奶牛瘤胃兼性厌氧纤维素分解菌的分离鉴定

【目的】从奶牛瘤胃液中分离出具有分解纤维素能力的兼性厌氧细菌,用于绿色粗饲料微生物添加剂的研发。【方法】从奶牛瘤胃中采取瘤胃液,接种于羧甲基纤维素钠平板,采用严格厌氧结合需氧培养方式进行培养,通过刚果红染色,筛选出分解纤维素能力强的兼性厌氧细菌;采用生化试验结合16S rDNA序列分析方法对细菌进行鉴定,并绘制系统发育树;同时对细菌生长特性及有无致病性进行初步测定。【结果】共分离到63株具有分解纤维素能力的细菌,其中29株有较强的分解纤维素能力,包括24株G-菌,5株G+菌;24株G-细菌中,18株为肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种,3株为铜绿假单胞杆菌,2株为大肠杆菌,1株为产酸克雷伯氏菌;5株G+细菌中,2株与苏云金芽孢杆菌有99.7%的同源性,2株与巨大芽孢杆菌有99.6%的同源性,1株与蜡状芽孢杆菌有99.5%的同源性,分类学上可分别归于苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌。细菌的生长特性及致病性试验表明,分离到的细菌在20~41℃、pH 5.0~9.0条件下生长良好,肺炎克雷伯氏菌、苏云金芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌无致病性。【结论】分离到的奶牛瘤胃兼性厌氧细菌,可用于绿色粗饲料微生物添加剂的研发。     

高效纤维素降解细菌的分离鉴定及酶学特性

从板栗苞壳发酵堆积物中筛选分离得到1株产纤维素酶的菌株BL01,通过菌体的形态结构观察、生理生化试验及16S rDNA序列同源性分析,鉴定该菌为霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei).对该菌株产酶及活性特性进行初步研究,结果表明该菌株在反应温度为35℃、pH值为7.0、发酵时间为72 h时纤维素酶活性最大,达到74.9 U/mL.     

纤维素分解菌的分离与特性初探

利用不同分离培养基从不同生态区域土壤中分离纤维素分解菌，针对其中木霉T1、T4与毛壳菌G2、G3菌株进行生物学特性研究，结果表明：不同菌株对营养成分变化反应不同，T1、T4、G2菌株最适天然培养基为胡萝卜煎汁与番茄煎汁，G3最适天然培养基为菠菜与马铃薯：T1、T4最适合成培养基分别为Mayer与Boas，G2、G3最适合成培养基分别为Mayer、Hopkin；T1、T4最适碳源分别为果糖与麦芽糖，G2、G3最适碳源为麦芽糖：T1、T4最适氮源为蛋白胨，G2、G3最适氮源为豆饼粉；但光照对不同菌株影响均不大：四菌株对温度反应相同，最适温度均为25～30℃；T1、T4最适pH为4～5，G2、G3最适pH为7～8：碳氮比值变化对T1、T4影响不大，而G2、G3的生长受到高碳氮比值的抑制。     

甲胺磷降解菌MAP-K5的筛选及分子鉴定

从土壤中筛选到1株高效的甲胺磷降解菌MAP-K5,发酵培养72 h时,气相色谱测定对甲胺磷农药的降解率可达89.3%。通过对该菌株16S rDNA的blast检索及序列分析表明,该菌株与假单胞菌属有99%以上的同源性,结合生理生化实验研究结果,初步鉴定MAP-K5为假单胞菌(Pseudomonas)。     

一株高纤维素酶活力纤维素分解菌的分离与鉴定

从腐烂朽木及附近土壤筛选分离到一株高纤维素酶活性的纤维素分解菌CDY-3,经初步鉴定其为芽孢杆菌属菌株。pH5时,该菌羧甲基纤维素酶活性最高达14.59IU,对滤纸有较强的降解能力。生理生化特性表明该菌最适生长条件为30℃,pH7。     

奶牛瘤胃兼性厌氧纤维素分解茵的分离鉴定

【目的】从奶牛瘤胃液中分离出具有分解纤维素能力的兼性厌氧细菌,用于绿色粗饲料微生物添加剂的研发。【方法】从奶牛瘤胃中采取瘤胃液,接种于羧甲基纤维素钠平板,采用严格厌氧结合需氧培养方式进行培养,通过刚果红染色,筛选出分解纤维素能力强的兼性厌氧细菌;采用生化试验结合16SrDNA序列分析方法对细菌进行鉴定,并绘制系统发育树;同时对细菌生长特性及有无致病性进行初步测定。【结果】共分离到63株具有分解纤维素能力的细菌,其中29株有较强的分解纤维素能力,包括24株G菌,5株G＋菌;24株G-细菌中,18株为肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种,3株为铜绿假单胞杆菌,2株为大肠杆菌,1株为产酸克雷伯氏菌;5株G＋细菌中,2株与苏云金芽孢杆菌有99．7％的同源性,2株与巨大芽孢杆菌有99．6％的同源性,1株与蜡状芽孢杆菌有99．5％的同源性,分类学上可分别归于苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌。细菌的生长特性及致病性试验表明,分离到的细菌在20-41℃、pH5．O～9．0条件下生长良好,肺炎克雷伯氏菌、苏云金芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌无致病性。【结论】分离到的奶牛瘤胃兼性厌氧细菌,可用于绿色粗饲料微生物添加剂的研发。     

DDT降解菌DH-7的分离鉴定与降解特性研究

[目的]研究DDT降解菌的生物学、降解特性及其发酵条件的优化。[方法]从化工厂采集土样,分离、筛选到1株能够在好氧条件下DDT降蟹率较高的菌株DH-7,并对其进行研究。[结果]通过16SrDNA序列分析结合传统分类学方法初步确定菌株DH-7为铜绿假单胞菌。对菌体降解DDT特性的研究表明,该菌株对DDT降解10d的降解率为73．6％。在优化培养条件后,该菌株10d的降解率达81．4％。[结论]该研究结果为DDT污染土壤的生物修复提供依据。     

猪源莫拉菌的分离鉴定与部分生物学特性分析

从病死仔猪心脏中分离到一株革兰阴性菌,对该细菌进行形态学观察、生化鉴定、16S rDNA序列测定,确认该菌为猪源莫拉菌属亚种,将该菌株命名为猪源莫拉菌-ZY20001。对菌株进行致病性试验、药敏试验和部分耐药基因的检测。结果显示,该菌引起小鼠胸腔积液,不致死,对红霉素、青霉素、多粘菌素等21种抗生素药物表现不同程度的敏感,对哌拉西林耐药。菌株ZY20001具有TEM型β-内酰胺酶耐药基因,表型与基因型不符。该实验可为深入研究莫拉菌的分类进化及药物治疗提供参考依据,同时对青霉素耐药表型与基因型关系所做的初步探讨也丰富了流行病学调查资料。     

基于16S rDNA序列的4株假单胞菌属细菌的分子鉴定

对分离自养殖水环境的4株假单胞菌属细菌的16S rDNA序列进行PCR扩增并测定其核酸序列,在Gen-Bank中通过BLAST查找其同源序列,应用MegAlign软件中的Jotun Hein、Clustal V、Clustal W 3种方法进行序列差异和同源性分析,分别使用Mega 4.0软件中的邻接法(N-J)、最小进化法(ME)、最大简约法(MP)、非加权组平均法(UPGMA)构建系统发育树。3种序列分析方法结果显示,由Jotun Hein法可知,菌株T3与菌株T6序列相似度最高为98.5%,菌株T4与Pseudomonas sp.N9-1序列相似度最高为99.1%,菌株T5与Pseudomonas sp.N9-1序列相似度最高为99.6%,菌株T6与Pseudomonas putida KF703及菌株T5序列相似度最高为99.1%;由Clustal V法可知,菌株T3与Pseudomonas sp.N9-1序列相似度最高为97.0%,菌株T4与Pseudomonas plecoglossicida S21、Pseudomonas sp.N9-1及菌株T5序列相似度最高为97.7%,菌株T5与Pseudomonas plecoglossicida S21序列相似度最高为98.9%,菌株T6与菌株T5序列相似度最高为97.2%;由Clustal W法可知,菌株T3与Pseudomonas sp.N9-1序列相似度最高均为97.7%,菌株T4与Pseudomonas plecoglossicida S21序列相似度最高为99.3%,菌株T5与Pseudomonas plecoglossicidaS21序列相似度最高为99.6%,菌株T6与Pseudomonas sp.N9-1序列相似度最高为97.9%。4种方法构建的系统发育树基本一致,可初步确立4株菌株的分类地位:菌株T3与Pseudomonas sp.G53亲缘关系最近,菌株T4与序列Pseudomonas sp.N9-1以及Pseudomonas sp.WP6亲缘关系最近,菌株T5与Pseudomonas sp.3-3(2010)亲缘关系最近,菌株T6与Pseudomonas plecoglossicida S21亲缘关系最近。     

骆驼刺源产乳酸的嗜酸乳杆菌分离鉴定及菌种特性

从骆驼刺青贮中分离到1株革兰氏阳性杆菌,经菌落形态特征鉴定、生理生化特征鉴定及16S rDNA序列分析,鉴定为嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）。     

猪流感病毒的分离鉴定及生物学特性研究

为了解河南省猪群中猪流感流行状况,对河南多个地区的63头病死猪进行SIV分离鉴定,并对获得的分离株进行生物学特性研究.从病死猪的肺脏中分离到3株H1N2亚型SIV,分别命名为:A/Swine/HeNan/01/2010(H1N2)、A/Swine/HeNan/02/2010(H1N2)和A/Swine/HeNan/03/2010(H1N2).其中,A/Swine/HeNan/01/2010(H1N2)和A/Swine/HeNan/02/2010(H1N2)均能凝集鸡、小鼠、兔、猪、豚鼠、绵羊和牛的红细胞,均为热稳定型,其中前者EID50和ELD50较高,分别为10-7.16和10-6.54;后者较低,分别为10-5.86和10-3.83.A/Swine/HeNan/03/2010(H1N2)对猪和牛的红细胞无凝集活性,为中等热稳定型,且EID50和ELD50较低,分别为10-2.43和10-2.67.同时3株SIV均对氯仿、乙醚和酸敏感,均可引起MDCK细胞病变,但不能感染BALB/c小鼠.     

醋糟纤维素分解菌的筛选与环境适应性研究

以羧甲基纤维素钠(CMC)培养基为基础培养基,从林地土壤、已经堆肥处理的锯末和醋糟、未经堆肥的新鲜醋糟样品中初步分离筛选出13株菌株.通过采用纤维素刚果红染色法测定其相对酶活力,进一步得到3株(分别命名为SL02、SL04和SL10)分解纤维素能力较强的菌株.对这3株菌株分别进行温度、碳源、氮源和酸碱度的适应性研究,结果表明:SL10菌株的适宜生长温度为28℃左右,SL02、SL04菌株则分别为28～31℃和25～31℃.醋糟和麸皮的不同配比对菌株的生长影响较大,SL02菌株的适宜配比为2:3,SL02和SL10菌株则分别为1:4或0:5;以NH_4NO_3作为氮源,3株菌株均表现出较高的酶活性;SL04菌株生长的适宜pH值为6左右,SL02和SL10菌株生长适宜的pH值为8～9.     

一株纤维素分解菌的分离及其粗酶性质研究

从堆肥、牛粪、马粪、土壤等样品中共分离出35株微生物菌株,其中的1株霉菌F10表现出最高酶活力．对比研究发现,F10在固体发酵实验中具有接近于绿色木霉AS3.3711的酶活力,而在液体发酵实验中则高于绿色木霉AS3．3711．研究结果表明,当碳源物质为羧甲基纤维素(CMC)、氮源物质为硝酸铵时,F10具有最佳产酶效果,产酶时间为48～84h;当pH为5．0,温度在40～60℃时,相应的滤纸酶活力、CMC酶活力及棉花酶活力最高为16．6、43．6、0、4U／g;而当pH位于4．0～5．0,温度为50℃时,相应的滤纸酶活力、CMC酶活力及棉花酶活力最高分别为9．1、29．5、0．25U/g;当温度超过60℃时,酶活力急剧下降．该研究可为生物肥料工业和发酵饲料工业的微生物学研究提供借鉴方法．     

产几丁质酶香蕉枯萎病拮抗细菌的分离鉴定及生物学特性研究

为了筛选出对香蕉枯萎病菌有拮抗作用的几丁质酶产生菌,以几丁质为唯一碳源进行几丁质酶产生菌筛选,然后通过平板对峙试验,从几丁质酶产生菌中筛选出1株香蕉枯萎病拮抗菌,通过形态特征和分子生物学分析,确定其为解淀粉芽孢杆菌并将其命名为DF.LB培养液测定的生长曲线显示24 h内该菌株生长达到稳定期;生物学特性数据显示该菌株在pH为5.15～8.94范围内生长良好,最佳pH为7.09;最佳碳源为甘露醇,最佳氮源为脲(尿素);拮抗试验可见病原菌菌丝发生膨大,凸起变形,原生质外漏造成菌丝中空干枯.     

梨胶胞炭疽病菌的分离、鉴定及其生物学特性

近年来,由胶胞炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的梨炭疽病在江苏、安徽两省酥梨产区普遍发生。本研究采集病样,分离并鉴定梨胶胞炭疽病菌25株。采用梨果表面刺伤后接种菌块的方法,观察炭疽病菌对砀山酥梨的致病性。平板接种炭疽病菌菌块,测试不同培养温度、pH值、碳源、氮源对炭疽病菌菌丝生长的影响。结果表明:参试的25株炭疽病菌中3株致病性较强,18株致病性中等,4株致病性较弱。致病性强的菌株其菌落颜色较深,菌丝浓密;致病性弱的菌株其菌落颜色均为白色,菌丝稀疏。菌落生长快,菌株的致病性较强;菌落生长慢,菌株的致病性较弱。菌株的产孢能力和致病性之间无相关性。梨胶胞炭疽病菌最适生长温度为25～30℃,最适生长pH值为5.0～7.0;菌丝对多种单糖和双糖等碳源及有机氮、无机氮均可利用,最适碳源为蔗糖,最适氮源为牛肉浸膏。     

兔源大肠埃希菌噬菌体分离鉴定与生物学特性研究

对浙江省某兔场腹泻病兔进行病原分离鉴定,经革兰氏染色和PCR鉴定,分离出致病性大肠埃希菌1株,命名为ZJE1株。ZJE1株对链霉素、环丙沙星敏感。以ZJE1株为宿主菌,分离纯化出噬菌体4株,分别命名为ZRP2、ZRP3、ZRP4和ZRP5,并对其生物学特性、形态与结构特征进行研究。结果显示,4株噬菌体分离株均由六角形的头部、可收缩的尾鞘和尾管组成,均属于肌尾噬菌体科。采用双层平板法测定噬菌体分离株的宿主谱、最佳感染复数、pH稳定性、热稳定性和一步生长曲线。结果显示,ZRP2、ZRP3、ZRP4和ZRP5具有宿主特异性,在37~55 ℃的条件下可保持良好活性。ZRP2、ZRP3在pH值7的条件下可保持良好活性,ZRP4、ZRP5在pH值5~7的条件下可保持良好活性。ZRP2、ZRP3、ZRP5的潜伏期为11~19 min,均能在体外裂解ZJE1株。研究成果可为应用噬菌体治疗兔大肠埃希菌病提供研究基础与数据支持。     

高效纤维素降解菌的筛选

对实验室现有14个霉菌菌株进行筛选,得到3株具有高效纤维素降解能力的菌株,分别为AL11、AL12、AL14。纤维素CX酶活力分别为706.7,733.3,725.0U.g-1.min-1;还原糖生成量为17.18,17.92,17.35mg.g-1;固体曲发酵培养基(麦麸∶稻草粉=37∶)失重率分别为57.8%,62.4%,58.8%。这3个菌株纤维素降解能力明显高于其他菌株。     

猪源嗜麦芽寡养单胞菌的分离鉴定与生物学分析

从四川省某规模化养猪场病死猪肺脏分离得到1株嗜麦芽寡养单胞菌,分析其生物学特性,为临床鉴别诊断和治疗提供参考。观察分离株的染色特点、培养特性,并通过生化试验进行鉴定;测定分离株对小鼠的LD_(50)并进行药物敏感试验,以分析分离株的致病性与耐药性;测序分析分离株16S rRNA基因序列,构建系统进化发育树。结果表明:该分离株的16S rRNA基因序列与嗜麦芽寡养单胞菌的同源性为99%;在TSA琼脂培养基上培养18h后可长成灰白色、光滑的露珠样小菌落,在血琼脂上菌落周围呈现α溶血;对小鼠的致病性试验测得LD_(50)为6.62×10~7 cfu/只;药敏试验发现分离株对多粘菌素B较为敏感,对喹诺酮类、四环素类、头孢类、碳青酶烯类和氨基糖苷类药物均表现为耐药。经鉴定,分离株为嗜麦芽寡养单胞菌,致病性较强,对多种药物耐药。该研究为该菌的临床诊断、选药治疗、疾病控制等奠定了基础。     

PRRSV HN-08株的分离鉴定及其部分生物学特性研究

【目的】对2008年河南省猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)流行株进行分离鉴定,并对其生物学特性进行研究,以了解免疫猪群发病的原因。【方法】从河南省猪场采集发病猪的血清和组织,采用Marc-145细胞对其中的PRRSV进行分离及初步鉴定。应用RT-PCR法对分离株进行扩增,并构建克隆载体,对阳性质粒测序后进行ORF5基因核苷酸及推导氨基酸序列分析,同时对分离毒株进行非免疫猪人工感染试验,确定其致病性。【结果】从发病猪组织和血清中分离到1株PRRSV(HN-08株),其可引起Marc-145细胞产生细胞病变(CPE),可在Marc-145细胞中稳定传代,能被PRRSV高免血清特异性中和;从人工感染发病猪组织和血清中均分离到PRRSV。RT-PCR得到与预期大小相符的特异片段,提交NCBI鉴定为HN-08株,属美洲型PRRSV。【结论】从河南省发病猪体内分离的HN-08株属美洲型PRRSV,对猪具有很强的致病力,可引起Marc-145细胞产生CPE,病毒滴度TCID50为105.1/mL。     

鸽骨骼肌卫星细胞的分离、培养及成肌特性

【目的】探讨白羽王鸽Columba livia骨骼肌卫星细胞的分离、培养和鉴定的方法,建立完整的家鸽骨骼肌卫星细胞的培养体系。【方法】选择孵化16 d的鸽胚作为试验材料,采用组织块贴壁法和胶原酶消化法分离胸肌的骨骼肌卫星细胞并绘制其生长曲线。待卫星细胞分化出肌管后,采用免疫荧光法检测肌球蛋白重链(MyHC)的表达;在细胞分化出肌管前、后分别提取总RNA,采用RT-qPCR方法检测Desmin、Pax7、MyoG和MyoD1基因在细胞分化出肌管前、后的相对表达量。【结果】组织块贴壁法和胶原酶法均能成功地分离出骨骼肌卫星细胞,其生长曲线呈"S"型;该细胞经含体积分数为20%FBS的DMEM高糖培养液培养7 d后视野中出现大量明显可见的肌管,成肌特异性标志MyHC表达呈阳性。RT-qPCR结果表明,Desmin和MyoG基因分化后的相对表达量分别是分化前的5.68和10.38倍,而Pax7和MyoD1基因分化前的相对表达量分别是分化后的7.01和5.51倍。【结论】建立了鸽骨骼肌卫星细胞的培养体系,为今后进行家鸽肌肉发育的研究提供细胞模型。