枸杞叶片cDNA文库的构建

以宁夏枸杞叶片为材料,采用异硫氰酸胍—酚—氯仿法提取完整的总RNA,利用PolyATractmRNAIsolationSystem分离mRNA,然后用UniversalRibocloneRcDNASynthesisSystem合成双链cDNA,在cDNA末端连接上EcoRⅠ接头,并与λExCell载体连接,利用PackageneLambdaDNAPackagingSystem进行包装,在国内外首次构建出滴度为2 78×105pfu/mL,重组效率为88 1%的枸杞叶片cDNA文库。     

油茶种子cDNA文库的构建

以湘林1号和湘林4号油茶优良无性系近成熟种子为材料。采用裂解法和改良的CTAB法提取总RAN；用磁珠法分离得到纯化的mRNA；在反转录酶和其他酶的作用下合成一链cDNA和二链cDNA；经与质料载体重组和转化大肠杆菌。成功地构建了世界上第一个油茶种子cDNA文库．经检测，文库存容量达10^6组率为88．21％．测序结果表明：克隆片段长度一般都大于600bp。说明构建的文库质量较高，能够满足ESTs文库构建及从文库中分离筛选重要基因等研究工作的需要．为进一步研究奠定了．很好的物质和技术基础．     

苦豆子cDNA文库的构建

以产于新疆豆科碟形花亚科槐属植物苦豆子(Sophoraalopecuroides.L)幼苗为材料,用改进的一步抽提法提取了总RNA,再以生物素标记的Oligo(dT)为引物,经过磁性球珠法,分离出mRNA,反转录酶催化合成cD NA。与EcoRIAdaptor连接,再经SeptacrylS 400分级,磷酸化后将双链cDNA克隆于λgt11载体中,经体外包装和感染Y1090菌株,成功构建了效价为0.9×106pfu·ml-1苦豆子幼苗cDNA文库。随机挑选5个重组噬斑,PCR法检查出重组克隆的插入片段平均大于1000bp,说明cDNA文库质量较高。     

资源植物野生金荞麦的研究进展

中国地大物博,有30000多种高等植物,居北半球之首,其中资源植物十分丰富,也是天然药物主产国之一。自20世纪70年代以来,中国的资源植物研究尤其是药用植物的研究发展迅猛,近20年来,从天然产物中开发各种新药成为世界科学家研究的热点。中国是世界荞麦的起源中心,也是遗传多样性中心。野生金荞麦(Fagopyrumdibotrys)系蓼科荞麦属多年生草本植物,原产于中国西南,分布于陕西、江苏、浙江、江西、河南、湖北、湖南、广西、广东、四川、重庆及云南等省区,是一种营养丰富并具有重要药用价值的资源植物。野生金荞麦中蕴涵着丰富的优异基因,作为中国重要的传统中药材,金荞麦的块根活性提取物(植物次生代谢产物)具有显著的抗癌,抑制肿瘤细胞肺侵袭和转移,以及消炎抗菌等重要作用,是多种有效药物的主要成分之一。除此之外,由于其籽粒蛋白质的组分全,必需氨基酸含量高,富含维生素和微量元素,使其成为一种较理想的保健食品的选用成分。目前,由于人工栽培产量的限制,加之栽培品种在营养价值上、药用有效活性成分和效价上均低于野生品种,这就造成了对野生金荞麦资源的大量需求,从而对野生资源造成了极大的破坏。鉴于此,中国现已将其列为国家二级保护植物。国内外已经展开了资源收集、多样性、生理特性、育种、药效学以及生态环境等方面的研究,基于活性成分合成的功能基因的研究,国内外还未见报道,为了进一步开发野生金荞麦的利用价值,发掘其优异的功能基因,并保护其野生基因资源,综述了野生金荞麦在本草、原植物分类及分布、多样性、核形、化学及功能成分、药理药效、生态环境、栽培及组织培养方面研究的新进展,并从基础研究、组织培养、基因工程、抗癌机理研究、育种研究、保健品开发等方面作了展望。     

梅花鹿心脏组织cDNA文库的构建

[目的]构建梅花鹿心脏cDNA文库。[方法]提取梅花鹿心脏总RNA,纯化mRNA;合成双链cDNA,连接载体,并电转化至感受态细胞;测定文库的克隆数、重组率及插入片段大小。[结果]经鉴定,所构建梅花鹿心脏组织cDNA文库,库容量为3.8×106个克隆,重组率为100%,插入片段大小为0.5～2.0kb,平均长度约为1.0kb。[结论]所构建cDNA文库的各项指标均达到要求。     

石蒜叶片全长cDNA文库的构建

以石蒜叶片为材料,根据SMART[TM] cDNA文库构建试剂盒所示方法,提取叶片总RNA合成cDNA,连接到质粒载体pDNR-LIB上,采用电穿孔法将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中,构建了石蒜叶片全长cDNA文库.文库质量鉴定结果表明:文库滴度为1.15×106 PFU/ml,重组率99.17%,插入片段大小多为0.5～2.0 kb,1.0 kb以上的占60%.     

尼罗罗非鱼肝cDNA文库的构建

用Stratagene技术构建了吉富品系尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus,GIFT strain)肝cDNA文库。首先用TRIZOL法提取肝总RNA,经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测,表明总RNA纯度高且完整性良好。然后分离纯化mRNA,合成双链cDNA之后,加EcoRⅠ接头、EcoRⅠ末端磷酸化、XhoⅠ消化,并用葡聚糖凝胶柱层析分级收集cDNA样品,得到300 mg cDNA,符合建库要求。双链cDNA与Uni-ZAP XR Vector连接后,用GigapackⅢGold Packaging Extract进行体外包装得到cDNA文库。测得的文库滴度为1.25×107pfu/mL,文库噬菌体的滴度符合文库保存和筛选实验的要求。随机挑选20个阳性单克隆噬菌斑进行PCR鉴定后,得出文库的重组率达100%,扩增出的片段主要集中在0.5~2 kb之间,平均插入片段长度约为1.05 kb,结果说明本实验所构建的cDNA文库质量较高。取扩增文库80μL进行体外切割,约含3.6×106个重组子,切割后phagemid量为2.0×106,切割效率为79.4%。经抽提质粒获得质粒DNA约1.2 mg。     

尼罗罗非鱼肝cDNA文库的构建

用Stratagene技术构建了吉富品系尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus,GIFT strain)肝cDNA文库。首先用TRIZOL法提取肝总RNA,经琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测,表明总RNA纯度高且完整性良好。然后分离纯化mRNA,合成双链cDNA之后,加EcoRⅠ接头、EcoRⅠ末端磷酸化、XhoⅠ消化,并用葡聚糖凝胶柱层析分级收集cDNA样品,得到300 mg cDNA,符合建库要求。双链cDNA与Uni-ZAP XR Vector连接后,用GigapackⅢGold Packaging Extract进行体外包装得到cDNA文库。测得的文库滴度为1.25×107pfu/mL,文库噬菌体的滴度符合文库保存和筛选实验的要求。随机挑选20个阳性单克隆噬菌斑进行PCR鉴定后,得出文库的重组率达100%,扩增出的片段主要集中在0.5~2 kb之间,平均插入片段长度约为1.05 kb,结果说明本实验所构建的cDNA文库质量较高。取扩增文库80μL进行体外切割,约含3.6×106个重组子,切割后phagemid量为2.0×106,切割效率为79.4%。经抽提质粒获得质粒DNA约1.2 mg。     

一种构建全长cDNA文库的方法

建立了一种以LD-PCR为基础的cDNA文库的快速构建方法.以人胎盘组织为材料获得总RNA,利用引物F1、R2在逆转录酶M-MLV的作用下合成cDNA第1链,进而利用引物F3、R4在DNA聚合酶的作用下通过LD-PCR方法合成cDNA第2链;双链cDNA经SfiⅠ酶切,通过T4 DNA连接酶连接到经相同酶切的JG45质粒载体后构建成cDNA文库,并对文库的容量、重组率以及多样性进行了分析.结果表明,通过该方法构建的cDNA文库容量约为7.01×105 个/μgds-cDNA,重组率为96%;对随机提取的100个克隆质粒的插入序列进行分析,共获得80个不同的cDNA序列,且未见重复序列.该法构建的cDNA质粒文库具有快速、简单的特点,构建的文库质量符合要求,可用于大规模的基因分析.     

欧洲油菜花粉cDNA文库的构建

从欧洲油菜（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）成熟花粉中提纯出ｍＲＮＡ．ｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡ在ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）引导下，用反转录酶合成ｃＤ－ＮＡ第一链，用大肠杆菌ＲＮＡ酶Ｈ和大肠杆菌ＤＮＡ聚合酶Ｉ置换合成ＣＤＮＡ第二链．加上ＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩ接头。最后将双链ＤＮＡ克隆子λｇｔｌｌ载体中。用Ｂｃｐｌ作探针，杂交筛选构建的ｃＤＮＡ文库。     

菜用金荞麦高产栽培技术优化

为明确金荞麦在毕节地区适宜的播期及繁殖方式,建立金荞麦的优化栽培模式,以栽培密度、氮肥、钾肥、磷肥施用量为对象,运用四因子五水平二次回归正交旋转组合设计方法,研究不同播期和繁殖方式对金荞麦鲜茎叶产量的影响。结果表明:金荞麦适宜播期为1月下旬至2月上旬,以芽苞繁殖的产量最高;通过模拟寻优,建立了金荞麦茎叶鲜产量与栽培密度、氮肥、钾肥、磷肥施用量间关系的数学模型,提出金荞麦茎叶鲜产量≥36 000kg/hm2的综合农艺栽培措施为:栽培密度12.29万~12.95万株/hm2,氮肥施用量81.63~98.37kg/hm2,钾肥施用量73.6~86.4kg/hm2,磷肥施用量109.14~130.86kg/hm2。     

金荞麦芽尖开发为功能茶的基础研究

为了进一步开发和利用金荞麦(Fagopyrum dibotrys)植物资源,对金荞麦芽尖开发为黄酮型功能茶的可行性进行初步研究。以时间、浸泡次数、料液比作为变量因子,探索各因素对金荞麦芽尖总黄酮溶出率的影响。结果表明,在浸泡10 min内溶出速率较快;料液比对总溶出率影响不大;第一次浸泡溶出量平均占5次浸泡总溶出率的50%左右;且溶出率随浸泡次数的增加而迅速降低,自然阴干的溶出率高于60℃烘干的,金荞麦芽尖具有开发为功能茶饮的潜力,可为金荞麦芽尖的功能性利用提供理论依据。     

光强对金荞麦幼苗部分生理指标和生物量的影响

研究不同光强对金荞麦幼苗生物量和部分生理指标的影响.采用室外盆栽试验方法,用遮阳网形成的不同光强处理金荞麦幼苗75d后测定其生物量;另外分5个时期(处理后15d、30d、45d、60d、75d)测定生理指标.50.32%光强下生长的金荞麦幼苗生物量显著高于其他处理.弱光(20.85%和6.98%光强)下生长的金荞麦幼苗在生物量积累减少的情况下,通过增加叶、根生物量和叶柄生物量配置比例,减少主茎、分枝茎生物量配置来适应光环境.金荞麦幼苗叶绿素a、b及叶绿素总质量分数、可溶性蛋白质量分数、脯氨酸质量分数随着光强减弱而增加,可溶性糖质量分数则相反,其中叶绿素a、b质量分数和脯氨酸质量分数在4个不同处理中达到显著性水平.对于人工栽培的金荞麦,在幼苗期应适当遮阴(试验的相对光强为50%左右),更有利于其生长.     

干旱及增强UV-B胁迫对金荞麦光合色素的影响

[目的]研究干旱胁迫和增强UV-B辐射对金荞麦光合色素的影响,以期为金荞麦规范化种植提供理论依据。[方法]采用盆栽试验的方法,测定金荞麦在不同程度干旱胁迫和UV-B辐射处理下光合色素的含量,并计算光合色素比值。[结果]金荞麦叶绿素a含量、叶绿素b含量、总叶绿素含量、叶绿素a/叶绿素b、类胡萝卜素含量都随干旱程度的加重而降低,类胡萝卜素/叶绿素在处理中后期基本随干旱程度的加深而有升高的趋势,在后期达到显著水平;在水分充足的状况下,增强的UV-B辐射降低了叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量,显著提高了类胡萝卜素含量和类胡萝卜素/叶绿素;在干旱胁迫下,增强的UV-B辐射提高了叶绿素b和总叶绿素含量。[结论]金荞麦光合色素对干旱胁迫敏感,且在一定程度上能指示反映叶片受伤害程度,并反映土壤干旱水平;增强的UV-B辐射能减小由干旱胁迫带来的金荞麦光合色素变化。     

水分胁迫对黔金荞麦1号生理特性的影响

为探索黔金荞麦1号(Fagopyrum dibotrys CV.Qianjin No.1)对水分胁迫的适应机制,加快金荞麦育成品种的推广利用,以黔金荞麦1号为试验材料,采用室内盆栽模拟水分胁迫,测定分析了水分胁迫下育成品种主要生理指标的变化情况。结果表明:正常水分条件下,各指标无显著变化。处理组黔金荞麦1号的电导率、丙二醛(MDA)和可溶性糖(SS)含量及过氧化物(POD)和过氧化氢(CAT)酶活性随水分胁迫强度的增加而升高,脯氨酸(Pro)含量、超氧化物歧化(SOD)酶活性和水分利用效率随水分胁迫强度的增加呈先升高后降低的趋势,净光合速率、气孔导度和蒸腾速率呈降低趋势。轻、中度水分胁迫时,黔金荞麦1号能够通过调节自身的渗透调节物质含量和保护酶活性来减轻水分胁迫伤害,维持植株的正常生理代谢功能。重度水分胁迫时,渗透调节能力和保护酶活性减弱,细胞膜受伤害程度增强,光合能力降低。     

金荞麦叶保护酶与保护物质对增强UV-B辐射及干旱胁迫的响应

采用盆栽试验测定金荞麦在干旱和UV-B辐射胁迫下超氧化物歧化酶 （SOD） 活性、过氧化物酶 （POD）活性、总黄酮含量、游离脯氨酸和可溶性蛋白含量。试验结果显示在充足水分状况下,增强的UV\|B辐射提高了金荞麦叶SOD活性、总黄酮含量、游离脯氨酸含量;增强的UV-B辐射在处理前期和后期提高了金荞麦叶POD活性;增强的UV\|B辐射在处理前期增加了金荞麦叶可溶性蛋白含量。在干旱胁迫下,增强的UV-B辐射在处理中期提高了金荞麦叶SOD活性,而在处理前期和后期却降低了其SOD活性;增强的UV-B辐射在处理后期提高了金荞麦叶POD活性以及游离脯氨酸和可溶性蛋白含量。在干旱条件下,金荞麦通过酶系统和保护物质的调节减少胁迫带来的不利影响,增强试验设定强度的UV-B辐射在一定程度上有利于提高其对干旱的抗性。     

均一化cDNA文库的研究进展及其应用（摘要）

均一化cDNA文库是可获得表达序列标签和发现基因的一个新的有效平台。它降低在文库中高拷贝存在的cDNA的丰度,提高了发现随机序列和稀有基因的效率。本文综述了构建均一化cDNA文库的原理,步骤及其在植物和动物中的应用,以期可促进均一化cDNA文库的发展和它在发现新基因中的应用。     

cDNA文库构建策略及其分析研究进展

 cDNA文库构建和筛选是基因克隆的重要方法之一，它是目前发现新基因和研 究基因功能的基本工具。从cDNA文库中可以筛选到目的基因，并直接用于该基因的表达。经典 cDNA文库存在克隆的片段短等缺点，而全长cDNA文库则能提供完整的mRNA信息，从而克隆cDNA全长；对文库进行均一化处理即均一化cDNA文库，可以增加克隆低丰度mRNA的机会；差减cDNA文库在研究生物体某一时期基因差异表达上具有重要的意义；改进的固相cDNA很大程度上提高了建库的效率和质量。本文以阐述基本原理为主，介绍几种近年来常用的cDNA构建的方法及其优缺点。