利用玉米萌动胚转化体系获得抗除草剂转基因新材料

以玉米杂交种郑单958为受体材料, 建立农杆菌介导的玉米萌动胚转化体系, 并获得抗除草剂转基因玉米材料。经过对农杆菌菌液浓度、共培养时间、乙酰丁香酮的浓度的优化, 农杆菌介导的玉米萌动胚转化法的最优参数为菌液浓度OD₆₀₀值为0.8, 共培养时间为48 h, 乙酰丁香酮的浓度为100 μmol/L。获得69株PCR阳性植株, 其中54株为bar基因金标免疫试纸条检测阳性植株, 29株获得种子;T1代植株具有草丁膦抗性, 并显示出胶体金免疫酶联反应阳性, 表明目的基因已整合玉米基因组内并有效表达, 而且能够稳定遗传给后代。     

含ipt融合基因的根癌农杆菌转化大豆萌动种胚的研究：Ⅰ苗期子叶的…

本实验以大豆萌动种胚为受体，用含用３５Ｓ启动子－Ｇｕｓ基因－ｉｐｔ基因－Ｎｏｓ基因的融合基因根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４进行转化。通过对转化及对照植株苗期子叶过氧化物酶同工酶及酯酶同工酶分析，结果表明酶谱有明显差异，过氧化物酶同工酶有两条差异带：Ｒｆ０．５０９及Ｒｆ０．７１２；酯酶同工酶有一条差异带：Ｒｆ０．５３１。综合分析，上述三条差异带都显示的转化植株占所分析的转化植株的１４．４％。此法可作为转基     

农杆菌侵染玉米芽尖转化BcWRKY1转录因子基因的初报

以玉米自交系鲁9801、K10芽尖为受体,采用农杆菌介导法转化BcWRKY1转录因子基因,同时优化了遗传转化体系。结果表明,乙酰丁香酮浓度为100μmol/L、0.05个大气压下真空处理侵染10 min转化率最高。实验共筛选出98株除草剂抗性植株,其中23株PCR呈阳性,18株结实。     

农杆菌介导玉米幼胚遗传转化体系的研究

以携带pCAMBIA1301(含GUS基因)质粒的EHA105菌株侵染玉米优良自交系齐319的幼胚,培养3 d后,借助GUS基因的瞬时表达率,对影响农杆菌介导玉米幼胚转化的部分因素进行优化。结果表明,农杆菌侵染液最佳浓度OD600为0.4～0.6,最适合用于转化的幼胚大小为直径1.5 mm,最佳侵染时间为20 min,GUS瞬时表达率为23.46%。     

含ipt融合基因的根癌农杆菌转化大豆萌动种胚的研究─Ⅰ苗期子叶的同工酶分析

本实验以大豆萌动种胚为受体，用含有３５Ｓ启动子—Ｇｕｓ基因—ｉｐｔ基因—Ｎｏｓ基因的融合基因根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４进行转化。通过对转化及对照植株苗期子叶的过氧化物酶同工酶及酯酶同工酶分析，结果表明酶谱有明显差异，过氧化物酶同工酶有两条差异带：Ｒｆ０．５０９及Ｒｆ０．７１２；酯酶同工酶有一条差异带：Ｒｆ０．５３１。综合分析，上述三条差异带都显示的转化植株占所分析的转化植株的１４．４％。此法可作为转基因植株早期筛选的方法之一。     

农杆菌介导植酸酶基因转化大豆的研究

以大豆胚尖为受体,利用农杆菌介导法将来源于泡盛曲霉的植酸酶基因phy转入黑农37和吉林小粒豆中。此法取材方便,操作简单,产生嵌合体的可能性低。在筛选培养基中经草胺膦(1.0 mg.L-1)筛选,获得抗性植株。对获得的草胺磷抗性植株采用除草剂(10%Basta)筛查表型鉴定与目的基因、筛选标记基因PCR分子检测相结合的方法,检测结果直观、可信度高。最终获得5株阳性植株,转化率为0.5%。     

农杆菌介导向玉米茎尖导入HAL1基因的初步研究

选用玉米优良自交系郑58的茎尖为受体,研究以玉米茎尖为受体进行农杆菌转化体系的可行性。用农杆菌介导法将耐盐碱基因HAL1转入玉米中,获得70株转化苗,经过300 mg/L的除草剂(Basta)筛选,共获得9株转基因植株。进一步进行 PCR检测,其中6株表现阳性,转化率达8.57%。初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中,以玉米茎尖作为受体孢子体的转化系统可用于基因转化。     

农杆菌介导法将高赖氨酸蛋白基因sb401导入玉米的研究

以玉米杂交组合PA×PB的胚性愈伤组织为材料,通过农杆菌介导法将高赖氨酸蛋白基因sb401导入到玉米中。经过双丙胺膦筛选,共获得70株再生植株,其中15株经PCR检测呈阳性,将部分PCR呈阳性的植株进行Southern杂交,结果表明,sb401基因已经整合到玉米基因组中。bar蛋白试纸条检测结果呈阳性,推测目的蛋白得到了表达。     

农杆菌介导将LycB基因转入优良玉米自交系的研究

以优良玉米自交天塔5的幼胚为材料,诱导出Ⅱ型愈伤组织,用带有质粒pCAMBIA2300-LmLycB-Bar根癌农杆菌C58侵染,对培养基和遗传转化因素进行优化;共培养3 d,延迟培养7 d,再转入含PPT的培养基上连续筛选3代,分化获得再生植株。经PCR和RT-PCR检测,确定获得13株阳性植株,HPLC检测转基因玉米叶片总类胡萝卜素含量为174.83μg/(g.FW),比野生型玉米提高了15.82%。     

利用农杆菌介导合子胚转化法将Bar基因转入玉米自交系的研究

基于农杆菌介导的合子胚转化方法是一种具有自主知识产权的转基因新方法。利用该方法转化玉米合子胚,可直接获得转化种子。以东北春玉米区玉米自交系8902、Pa91、丹340作为转化受体,通过合子转化法进行抗草丁膦除草剂基因Bar的转基因研究。在获得的3 560份材料中,通过对T_1代种子苗叶面喷施草丁膦除草剂Basta,共获得153株抗性植株,抗性频率为4.3%。PCR鉴定阳性植株为102株,转化频率为2.87%。对PCR检测出的阳性植株进行自交获得T_2代,对材料继续进行抗性筛选,对抗除草剂表型的分离比率进行抗性遗传分析。     

农杆菌介导glgC-TM基因转化水稻研究

 利用农杆菌介导将glgC-TM基因导入多个水稻品种。研究表明农杆菌转化过程中，潮霉素是一种很好的筛选剂，成熟胚以及国产的羧苄青霉素不适宜用作农杆菌介导的遗传转化。不同品种以及不同的质粒在转化过程中对抗性愈伤的得率和阳性植株的转化率不存在显著影响。T1代PCR检测表明，在转基因当代就有可能获得转基因纯系。     

农杆菌介导甘蔗基因转化技术的优化

以甘蔗（Saccharum officinarum L.）品种ROC10为转化受体材料,以GFP基因为报告基因,通过对农杆菌介导遗传转化的一系列条件,包括农杆菌菌株及侵染菌液浓度、侵染时间、受体愈伤组织龄期、AS活化时间及使用浓度、共培养时间等进行优化,同时进行了便于vir基因活化和T-DNA转移的条件组合,如附加果糖和葡萄糖、酸性环境感染,低温共培养等,从而建立了一个可行、有效而又简便的农杆菌介导的甘蔗遗传转化体系。结果表明:农杆菌菌株EHA105优于LBA4404,其适宜侵染浓度D600为1.3752;适宜受体愈伤组织龄期为25℃暗培养25d;适宜侵染时间为30min;适宜AS活化时间为2h,使用浓度为200μmol·L-1;适宜共培养时间为4d。获得2株有荧光信号的植株,对这2株植株进行斑点Southern杂交检测,均有阳性反应,证明GFP基因已整合到甘蔗基因组中并得到了有效表达,表明该转化体系确实是有效的。      

BcWRKY1转录因子基因花粉管通道法转化玉米的初报

采用花粉管通道法,以LH1037、合344、05-2044等7份优良玉米自交系为试材,转化转录因子BcWKKY1基因,并优化了遗传转化体系。结果表明,当转化DNA溶液浓度为200μg/mL、授粉后9 h转化,结实率和转化率最高;转基因玉米的发芽率均低于非转基因对照。共获得T0代PPT抗性植株89株,PCR阳性植株55株,其中36株结实。T1代转基因植株的PCR和PCR-Southern阳性率为86.7%。     

玉米自交系Y423萌动胚诱导愈伤组织及愈伤组织再分化的体系建立

幼胚是目前广泛用于玉米组培再生和遗传转化的主要外植体材料,但获取幼胚的数量和质量会受到季节和气候条件的严重影响。通过将玉米子粒在4℃条件下浸泡3 d获得萌动胚,进而以其为外植体,建立玉米组培再生体系。通过调整培养基组成和激素配比,萌动胚在2,4-D浓度为8 mg/L的诱导培养基上,初代愈伤组织发生率可达到54.17%,经继代培养胚性愈伤诱导率可达42.13%。胚性愈伤组织在激素组合为1.5 mg/L 6-BA + 0.1 mg/L NAA的分化培养基上分化率超过40%,经生根培养后可100%生根。基因表达分析同时发现,与体细胞发生相关的7个基因在不同培养阶段的表达变化与胚性愈伤组织的形成密切相关。结果表明,玉米萌动胚可替代幼胚或作为其补充用于玉米组培再生和遗传转化相关工作。     

玉米花粉管通道法转化脱水素BDN1基因

通过花粉管通道法将脱水素基因BDN1转入玉米自交系合344中,并对转化后代进行PCR和RT-PCR分子检测以及耐盐性功能鉴定,筛选耐盐性较高的转基因玉米新种质.结果表明,实验共获得88株T0代除草剂抗性植株,其中31株PCR检测呈阳性,14株RT-PCR检测呈阳性,对T4代转基因株系苗期进行300 mmol/L NaCl溶液的盐胁迫处理, 2个转基因株系耐盐性比对照提高两个级别.