鳡鱼ISSR-PCR反应体系的正交优化

利用正交试验设计的方法,对鳡鱼ISSR-PCR反应体系中的Mg2+浓度、引物浓度、dNTPs浓度、DNA模板浓度及Taq DNA聚合酶浓度进行优化分析。建立了最佳ISSR-PCR反应体系,即25μL反应体系中含Mg2+2mmol/L、引物0.4μmol/L、dNTPs 0.2mmol/L、模板DNA 100ng、Taq DNA聚合酶1.0U。并在此基础上对退火温度和循环次数进行梯度试验,得到最佳退火温度为52℃,最佳循环次数35次。     

荷斯坦奶牛RAPD反应条件的优化

以中国荷斯坦奶牛为实验材料,研究了Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA浓度、TaqDNA聚合酶,以及退火温度对RAPD反应的影响,建立一套适合中国荷斯坦牛的最佳RAPD反应体系。反应总体积为20μL,Mg2+浓度为2.5mmol/L,TaqDNA聚合酶浓度为1U,引物浓度为2μmol/L,dNTPs浓度为400μmol/L,模板DNA浓度为100ng。PCR反应程序:94℃预变性2min→40循环(94℃变性1min→36℃退火1min→72℃延伸1min)→72℃延伸5min。     

拟穴青蟹ISSR-PCR条件的优化

分析DNA模板、Mg2+、dNTPs、引物和Taq DNA聚合酶及甲酰胺、二甲基亚砜等对拟穴青蟹ISSR-PCR反应的影响.研究结果确定了获得清晰条带的模板DNA、Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶的浓度范围分别为:模板DNA 8～50 ng/μl ,Taq DNA聚合酶0.75～1.0 U, Mg2+1.0～2.0 mmol/L(与引物密切相关),dNTP 0.15～0.20 mmol/L,引物浓度0.6～0.8 μmol/L.甲酰胺的添加并不能优化拟穴青蟹ISSR-PCR反应结果,而低浓度的二甲基亚砜可提高扩增产物的清晰度,但与引物相关.     

基于正交试验设计优化三疣梭子蟹SRAP-PCR反应体系

相关序列扩增多态性（sequence related amplified polymorphism,SRAP）是一种多态性高的新型分子标记,其扩增结果稳定,容易操作和引物通用性高,在遗传多样性分析、种质鉴定和遗传图谱构建等方面的广泛应用逐渐从植物转移到水产动物中。为了建立三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）SRAP技术体系,文章利用正交设计L16（45）对三疣梭子蟹SRAP-PCR反应体系的5因素[TaqDNA聚合酶、镁离子（Mg2＋）、模板、三磷酸脱氧核苷（dNTPs）和引物]在4个水平上进行优化试验,结果得出各因素水平变化对PCR反应的影响从大到小依次为模板（纯度1.75~1.90,质量浓度10~70ng.μL-1）,Mg2＋（1.60~2.00mmol.L-1）,dNTPs（0.10~0.40mmol.L-1）,TaqDNA聚合酶（0.50~2.00U）和引物（0.10~0.40μmol.L-1）;筛选出各反应因素的最佳水平,建立三疣梭子蟹SRAP-PCR反应的最佳体系（25μL）为TaqDNA聚合酶0.50U,Mg2＋2.20mmol.L-1,模板DNA10ng,dNTPs0.20mmol.L-1,引物0.20μmol.L-1。这一优化体系可望在三疣梭子蟹遗传多样性和性别连锁标记等研究中应用。     

罗非鱼TRAP分子标记反应体系优化设计方案的比较

靶位区域扩增多态性（target region amplification polymorphism,TRAP）是一种新型功能性分子标记,比较了L16（4^5）正交试验和单因素方法优化罗非鱼（Oreochromis spp．）TRAP反应体系。2种分析方法结果中dNTPs浓度、随机引物浓度、DNA浓度相同而镁离子（Mg2＋）浓度和TaqDNA聚合酶浓度不同,不同因素间存在一定的交互作用。正交设计方法比单因素法更简单、科学、合理。该试验获得罗非鱼15txLTRAP最优反应体系为DNA模板浓度为60ng、Mg2＋浓度为1．5mmol·L^-1、dNTPs浓度为0．3mmol·L^-1、TaqDNA聚合酶0．5U、随机引物浓度为7pmol·L^-1和固定引物浓度为10pmol·L^-1。该反应体系在4个罗非鱼群体中验证,表现出良好的稳定性和重复性,该反应体系的建立为TRAP标记应用于罗非鱼遗传多样性评价、种质鉴定、分子标记辅助育种等研究提供了新的手段。     

西施舌基因组DNA的提取及其RAPD反应条件的优化

通过实验比较获得了一种高效、简便的西施舌基因组DNA的提取方法,以该法提取的基因组DNA为模板,对西施舌RAPD分析中的DNA模板浓度、镁离子浓度、dNTPs浓度、引物浓度和Taq酶浓度进行了研究,初步确定了适于西施舌RAPD分析的最佳反应体系:25μL反应体系中,含模板DNA 25 ng,10×PCR缓冲液2.5μL,dNTPs 0.3 mmol/L,MgCl22.5 mmol/L,引物15 ng,Taq DNA聚合酶1.5U。     

荷斯坦奶牛RAPD反应条件的优化

以中国荷斯坦奶牛为实验材料，研究了Mg^2＋浓度、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA浓度、TaqDNA聚合酶，以厦退火温度对RAPD反应的影响，建立一套适合中国荷斯坦牛的最佳RAPD反应体系，反应总体积为20μL。Mg^2＋浓度为2．5μmol／L，TaqDNA聚合酶浓度为1U，引物浓度为2μmol／L，dNTPs浓度为400μmol／L．模板DNA浓度为100ng。PCR反应程序：94℃预变性2min→40循环（94℃变性1 min→36℃退火1min→72℃延伸lmin）→72℃延伸5min．     

鳜鱼SSR-PCR反应条件的优化探索

以鳜(Siniperca chuatsi)基因组DNA为试验材料,研究MgCl2浓度、dNTPs浓度、Taq DNA聚合酶3个反应参数对微卫星PCR的影响,建立一套适合鳜微卫星PCR反应的最佳体系.结果表明,在25μL的反应体系中,Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶3个参数的适宜浓度分别为1.2 mmol/L、0.2 μmol/L和0.04 U/μL.PCR反应程序为94℃变性5 min,94℃30 s,56℃ 1 min,72℃ 1 min,共30个循环,最后72℃延伸5 min.     

刀鲚RAPD分析条件的优化

以刀鲚基因组DNA为模板,对刀鲚RAPD分析中的DNA模板浓度、镁离子浓度,dNTPs浓度、引物浓度进行了研究。研究结果初步确定了适用于刀鲚遗传多样性分析的RAPD反应体系为:25μl反应体系中,含10×PCR缓冲液2.5μl,模板DNA20ng, dNTPs0.1m mol/L,Mg~(2+)2.5m mol/L,引物0.4μ mol/L,Taq DNA聚合酶1U。     

青鱼ISSR-PCR反应体系的建立及优化研究

以赣江野生青鱼(Mylopharyngodon piceus)基因组DNA为试验材料,研究Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度和模板浓度4个参数对ISSR-PCR反应的影响,建立一套适合青鱼ISSR-PCR反应的最佳体系。结果表明,在25μL的反应体系中,Mg2+、dNTP、引物和模板4个参数的最适宜浓度分别为:3.0mmol/L、0.25mmol/L、0.4umol/L和30ng。PCR扩增程序为:94℃预变性5min,94℃30s,52℃45s,72℃2min,共38个循环,最后72℃继续延伸10min。