I对重组质粒pAbAi-ABRE/AC/-317-GUS进行单酶切,获得约5000 bp的大片段与650 bp的小片段;测序结果表明,插入序列与ABRE/AC/-317序列一致且方向正确.在SD/Ura培养基中,当AbA为100 ng/mL时,酵母菌落数为0,建库时AbA为100 ng/mL.cDNA与pGADT7载体共转化的酵母Y 1HGold(pAC-AbAi)细胞稀释100倍后,在SD/-Leu培养基上长出89个克隆,含AC-box的诱饵酵母所建库容量为1.3×106,且无rRNA污染.酵母转化产物在SD/-Leu/AbA(100 ng/mL)培养基上长出18个克隆,大于250 bp的有13个克隆;测序和同源分析结果表明,成功筛选到5个候选蛋白,主要是蛋白激酶、核小体蛋白及功能未知蛋白,这些蛋白可作为与AC元件结合的候选蛋白.[结论]建立的毛白杨酵母单杂体系可用于进一步筛选与木材合成相关的基因.     

酵母单杂交文库构建及巨峰葡萄VvFT基因启动子上游调控因子筛选

[目的]利用酵母单杂交文库筛选巨峰葡萄VvFT基因启动子上游调控因子,挖掘参与调控葡萄开花时间的因子,为揭示花期转变代谢通路和定向改良葡萄品种提供理论参考.[方法]利用PlantCARE分析预测VvFT基因启动子顺式作用元件,并以VvFT基因启动子为诱饵,利用酵母单杂交文库筛选技术,筛选作用在VvFT基因启动子上游的调控因子.[结果]葡萄VvFT基因启动子区域存在13种启动子顺式作用元件,包括A-box、CAAT-box和TATA-box组成型调控元件;光响应调控元件ATC-motif、Box 4、G-Box和GT1-motif;茉莉酸甲酯(MeJA)响应调控元件CGTCA-motif和TGACG-motif;干旱诱导的MYB结合位点元件MBS;玉米蛋白代谢必需的调控元件O2-site;参与生物钟控制的调控元件circadian;厌氧诱导必需调控元件ARE.以VvFT基因启动子为诱饵,筛选获得34条表达序列标签(EST),其中有21条为未知功能,有13条在植物生长、抗逆防御、信号转导、转录调控、蛋白酶等方面均有已知或预测的功能,包括转录抑制因子ft41、GRF1互作因子ft44、NAP1相关蛋白ft64及ft70分子伴侣DnaJ10.酵母单杂交点对点验证结果表明VvDnaJ10和VvFT基因启动子之间有相互作用.[结论]通过酵母单杂交文库筛选获取13条候选EST,虽然大部分EST功能预测分析结果与VvFT调控开花时间无明显的直接关系,但研究结果为进一步探索VvFT转录或表达水平控制葡萄开花时间的分子机制提供侯选基因.     

融合杀虫基因对甘蔗的遗传转化

[目的]利用MAR序列介导转基因表达及融合杀虫基因,以期克服外源基因失活,增强抗虫基因表达能力,延缓昆虫抗性的发生,获得高抗虫转基因甘蔗植株.[方法]以甘蔗品种ROC25为材料,进行愈伤组织、芽苗分化和生根的Hyg抗性筛选试验.利用农杆菌介导,将含MAR序列介导融合杀虫基因(AVAc-CpTI)导入甘蔗基因组.[结果]愈伤组织增殖、出芽时Hyg的最佳筛选浓度为50 mg/L,生根时Hyg的最佳筛选浓度为30 mg/L.获得13个MAR序列介导转基因表达基因系,48株Southern杂交阳性甘蔗植株;获得8个无MAR序列介导转基因表达基因系,7株Southern杂交阳性甘蔗植株.MAR序列介导转基因表达使转化过程中转基因系的获得数量提高了62.5%.[结论]建立了ROC25的潮霉素抗性筛选体系;MAR序列介导融合杀虫基因进行甘蔗遗传转化,可提高甘蔗外源基因转化效率.     

利用高通量测序技术分析IHHNV感染凡纳滨对虾的基因差异表达

[目的]研究传染性皮下及造血组织坏死病毒（Infectious hypodermal andhematopoietic necrosis virus,IHH-NV）感染凡纳滨对虾的基因差异表达,为进一步了解IHHNV与凡纳滨对虾的相互作用分子机制提供参考.[方法]采用454高通量测序技术对IHHNV感染和对照凡纳滨对虾进行转录组测序,测序获得的序列除去接头后用iAssembler软件进行拼接得到unigene（单一基因序列）,通过计算各unigene的转录本数目（RPKM）确定差异表达基因,并以实时荧光定量PCR验证基因的差异表达.[结果]采用454高通量测序技术对IHHNV感染和对照凡纳滨对虾进行转录组测序,共获得208690条短序列,序列拼接共得到21912条tmigenes;通过对IHHNV感染和对照凡纳滨对虾的测序数据比较分析,结果发现221个差异表达基因,包括81个上调表达基因和140个下调表达基因.经实时荧光定量PCR验证,454高通量测序数据统计的基因表达差异结果可靠.[结论]IHHNV感染显著影响凡纳滨对虾免疫相关基因的表达,而利用高通量测序技术可有效检测出这些差异表达基因.