以免疫活性串联片段FB为抗原检测FMDV抗体的间接ELISA方法

将口蹄疫病毒免疫串联片段FB克隆至原核表达载体pBAD／TOPO中，得到重组质粒pBAD-FB，将此重组质粒转化到受体茵TOPIO中，以不同浓度的阿拉伯醛糖进行诱导，并在不同诱导时间进行采样，经处理后做SDS-PAGE、Western-blotting分析。结果发现以终浓度为0．02g／L的阿拉伯醛糖进行诱导，4h后表达量可达高峰，其大小约为26ku，扫描结果显示，FB融合蛋白的表达量占细菌总蛋白的28．9％，能与抗FMDV抗体发生特异性反应，融合蛋白以包涵体和可溶形式存在。将融合蛋白的可溶性组分用500g／L Ni-NTA树脂过柱纯化后作为包被抗原，成功地建立了检测血清中FMD抗体的间接ELISA方法。融合蛋白的最佳包被浓度是40μg／mL；标准阳性血清的最适稀释倍数为1：160；最佳封闭液为50g／L脱脂奶粉和PBS；最佳封闭时间为1h。用建立的ELISA方法对采集的118份样品进行检测，并与全病毒包被抗原ELISA、间接血凝诊断试剂盒和UBI VP1抗体检测ELISA试验盒的检测结果比较，证明所建立的方法具有良好的特异性、敏感性和可重复性。     

用3AB-ELISA鉴别猪口蹄疫病毒感染与疫苗免疫猪的研究

采用大肠埃希氏菌表达的口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3AB(FMDV-3AB)多肽为抗原，A／G蛋白-辣根过氧化物酶为酶结合物，过氧化氢-四甲基联苯胺为底物溶液，建立了一种可鉴别FMD感染与灭活疫苗免疫猪血清抗体的间接酶联免疫吸附试验(I-ELISA)，即3AB-ELISA。通过对1779份健康猪、免疫猪及人工感染猪血清的检测，确定了该I-ELISA的阳性/阴性判定临界值。该检测方法比VIAA-AGID法检出率高，尤其是采用A／G蛋白酶结合物后操作更简便。     

区分动物疫苗免疫与病毒感染的口蹄疫非结构蛋白3AB鉴别诊断试剂盒的研制

以口蹄疫非结构蛋白3AB作为抗原的ELISA，适用于鉴别诊断感染和注苗动物。以3ABC基因片段为模板，经RT-PCR扩增得到3AB基因片段，与pET32a连接后，转化宿主菌BL21（DE3）plysS，IPTG诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE和Westemblot结果表明，表达的重组3AB蛋白，分子量约为50Ku，ELISA结果显示，重组3AB蛋白可用于猪、牛口蹄疫病毒感染与疫苗免疫抗体的鉴别诊断。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3B基因的克隆表达及3B-ELISA鉴别诊断方法的初步建立

从口蹄疫病毒（foot—and—mouth disease virus，FMDV）细胞培养物中提取总RNA，经一步法RT—PCR获得了长约230bp的3B基因片段，将PCR产物连接到pMD-18T载体上并测序，用BamH Ⅰ与Hind Ⅲ双酶切后，将3B基因融合到pGEX—KG载体上形成表达质粒pGEX—KG—3B，转化到BL21（DE3）中在27C诱导表达，将表达产物进行SDS—PAGE和蛋白质斑点ELISA。结果表明3B基因主要以可溶形式高效表达，表达产物具有免疫原性。以纯化的表达产物为抗原建立了间接酶联免疫吸附试验（I-ELISA）。方阵滴定其最佳包被浓度是6．1μg／孔，最佳血清稀释倍数为1：80，通过测定36份FMDV阴性血清，确定了该方法的阳性判定标准。结果表明，该方法特异性强、重复性好；用3B—ELISA方法与美国联合生物医学公司（UBI）生产的合成肽检测试剂盒UBI FMDV NS-ELISA对比检测44份血清样品，符合率为93．1％。证明3B—ELISA方法可用于口蹄疫的鉴别诊断。     

检测鸡传染性鼻气管炎病毒抗体的间接ELISA方法的研究

分别用绿猴肾细胞和鸡胚成纤维细胞殖鸡传染性鼻气管炎病毒NL7784株，提纯抗原建立了检测鸡传染性鼻气管炎病毒抗体的间接酶联免疫吸附试验（ELISA），试验的最佳反应条件为：抗原最佳稀释度为1：160，酶标抗体为1：1000稀释，待检血清为1：160稀释，包被液为pH9．0的碳酸盐缓冲兴，6％犊牛血清（CS）作封闭液，稀释液用含10％CS的Tween－20磷酸盐缓冲液，洗涤液用含0．5％Tween－20的磷酸盐缓冲液，抗原与抗体的最佳反应时间为30分钟，底物的反应时间为15分钟。与中和试验进行了比较，证明所产方法具有很好的特异性、稳定性、可重复性和较高的敏感性。     

用大肠杆菌表达FMDV NSP 3ABC鉴别感染与注苗动物ELISA方法的建立

用大肠杆菌表达的FMDV NSP 3ABC经纯化复性后作为抗原,建立了鉴别感染动物与注苗动物的间接ELISA方法.用该方法检测了大量的牛血清样品,确定了3ABC-I-ELISA判定标准.3ABC-I-ELISA以(OD样品-OD阴性)÷(OD阳性-OD阴性)来计算待测样品效价.当效价小于0.2为阴性,介于0.2～0.3之间为可疑,大于0.3为阳性.根据此判定标准所测试验感染动物血清都为阳性,敏感性达100%;97.06%疫苗注射动物血清为阴性;98.39%的非免疫健康牛(未感染也未注射疫苗牛)血清为阴性.研究证实感染牛在1年以后仍能检测到3ABC抗体.这说明3ABC-I-ELISA能够鉴别FMDV感染动物和注苗动物,可作为大面积疫情监测的方法应用.     

3A蛋白间接ELISA试验检测猪口蹄疫感染抗体的研究

用表达的口蹄疫3A蛋白作为包被抗原，建立了间接ELISA试验，对口蹄疫病毒感染血清、免疫血清和其它非口蹄疫病毒血清进行了检测研究。结果表明，3A蛋白间接ELISA试验对口蹄疫具有较好的特异性，可以区分感染口蹄疫病毒的猪血清和疫苗免疫猪血清。     

不同ELISA试剂盒检测感染猪口蹄疫病毒3ABC抗体效果比较

为更准确研究口蹄疫病毒(FMDV)感染猪非结构蛋白抗体变化规律,选取3种不同的试剂盒,分别检测接种O型口蹄疫病毒猪FMDV非结构蛋白3ABC抗体。试验数据表明,人工感染O型口蹄疫病毒猪最早在感染后第5天检测到非结构蛋白抗体,至第7天3ABC抗体全部转为阳性;3种试剂盒检测最早3ABC抗体与症状对应关系有差异,每两种商业试剂盒呈现不同程度的相关性。其中A试剂盒显示出最大的灵敏度,而B试剂盒显示最高的特异性,C试剂盒的敏感性依可疑样品的处理方式而变化,因此对3种试剂盒进行比较,发现A试剂盒更稳定,更适合于猪FMDV非结构蛋白抗体检测。     

新城疫病毒抗体ELISA检测方法的建立与应用

为建立一种快速的新城疫病毒抗体检测方法,本研究以原核表达的重组HN蛋白作为诊断抗原,建立了检测新城疫病毒抗体的间接ELISA诊断方法.该方法检测AIV(H9亚型)、IBV、IBDV、EDSV 4种常见禽病病原的阳性血清均为阴性;检测灵敏度为1:12 800;批内重复性试验、批间重复性试验的变异系数分别小于5％和10％;与血凝抑制试验(HI)符合率为96.1％.本研究建立的NDV HN间接ELISA检测方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为NDV的抗体检测及流行病学调查等快速诊断提供一种技术手段.     

鹿口蹄疫抗体间接ELISA检测方法的建立

以纯化的口蹄疫病毒作为包被抗原,建立了检测鹿口蹄疫抗体的间接酶联免疫吸附测定（ELISA）。最佳反应条件是：抗原包被质量浓度为40μg/mL,血清稀释度为1：100,检测的灵敏度为1：400。     

用双抗夹心ELISA鉴别不同肉类的研究

以辣根过氧化物酶标记兔抗不同动物肌肉和血清球蛋白抗血清检查860份牛肉、510份马肉、510份猪肉、310份羊肉和100份驼肉,检出率均在95％以上;经与其它血清学方法比较,证实用该法鉴别不同肉类,具有较高的敏感性和特异性,而且方法简便,设备简单,判断指标客观真实,经研制配套的商品化诊断盒,可供肉品检疫部门及有关单位野外应用。     

禽流感抗体的间接ELISA检测

本试验建立了AIV抗原,检测AIV抗体的AI-ELISA方法。本试验应用单方阵滴定法确定了酶联免疫吸附试验(ELISA)检测禽流感抗体的最适工作浓度、最适血清稀释倍数,建立了ELISA检测鸭血清抗体的程序,并提出以P/N(Positive/Negidive)确定阳性血清滴度的方法。经小批血清的实验检测表明此方法特异性较好,操作简便,适于大批鸭群抗体水平的检测,并为免疫监测提供了可靠的技术手段。     

间接ELISA检测减蛋综合征抗体的研究

目前,减蛋综合征感染的血清学检测方法主要有微量血凝抑制试验(HI)、琼脂扩散试验(AGP)、病毒中和试验(VN)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、斑点-酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)和斑点免疫金测定法(D IGFA)。至今为止,国内尚无成熟的ELISA检测方法用于该病的检测。试验用纯化的EDS-76     

不同ELISA试剂盒评价口蹄疫O型、A型二价灭活苗免疫效果对比

为对比不同ELISA试剂盒评价口蹄疫O型、A型二价灭活苗免疫效果的差异,选取市面上3种不同厂家生产的口蹄疫ELISA检测试剂盒,同时检测3个免疫不同口蹄疫O型、A型二价灭活苗羊场的抗体水平。结果显示：3种试剂盒检测不同场口蹄疫O型抗体合格率均在70%以上,符合率为72.41%~100%;S2试剂盒检测3个场的A型抗体合格率均高于70%,S1和S3试剂盒各有2个场的合格率低于70%,且3种试剂盒符合率较低,为48.28%~68.97%。结果表明,不同ELISA试剂盒评价口蹄疫免疫效果存在一定差异,其中检测A型抗体试剂盒差异显著（P＜0.05）;3种ELISA试剂盒均可用于口蹄疫O型抗体检测,但并不全适合于A型抗体检测。本试验为相关实验室选择合适试剂盒提供了依据。     

用口蹄疫病毒非结构蛋白鉴别感染动物与疫苗免疫接种动物

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的发生于偶蹄类动物的一种急性、热性传染病,曾多次在世界上发生过大流行。疫苗接种是防控口蹄疫暴发的有效措施之一,而要控制口蹄疫的流行,首先要将病毒感染动物从疫苗接种群体中区分开来。以口蹄疫病毒非结构蛋白(NSPs)为抗原,分别利用口蹄疫病毒非结构蛋白2C、3B、3AB和3ABC作为鉴别诊断抗原,检测动物体内的NSPs抗体,可有效的区分感染动物与疫苗免疫接种动物。目前,许多实验室已展开此项工作的研究,这为防控口蹄疫打下了良好的基础。     

Dot—ELISA检测牛白血病病毒抗体的研究

用免疫亲和层析提纯技术获得取高纯度的ＢＬＶ抗原，并用ＥＤＴＡ处理被检血青，以免疫琼扩的检测结果为标准，建立一种快速特异的斑点酶疲吸附试验用于检测牛白血病病毒血清抗体。其检测结果阳性者完全复盖高于ＩＤ试验的检出率。而超出于ＩＤ试验的阳性部份，与ＥＬＩＳＡ法测得阳性结果完全符合。本法比ＩＤ试验高５．６％，并可提前６０多个小时报告结果。比ＥＬＩＳＡ法亦可提关十几个小时得出结果，而且不需要特殊仪器设备，是     

基因重组抗原酶联免疫法检测兔出血症病毒抗体及其标准化

以重组兔出血症病毒(RHDV)VP60蛋白为抗原，建立了RHDV抗体间接ELISA检测方法。优化的试验反应务件为：重组VP60的包被质量浓度为1．0mg／L，用10％牛血清封闭，以大肠杆菌提取物稀释被检血清以消除非特异性反应。将所建立的ELISA与现行血凝抑制(HI)试验比较发现，不同免疫状态的兔血清的RHDV ELISA抗体与HI抗体均呈正相关。对11个RHD免疫兔场1130份血清样品的抗体检测表明，各免疫兔群血清RHDV抗体水平不完全一致，D值在1．09～1．76之间，显著高于非免疫兔(0．05)及SPF兔(0．02)，低于高免兔(2．34)。在此基础上，研制了RHDV抗体酶联免疫检测试剂盒，测定了其主要指标，制定了各成分的质量控制标准，为兔群进行免疫学监测及评价疫苗的免疫效果提供了便利。     

间接ELISA检测鸭肝炎病毒抗体的研究

以蔗糖密度梯度离心法纯化的病毒作为包被抗原，建立了检测鸭肝炎病毒（ＤＨＶ）抗体的间接ＥＬＩＳＡ方法。经特异性及重复性试验，效果良好。ＥＬＩＳＡ效价与琼扩、中和效价存在平行关系。经ＥＬＩＳＡ检测，１日龄雏鸭免疫后，４日龄可检出ＥＬＩＳＡ抗体，１０日龄达到峰值。ＤＨＶ高免血清在雏鸭体内作用维持时间为１０ｄ左右。攻毒保护试验表明，攻毒前雏鸭的血清抗体水平与攻毒后雏鸭存活率具直接相关性。     

间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清4型鸭疫里默氏杆菌抗体的研究

应用超声波裂解珐制备的血清4型鸭疫里默氏杆菌(RA)裂解物作为抗原包被酶标板，成功建立了4型RA抗体检测的间接ELISA法。