PCR指纹图谱技术在酸奶质量监测中的应用

用PCR指纹图谱技术对市售某品牌酸奶进行了短期动态监测,对于收集的3个生产批次的9个酸奶样品,用ERIC（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus,肠杆菌基因间保守重复序列）-PCR和PCR-DGGE（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,变性梯度凝胶电泳）指纹图谱技术对其菌种组成及其稳定性进行评价.ER-IC-PCR指纹图谱聚类分析结果显示,同一生产批次内3个不同包装的样品ERIC-PCR指纹图谱相似性为90%左右,而不同生产批次样品之间ERIC-PCR指纹图谱相似性有所下降,为82%.该结果进一步用DGGE指纹图谱进行证实.DGGE分析结果表明,G2样品明显缺少一条主带,经割胶回收测序发现,这条主带代表的微生物是Lacto-bacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus,说明该产品不同生产批次间的稳定性不是很好.DGGE图谱和测序结果还显示,除G2样品外,该酸奶样品的菌种组成与产品标签说明是一致的.     

应用PCR-DGGE分析肉鸡呼吸道中细菌多样性

从不同养殖时期的肉鸡呼吸道中提取微生物基因组总DNA,以细菌16S rDNA基因通用引物341F/534R进行V3高变异区域PCR扩增,长约200 bp的PCR产物经变性梯度凝胶电泳(DGGE)分离,获得微生物群落的特征DNA指纹图谱。通过DGGE图谱的半定量分析以及对条带的测序鉴定,发现样品的优势菌群明显。结果表明,PCR-DGGE是研究动物呼吸道微生物多样性的可行方法。     

采用PCR-DGGE技术分析蛋鸡肠道细菌种群结构及多样性

利用基于16S rDNA的PCRDGGE（变性梯度凝胶电泳）图谱技术结合特异性和共性条带割胶回收DNA进行克隆和测序,对2、4、6和8周龄蛋鸡嗉囊、十二指肠、空肠、回肠和盲肠内容物细菌群落的结构和多样性进行了比较,并鉴定了8周龄蛋鸡部分特异性和共性群落成员,分析蛋鸡年龄和肠段部位对微生物群落结构和多样性的影响。肠道菌群DGGE图谱显示肠道部位对细菌种群结构影响很大,盲肠内微生物的多样性最高,其次是回肠和空肠,嗉囊和十二指肠的微生物多样性比较低。十二指肠内细菌与其它肠段相比差异最大,其次是盲肠与其它肠段细菌组成的差异。随着蛋鸡周龄的增加,消化道微生物经历了由简单（2周）到复杂（4周）,再回复简单（6周）到复杂（8周）的变化过程。DGGE图谱中共性条带序列分析表明8周龄蛋鸡消化道前段的优势细菌是三得利乳杆菌（Lactobacillus suntoryeus）、索氏梭菌（Clostridium sordellii）和大肠杆菌,盲肠中的特异性条带主要是各种不可培养的细菌以及超巨巨单胞菌（Megamonas hypermegale）和梭菌属细菌（Clostridium spp）。该研究结果表明蛋鸡肠道部位决定细菌群落的结构和多样性,蛋鸡的周龄影响肠道细菌多样性。     

应用PCR-DGGE分析南美白对虾肠道微生物多样性

从南美白对虾肠道中提取微生物基因组总DNA,以细菌16SrRNA基因通用引物341F/534R进行V3高变异区域PCR扩增,长约200bp的PCR产物纯化后经变性梯度凝胶电泳(DGGE)分离,获得微生物群落的特征DNA指纹图谱。通过DGGE图谱的半定量分析,发现样品的优势群落明显。结果表明,PCR-DGGE是研究水产动物肠道微生物多样性的可行方法。     

DGGE/TGGE技术在微生物生态学中的应用

变性梯度凝胶电泳(deaturing grad ien t ge l e lectrophores is,DGGE)和温度梯度凝胶电泳(tem perature grad ien t ge le lectrophores is,TGGE)可以直接分离PCR扩增片段,作为一种分子指纹技术而逐渐被人们应用于微生态研究中。通过DGGE/TGGE对微生物组成的遗传特性进行表征,不但省去了菌种分离耗时耗力的工作量,更可鉴定出根据传统方法无法分离出来的菌种。作者重点描述了DGGE/TGGE的基本原理以及在胃肠道微生态研究中的应用。     

应用PCR-DGGE分析鸭场土壤细菌群落结构

为了解贵州省三穗县8个养鸭场环境土壤中细菌群落结构多样性概况,本试验采用试剂盒提取土壤样品细菌总DNA,PCR扩增细菌16S rDNA V3可变区,并通过变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术对扩增产物进行凝胶分离,回收测序共得到43条特异性条带,其中7、8号养鸭场条带数相对较少.DGGE图谱经Quantity One软件分析,结果显示,同一鸭场样品相似性存在差异,绝大部分鸭场样品间相似性均高于50%,所测序列与GenBank中相应原核生物16S rDNA序列经同源性比对可见相似性在90%~100%之间,共包括5个大纲的细菌种类:变形菌门(Proteobacteria)的α,β类群、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes).     

兔粪中微生物区系ERIC-PCR DNA指纹图谱的建立及分析

本研究旨在将ERIC-PCR基因指纹图谱技术应用于兔粪微生物的分析中,建立一种快速分析检测兔肠道菌群变化的方法。通过对PCR反应条件的优化确定适合兔粪微生物的ERIC-PCR反应条件,对比兔粪微生物组和兔粪优势菌的ERIC-PCR DNA指纹图谱差异,从而分析兔粪微生物ERIC指纹图谱的特征。结果建立了适合兔粪样品ERIC-PCR分析的反应体系,确定450bp处条带为双歧杆菌特征条带,1 300和4 000bp处为大肠杆菌特征条带;经发酵验证,图谱中的相应条带亮度变化趋势与计数平板所测结果相一致(相对亮度R与相对菌落数lg cfu的相关系数为0.967 6)。本研究优化建立了一种快速分析检测兔粪中菌群变化的ERIC-PCR指纹图谱技术,该技术可较好反映兔粪中优势菌含量的变化情况,为兔肠道疾病的预防、诊断和治疗提供依据。     

利用PCR-DGGE技术分析肉牛阴道菌群结构

利用PCR-DGGE技术明确肉牛阴道菌群结构并比较黄体期和卵泡期肉牛阴道菌群结构差异。选择7头肉牛,分别采集黄体期和卵泡期阴道分泌物,提取细菌总DNA,采用巢式PCR分别对细菌16SrDNA的V3区进行扩增,将PCR产物进行变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)。对DNA指纹图谱特异性条带切胶回收并进行克隆测序,通过BLAST与已知序列对比,鉴定细菌菌种,分析比较黄体期和卵泡期肉牛阴道菌群结构。结果显示:健康肉牛阴道内存在阴道气球菌(Aerococcus vaginalis str.)、绿色气球菌(Aerococcusviridans str.)、睡眠嗜血杆菌(Haemophilussomnus str.)、多动物链球菌(Streptococcus pluranimalium str.)、嗜冷杆菌(Psychrobactermarincolastr.)、大肠杆菌(Escherichia coli O157:H7str.)和鞘氨醇单胞菌(Sphingomonasroseiflavastr.)等。     

基于紫外指纹图谱的公英青蓝合剂质量研究

为建立公英青蓝合剂的紫外指纹图谱测定方法,本试验采用紫外分光光度计扫描10批公英青蓝合剂全波长图谱,用相关系数法计算公英青蓝合剂样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度,提升公英青蓝合剂的质量标准。结果表明,绿原酸含量符合规定的样品紫外指纹图谱吸光度满足0.165~0.265 Abs（317.00 nm）、0.162~0.285 Abs（282.00 nm）、0.137~0.240 Abs（259.00 nm）,且与对照指纹图谱的相似度均在0.910以上;绿原酸含量不符合规定的样品紫外指纹图谱样品紫外指纹图谱吸光度不满足0.165~0.265 Abs（317.00 nm）、0.162~0.285 Abs（282.00 nm）、0.137~0.240 Abs（259.00 nm）或与对照指纹图谱的相似度低于0.910,该方法可用于控制公英青蓝合剂的质量。     

聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术分析1只死亡野生川金丝猴胃肠道菌群多样性

本试验旨在对1只死亡野生川金丝猴的胃肠道菌群多样性及其克隆测序条带的系统进化树进行分析。取死亡野生川金丝猴胃肠道内容物,进行聚合酶链式反应(PCR)-变性梯度凝胶电泳(DGGE)分析,结合条带的克隆测序、聚类分析和主成分分析(PCA)检测菌群多样性并构建系统进化树。结果显示:1)野生川金丝猴整个胃肠道栖息着大量细菌,且来自胃、小肠的样品聚为一大簇,来自大肠的样品聚为一簇,而来自粪便的样品单独聚为一簇。2)从DGGE图谱上共回收18个条带,细菌种类鉴定主要是5个菌门,分别为变形菌门(Proteobacteria,38.89%)、厚壁菌门(Firmicutes,22.22%)、拟杆菌门(Bacteroidetes,5.56%)、放线菌门(Actinobacteria,5.56%)、疣微菌门(Verrucomicrobia,5.56%)和不可培养菌(uncultured bacterium,22.22%)。其中,变形菌门和厚壁菌门分布于整个胃肠道。3)菌群的系统进化树分析表明,仅有1种不可培养菌与已鉴定的粪肠球菌进化分类相似,而其他不可培养菌与已知的菌种进化分支差异较大,说明在野生川金丝猴的胃肠道中仍有大量的菌群信息未被鉴定。结果提示,本试验测定的1只死亡野生川金丝猴的胃肠道优势菌群为变形菌门,菌群多样性随着胃肠道由前至后的顺序呈现高—低—高的趋势。     

运用PCR-DGGE分析比较瘤胃中不同饲料固相粘附微生物区系

通过研究奶牛瘤胃中苜蓿、青贮玉米和羊草3种饲料固相粘附微生物菌群结构,分析比较附着于不同粗饲料微生物区系的差异。选择3头健康且体质量相近的装有永久性瘤胃瘘管的中国荷斯坦奶牛,将苜蓿、青贮玉米和羊草分别装入尼龙袋,在瘤胃中孵育24h后取出,PBS洗脱获得固相粘附微生物,提取总DNA,采用变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)分析群落结构,选取清晰条带测序后构建系统发育树。不同样品的DGGE图谱条带的数目和条带颜色深浅有一定差异;苜蓿与青贮玉米和羊草间相比相似性较低,青贮玉米与羊草间的相似性较高;3种饲料及瘤胃内容物固相粘附微生物的Simpson多样性指数差异显著(P0.05),Shannon-Wiener多样性指数差异不显著(P0.05);3种饲料固相粘附微生物条带近源种分别归属Butyrivibrio sp.、Fibrobacter sp.、Prevotella sp.、Succiniclasticum sp.、Pseudobutyrivibrio sp.5个属。3种饲料固相粘附微生物的种群构成存在差异。     

利用ERIC-PCR和PCR-DGGE技术分析喂服枯草芽孢杆菌肉鸡肠道菌群的多样性

本文旨在采用ERIC-PCR和PCR-DGGE方法研究肉鸡喂服枯草芽孢杆菌后肠道菌群的多样性.选用15羽28日龄肉鸡,按2mL/kg BW喂服枯草芽孢杆菌悬液(10°CFU/mL).每天2次,连续3d,34日龄时,利用ERIC-PCR和PCR-DGGE方法分析肠道菌群的多样性,并对DGGE条带进行回收、测序.结果表明,肉鸡口服枯草芽孢杆菌后各肠段的条带数显著多于对照组(P<0.05或P<0.01),2种方法检测结果相似,2组之间肠道总菌群相似性为53.2%;电泳指纹图谱和统计条带数量分析,PCR-DGGE明显优于ERIC-PCR;回收条带以乳杆菌属细菌为主.结果提示,34日龄肉鸡肠道菌群具有一定的稳定性,以乳杆菌为主要菌群,饲喂芽孢杆菌后能提高肉鸡肠道菌群的丰度和种群密度;PCR-DGGE检测方法明显优于ERIC-PCR.     

不同益生菌对肉鸡肠道菌群结构的影响

本试验旨在研究益生菌对肉鸡肠道微生态环境的影响,饲养试验选取1日龄的肉公鸡432只,分成4个组,组1饲喂基础饲粮,组2饲喂基础饲粮+地衣芽孢杆菌(≥4×106CFU/g饲粮),组3饲喂基础饲粮+屎肠球菌(≥106CFU/g饲粮),组4饲喂基础饲粮+丁酸梭菌(≥106CFU/g饲粮)。采用PCR-变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术对肉鸡肠道内细菌16S r DNA V3区进行菌群多样性分析,利用实时荧光定量PCR(q PCR)技术对肠道菌群数量进行定量分析。PCR-DGGE指纹图谱结果表明:与对照组相比,地衣芽孢杆菌、屎肠球菌和丁酸梭菌均不同程度的影响了肉鸡回肠、空肠及盲肠样品PCR-DGGE指纹图谱的条带数,其中屎肠球菌处理后回肠、空肠样品PCR-DGGE指纹图谱的条带数显著增加(P0.05),其余样品PCR-DGGE指纹图谱的条带数无显著变化(P0.05)。由PCR-DGGE指纹图谱条带明亮度可知:屎肠球菌在回肠食糜中发生了生长繁殖,且促进了乳杆菌生长;地衣芽孢杆菌的添加促进了乳杆菌的生长繁殖,与其产生了协同作用,而抑制了粪肠球菌(C.eutactus)和梭菌(C.irregulare)的生长,二者相互竞争;饲粮中添加丁酸梭菌促进了L.aviaries在空肠及L.versmoldensis在回肠食糜中的生长繁殖,其作用效果比较专一。q PCR结果表明:地衣芽孢杆菌组空肠、回肠及盲肠细菌的菌群数量分别是对照组的1.5倍、1.0倍和1.3倍;屎肠球菌组空肠、回肠及盲肠细菌的菌群数量分别是对照组的4.0倍、6.0倍及0.6倍;丁酸梭菌组空肠、回肠及盲肠细菌的菌群数量分别是对照组的1倍、3.5倍及0.5倍。该研究结果表明地衣芽孢杆菌、屎肠球菌和丁酸梭菌不同程度改变了肉鸡肠道的菌群结构。     

HPLC指纹图谱法评价市售僵蚕的品质

为了科学评价僵蚕的品质,建立了僵蚕的高效液相色谱指纹图谱分析方法,并对市售13个批次僵蚕药材的指纹图谱进行比较分析。结果发现这13批僵蚕的HPLC指纹图谱上共有11个明显的色谱峰,通过与标准品比对确定其中4个色谱峰分别为芦丁、紫云英苷、槲皮素和山奈酚; 13个批次僵蚕药材的指纹图谱具有显著差异,仅有5个共有特征峰,而且共有峰峰面积相差较大,相对标准偏差(RSD)分布在43. 31%~90. 62%之间。以共有模式R为基准,对市售僵蚕药材特征指纹图谱进行相似度计算,结果显示13个样品中相似度大于0. 90的有8个样品,相似度在0. 85~0. 90之间的有1个样品,相似度低于0. 85的有4个样品。结果表明,建立的僵蚕HPLC指纹图谱专属性强、稳定性好,能较真实、全面地反映僵蚕的特征;所测市售僵蚕药材品质参差不齐,在化学成分组成和含量上均有显著差异。     

酸奶变质的污染菌群分析

导致酸奶变质的最主要原因是污染了酵母菌、霉菌及其它杂菌，其中主要表现为酵母菌和霉菌。通过市场随机取样，分析归类鉴定，这两类微生物普遍存在于各类酸奶中，这充分说明酸奶较适合这些微生物生长繁殖，但生产厂家只要加强生产工艺环节的卫生控制，可以有效地抑制这些微生物在酸奶中的生长繁殖。一、材料与方法１．材料从市场上随机抽取４种品牌１６瓶酸奶。２．内容与方法酸奶中主要污染菌将酸奶在无菌条件下处理，分离培养，根据菌落形态特征分类计数。（１）酵母菌培养。样品在链球菌麦芽汁琼脂培养基上培养（２８℃，５天）。（２）…     

42份高梁与苏丹草及其2个杂交种DNA指纹图谱的构建

选用100个RAPD引物和95对SSR引物进行PCR扩增,旨在构建42份高粱和苏丹草品种资源及2份国审品种高粱苏丹草杂交种的DNA指纹图谱。结果表明,从100个RAPD引物中筛选到9个多态性高、重复性好的引物,多态性条带比率为64．06％,利用4个核心RAPD引物可以为每份品种构建1张特定的数字指纹,并通过其中1个引物F-01构建了1张能鉴别2个杂交种的RAPD指纹图谱,不过该图谱不能区别皖草3号与其父本Sa。从95对SSR引物中筛选出多态性丰富的引物73对,多态性条带比率为86．06％,通过3对核心SSR引物就可以构建42份高梁和苏丹草的SSR数字指纹,同时利用其中1对SSR引物txp18,寻找到2个杂交种的互补带,从而构建了2个高粱-苏丹草杂交种的SSR指纹图谱,这张SSR指纹图谱不仅能鉴别皖草2号和3号,还可以把杂交种与其亲本区别开来。     

猫源弓形虫虫株的分离与鉴定

将猫的心、脑、舌用盐酸-胃蛋白酶溶液消化处理后接种小白鼠，经连续传代分离弓形虫虫株，用特异PCR方法对所分离的虫株进行了鉴定。分别从24只猫的样品中分离出8株弓形虫虫株，用弓形虫种特异的PCR方法对8个虫株进行鉴定。均得到弓形虫的特异条带；测序证明所扩增出的DNA片段确为弓形虫的核糖体DNA第一 内转录间隔区（ITS1）部分序列。研究结果表明，将动物组织用盐酸-胃蛋白酶溶液消化处理后接种小白鼠是一种分离弓形虫虫株较为理想的方法．特异PCR方法能准确、快速地鉴定弓形虫虫株。     

伊朗传统Lighvan和Koozeh干酪的微生物多样性

作者采用纯培养和非培养方法研究了由生鲜羊奶或混合羊奶(羊奶和山羊奶)自然发酵制作的伊朗传统Lighvan和Koozeh干酪的微生物区系。对3批Lighvan干酪和1批Koozeh干酪进行了非培养的PCR-DGGE分析和主要条带的测序,以此评价干酪制作和成熟过程中微生物区系的结构和动力学。此外,采用选择性培养基(M17、MRS和KAA)对乳酸菌进行培养,用PCR-ARDRA、基因测序及rep-PCR方法对分离出的单个菌落(n=130)从分子水平上进行鉴定。DGGE分析结果表明,在所有4批干酪样品中优势菌群为Lactococcus lactisa和Streptococcus parauberis。此外,在Lighvan和Koozeh干酪中Escherichia coli和Lactococcus gar-viea的检出频率较高,但只在几个干酪样品中检测到Strepto-coccus thermophilus。相反,在所有样品中Enterococcus faecium和Enterococcus faecalis也是主导菌群;微生物菌群之间表现出较高的生物多样性。纯培养和非培养的DGGE结果之间的差异表明主导菌群在这些培养基中是不可回收的,这种结果说明在进行干酪微生物生态系统的研究中,纯培养和非培养方法获得的数据可以互补。可以从获得的菌株中筛选出具有潜在工业化生产Lighvan和Koozeh干酪的发酵剂,也可以从中筛选出特定的菌株作为发酵剂用于传统干酪的生产。     

酸奶变质的污染菌群分析及控制研究

导致酸奶变质的最主要原因是污染了酵母菌、霉菌及其它杂菌，其主要表现为酵母菌和霉菌。通过市场随机取样，分析归类鉴定，这两类微生物都普遍存在于各类酸奶中，这充分说明酸奶较适合这些微生物生长繁殖，但生产厂家只要加强生产工艺环节的卫生控制，可以有效地抑制这些微生物在酸奶中的生长繁殖。一、材料与方法１．材料从市场上随机抽取４种品牌１６瓶酸奶。２．内容与方法（１）酸奶中主要污染菌将酸奶无菌条件下处理，分离培养，根据菌落形态特征分类计数。酵母菌培养，样品在链霉菌麦芽汁琼脂培养基上培养（２８℃５天）。霉菌培养：…     

延长酸奶菌种保存期的简易方法

延长酸奶菌种保存期的简易方法○安徽农业大学畜牧水产学院（合肥市２３００３６）李湘琼酸奶生产中发酸剂的活性是影响酸奶质量的决定因素。具有充分活性的菌种是发酵剂扩培并保持其稳定性以及维持生产的基本要求。因此，菌种的保存周期必须以维持其良好活性为前提。用于...