中国黄牛重组PrPc成熟蛋白单克隆抗体的研制

将纯化的牛重组PrP^c成熟蛋白免疫PrP^c基因敲除小鼠（PrP^c-null mice)，利用淋巴细胞杂交瘤技术，经一次融合，共筛选出3株能稳定分泌针对中国黄牛PrP^c成熟蛋白特异单克隆抗体的杂交瘤细胞株4D5、5C10和3F3。免疫印迹试验表明；腹水单抗4D5、5C10和3F3均可特异识别重组中国黄牛PrP^c成熟蛋白。     

鲁西黄牛α干扰素成熟蛋白基因的克隆及序列分析

根据GenBank上发表的牛α干扰素基因序列,设计了一对特异性引物.提取黄牛血液中白细胞基因组DNA,PCR扩增出α干扰素基因,并与pMD18-T克隆载体相连.测序结果表明,扩增片段含有498个核苷酸,编码166个氨基酸的成熟蛋白,与已报道的牛α干扰素C亚型最相近,氨基酸序列同源性为97.6%.获得BoIFN-α成熟蛋白基因,为重组牛干扰素的开发奠定了基础.     

奶牛朊病毒基因克隆与序列分析

根据已报道正常牛朊蛋白(PrP^c)基因(PRNP)序列设计引物，采用PCR法扩增了6头荷斯坦奶牛的PRNP基因，将其克隆到T-Vector。序列测定及分析表明所克隆的奶牛PRNP基因片段为795bp，该基因内无内含子，包含了牛PRNP完整编码区序列，编码264个氨基酸的前体蛋白，推测其分子量约34ku。其中2头共同含有未曾报道的牛PRNP多态性位点M120I，无义突变G234A，但未引起酶切位点变异，未发现插入或缺失变异；与已报道牛PRNP序列(GenBank收录号为DI0613)相比，两者核苷酸序列同源性为99％，其编码的氨基酸同源性为99％。     

鸡myostatin基因成熟区段DNA的克隆及其在甲醇酵母中的融合表达

根据GenBank中鸡myostatin（AF019621）成熟区段的cDNA序列设计了1对引物，利用PCR技术扩增了萧山鸡myostatin的成熟区段，构建了重组真核表达载体myostatin-pPIC9K，并在甲醇酵母中融合表达了myostatin蛋白。结果发现，萧山鸡myostatin基因存在2处碱基变异：T^204→C^204（编码的氨基酸没有变），C^205→T^205（编码的氨基酸由Pro变成Ser），从而产生了1个EspⅠ或Bpull02Ⅰ限制性内切酶酶切位点。核苷酸序列同源性分析表明，myostatin基因成熟区段DNA在不同物种间具有高度的保守性。SDS-PAGE鉴定结果表明，表达的目的蛋白（26ku）具有生物学活性。     

藏绵羊朊蛋白基因的原核表达

从藏绵羊全血中提取基因组总DNA，用所设计的引物以聚合酶链式反应扩增出细胞型朊蛋白（PrP^c）基因。测序分析表明，所克隆的羊PrP^c基因片段大小为771bp，包含了羊朊蛋白基因的完整编码区序列，其与国内外报道的序列基本相同。将目的基因与经EcoRⅠ和XhoⅠ酶切的载体pGEX-4T-1连接后转化宿主菌BL21（DE3），挑选重组阳性菌用IPTG诱导表达，收集不同培养时间的菌液进行SDS-PAGE和Western-blotting。结果表明，PrP基因在大肠杆菌中成功表达，并能被抗牛PrP^c单抗4C11识别。凝胶薄层扫描结果显示，表达蛋白约占菌体总蛋白的309／6～45％，目的蛋白以包涵体的形式存在，包涵体经变性裂解、纯化和复性后得到具有一定生物学活性的目的蛋白。     

香猪NRAMP1基因多态性与仔猪腹泻的研究

天然抗性巨噬蛋白1(natural resistance associated macrophage protein 1,NRAMP1)基因是与人、鼠的一些病原微生物(如分支杆菌中的沙门氏伤寒菌等)的易感性和抗性有关的重要候选基因。本研究利用PCR-RFLP技术,分析了香猪的NRAMP1基因第6内含子的NdeⅠ酶切位点的多态性;观测记录哺乳仔猪的腹泻情况,结果发现,NRAMP1基因的第6内含子的NdeⅠ酶切位点在各品种猪表现出丰富的多态性,该酶切位点的基因频率和基因型频率在各猪种中分布趋于一致,香猪不同品系基因型与腹泻指数统计分析结果显示,Ⅰ系、Ⅱ系差异不显著,11世代显著高于10世代。     

肾型禽传染性支气管炎病毒（IBV）Z株S1基因的结构与变异

利用1对pUC质粒通过测序引物和3条合成引物，通过步黎法完成了肾型IBV Z株S1基因全部序列测定。所测序列已被GENBANK收录，收入号为AF140352，该片段全长1747bp，含有1个无终止子的阅读框架，编码558个氨基酸，与IBV－Beaudette株S1基因序列比较，同源性为77％，并出现部分碱基的缺失与重组，无BamH Ⅰ，EcoRⅠ酶切位点，PstⅠ位点也未出现，氨基酸同源性为74％。     

南阳黄牛TLR2基因扩增及序列分析

根据GenBank中发表的牛TLR2基因序列设计引物,通过PCR方法对南阳黄牛的TLR2基因进行分段扩增并测序,拼接后得到包含TLR2完整编码区以及5′端和3′端非编码区的2399bp的全序列。序列分析结果表明,南阳黄牛TLR2基因开放阅读框全长2 355bp,共编码784个氨基酸。南阳黄牛的TLR2基因编码区与荷斯坦牛的相比发生了16个碱基突变,其中9个发生在胞外区,2个发生在跨膜区,5个发生在胞内区,没有引起氨基酸的改变。与GenBank已发表的其他动物TLR2基因参考序列进行比较,结果显示南阳黄牛与荷斯坦牛、野牛、水牛、山羊、绵羊、猪、大猩猩和人的同源性分别为99.3%、99.3%、98.0%、96.3%、95.5%、85.4%、83.2%和83.1%。TLR2N末端存在信号肽且可能在21位氨基酸处存在裂解位点,蛋白分子结构预测TLR2蛋白含1个跨膜结构域。     

绵羊肺腺瘤病毒NM株囊膜基因的定向克隆与融合表达

根据绵羊肺腺瘤病毒(SJRV)NM株基因组全序列，设计了1对包含囊膜(env)基因在内的引物，并在5′端分别设计了HindⅢ和BnmHⅠ酶切位点，利用PCR技术扩增env基因，通过连接反应将其克隆于pET-30b表达载体上。序列分析表明，env基因全长1836bp，编码612个氨基酸残基；构建表达重组质粒env—pET—30b，转化大肠埃希氏菌BL21，经IPTG于37℃诱导培养，SDS—PAGE电泳分析表明，表达的env基因融合蛋白分子质量约为69ku。     

牦牛KAP3.3基因的克隆及生物信息学分析

本研究以牦牛的角蛋白关联蛋白3.3(KAP3.3)基因作为研究对象,通过查询GenBank中收录的黄牛KAP3.3基因的mRNA序列设计1对特异性引物,通过逆PCR、PCR以及基因克隆测序的方法首次获得牦牛的KAP3.3基因完整的CDS区序列,并对其进行生物信息学分析。结果表明:牦牛KAP3.3基因的CDS区为297 bp,编码98个氨基酸;编码的蛋白质属于亲水性蛋白。二级结构含有延伸链、β转角以及无规卷曲3种。氨基酸序列与黄牛的完全一致,具有Keratin,high sulphur matrix protein家族的完整结构域。     

中国黄牛PrPc成熟蛋白的原核表达和抗原性分析

将中国黄牛PrPc 成熟蛋白基因重组质粒b -pET11a -PrPc(本室构建 )转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达。SDS -PAGE电泳显示表达产物的分子量约为23KD ,大小与预计相符 ;免疫印迹 (WesternBlotting)试验进一步证实 ,中国黄牛PrPc 成熟蛋白获得了正确的表达 ,且与大肠杆菌BL21(DE3)具有共同抗原成分     

柞蚕溶菌酶基因的克隆和序列分析

采用cDNA末端扩增(RACE)方法及简并引物克隆了柞蚕溶菌酶(Antheraea pernyilysozyme)基因(Gen-Bank登录号:DQ353869)。该基因cDNA序列全长675 bp,由3个外显子和2个内含子组成,其开放读码框(ORF)长420 bp,编码140个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码蛋白的1-20位氨基酸为信号肽序列,21-140位氨基酸为柞蚕溶菌酶成熟蛋白(分子质量14 kD,等电点8.46)。柞蚕溶菌酶氨基酸序列中含有c型溶菌酶分子所特有的活性中心Glu32、Asp50以及8个半胱氨酸残基,与鳞翅目昆虫溶菌酶的氨基酸序列同源性较高,属非钙结合型c型溶菌酶。柞蚕溶菌酶的模拟三级结构与印度柞蚕(Antheraea mylitta)溶菌酶的三级结构十分相似。     

三黄鸡ST3Gal6基因的半定量RT-PCR及生物信息学分析

本研究旨在对三黄鸡ST3Gal6基因进行组织表达谱和生物信息学分析。参考三黄鸡ST3Gal6基因序列设计引物,采用PCR技术克隆三黄鸡ST3Gal6基因序列,并利用半定量RT-PCR进行组织表达谱分析;同时对其进行生物信息学分析。结果表明,克隆的三黄鸡ST3Gal6基因全长1169 bp,含有1059 bp的完整CDS编码区,编码352个氨基酸。其CDS编码区的核苷酸序列与人、黑猩猩、牛、大鼠、蟾ST3Gal6基因对应序列的同源性分别为62%、62%、61.9%、59%、54.4%。组织表达谱分析表明,ST3Gal6基因在各组织均不同程度地表达,其中在大脑表达量很高,肺脏中最低。生物信息学预测ST3Gal6蛋白结构发现,三黄鸡的ST3Gal6蛋白存在2个跨膜螺旋结构域,同时预测ST3Gal6存在22个磷酸化位点和1个特异性蛋白激酶磷酸化位点。     

鸡艾美耳球虫3-1E基因的克隆与表达

应用反转录 -聚合酶链式反应 (RT- PCR)技术 ,分别从柔嫩艾美耳球虫甘肃株 (E.tenella GS,Et GS)和堆型艾美耳球虫青海株 (E.acervulina QH,Ea QH)孢子化卵囊子孢子中提取的总 RNA扩增得到鸡球虫子孢子表面抗原 3- 1E基因 (Et GS3-1E和 Ea QH 3- 1E)。将 Et GS3- 1E与原核表达载体 p GEX- 6 P1连接 ,构建了的 p GEX- 3- 1E原核表达质粒 ,并获得融合蛋白的高效表达和纯化。序列分析表明 :Et GS3- 1E和 Ea QH 3- 1E的 ORF均为 5 13个碱基 ,共编码 171个氨基酸。Et GS3- 1E的蛋白分子量为 18.5 k D,Ea QH 3- 1E的蛋白分子量为 18.6 k D。ORF比较 ,Et GS3- 1E与文献报道的 Ea3- 1E比较 ,共有 2个核苷酸发生变异 ,核苷酸同源性为 98.8%,有 1个氨基酸发生变异 ,氨基酸同源性为 99.4 %;Ea QH 3- 1E与文献报道的 Ea3- 1E比较 ,共有 4个核苷酸发生变异 ,核苷酸同源性为 97.7%,有 3个氨基酸变异 ,氨基酸同源性为 98.3%;Et GS 3- 1E与 Ea QH 3- 1E比较 ,有 3个核苷酸发生变异 ,核苷酸同源性为 98.2 %,有 2个氨基酸发生变异 ,氨基酸同源性为 98.8%。获得了 Et GS 3- 1E融合蛋白的高效表达和纯化 ,表达率达 4 3.2 %。     

奶牛骨钙素基因的克隆与原核表达

以奶牛骨组织提取的RNA为模板，利用RT—PCR技术扩增出奶牛骨钙素全长cDNA，然后将扩增产物重组到PMD-18T载体中，测定了全基因的核苷酸序列。序列分析表明，奶牛骨钙素全长cDNA为303bp，编码100个氨基酸，与GenBank中的X53699的序列完全相同。通过加端PCR技术连接单链DNA片段人工定点同义突变，将奶牛骨钙素成熟蛋白基因中的大肠杆菌稀有密码子同义突变为大肠杆菌常用密码子并亚克隆至PET-32a表达载体．转化到宿主菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导后，成功表达出奶牛骨钙素融合蛋白。     

樱桃谷鸭白介素18基因的克隆与原核表达

从鸡新城疫病毒刺激的鸭脾脏淋巴细胞培养液中提取基因组RNA，采用RT—PCR方法扩增鸭IL-18基因，插入pMD18-T载体，进行序列测定与分析。将成熟鸭IL-18基因亚克隆到表达载体PBCX中，并转化入大肠杆菌E．coliBL21进行表达。测序结果表明，该基因由603个核苷酸组成，包含一个完整阅读框，共编码201个氨基酸。表达载体经IPTG诱导表达出相对分子量约为59KD的融合蛋白。     

迪庆黄牛血液蛋白多态性及其在中国黄牛中的地位

本研究采用淀粉凝胶电泳法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定云南迪庆黄牛血清白蛋白（Ａ１ｂ）、血清运铁蛋白（Ｔｆ）、血清碱性磷酸酶（Ａｂｐ）和血红蛋白（Ｈｂ）等四个位点的基因频率。为分析迪庆黄牛这一高原类型地方牛种在中国黄牛中的地位，利用本研究的迪庆黄牛以及文献报道的中国１０种黄牛的四个多态位点的等位基因频率资料，计算标准遗传传距离，并进行聚类分析。结果表明：迪庆黄牛独自一类，来自于青藏高原的迪庆黄牛在中国黄牛中占有十分重要的地位．结合文物考证资料，推测青藏高原很可能是中国黄牛的发源地。     

荷斯坦牛中性粒细胞β-防御素基因克隆及其原核表达质粒的构建

根据已发表的牛β-防御素基因序列设计引物,从具有临床乳腺炎症状的荷斯坦奶牛血液中性粒细胞中提取RNA,克隆牛β-防御素基因并插入到原核表达载体pQE-30中,构建了原核表达质粒pQE-30/β-defesion。测序结果表明,克隆的目的基因长189bp,编码1个氨基酸,与已报道的牛β-防御素氨基酸序列同源性达95.6%。本研究为牛乳腺防御素的表达及功能、活性的研究奠定了一定的基础。     

水牛黑色素皮质素1受体基因克隆、生物信息学分析及表达模式研究

本试验旨在对水牛黑色素皮质素1受体(MC1R)基因进行克隆、生物信息学分析及表达模式研究。参考牛MC1R基因(GenBank登录号:JN123363.1)序列设计引物,以本地沼泽水牛、白沼泽水牛、摩拉水牛和黄牛基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增克隆MC1R基因片段并进行测序分析。运用QRT-PCR方法检测摩拉水牛、沼泽水牛、白沼泽水牛和黄牛皮肤组织中MC1R基因的表达模式,并通过Western blotting方法检测沼泽水牛和白沼泽水牛MC1R基因的蛋白表达差异。结果表明,应用PCR方法成功克隆了水牛MC1R基因,其编码区全长954 bp,共编码317个氨基酸。测序分析后发现沼泽水牛、白沼泽水牛、摩拉水牛和黄牛MC1R基因的核苷酸序列和氨基酸序列相似性很高。沼泽水牛与白沼泽水牛在476、618、881、930和931 bp位点上分别发生T→C、G→C、G→A、G→A和A→G突变,导致了沼泽水牛和白沼泽水牛第159位氨基酸由丝氨酸变成苯丙氨酸,第310位氨基酸由谷氨酸变成丙氨酸,第294位氨基酸由天冬氨酸变成丙氨酸,发生了非同义突变。QRT-PCR结果发现,MC1R基因在摩拉水牛、沼泽水牛和黄牛皮肤组织中的相对表达量均显著高于白沼泽水牛(P<0.05);Western blotting分析结果显示,沼泽水牛皮肤组织中MC1R蛋白的表达量高于白沼泽水牛。综上所述,白沼泽水牛MC1R基因的编码区发生氨基酸位点突变,且相对表达量和蛋白表达量均低于沼泽水牛,推测此为白沼泽水牛体内合成的黑色素缺失而导致毛色白化的主因。