山羊B组轮状病毒KB－63株动物感染实验

以山羊Ｂ组轮状病毒ＫＢ－６３株（本室分离鉴定）口服接种剥夺初乳的新生山羊羔、绵羊羔、犊牛以及仔猪。该毒株可在接种后１２～１７ｈ内引起山羊羔、绵羊羔，以及犊牛发生急性腹泻，并排出大量病毒，其核酸电泳图型及组抗原检测也与原接种病毒一致。当该毒株接种剥夺初乳仔猪时，不能引起仔猪腹泻也不排出病毒     

猪A组轮状病毒HN2019-01株的分离鉴定及VP6基因序列分析

为了解猪轮状病毒(RV)在河南省的流行情况及其分子遗传特征,利用反转录PCR方法,从河南某猪场腹泻样品中扩增得到RV特异性核酸片段,并将腹泻样品利用MA-104细胞进行RV的分离和传代,将分离得到的RV命名为RVA/Pig-wt/HN2019-01.对分离毒株VP6基因片段的序列测定及生物信息学分析结果表明,分离毒株V...     

我国牛猪轮状病毒部分分离株的亚组鉴定

利用轮状病毒亚组特异性单克隆抗体进行捕捉法ＥＬＩＳＡ，对我国４株牛轮病毒分离株和４株猪轮状病毒江苏分离株进行了亚组抗原特异性鉴定，结果证实，所有被测试的牛，猪轮状病毒国内分离株，在亚组抗原特异性上均属第Ｉ亚组，未发现有属于第ＩＩ亚组的毒株。     

犊牛轮状病毒的分离鉴定

将犊牛腹泻粪便经轮状病毒酶标诊断试剂盒检测阳性者,应用Marc145细胞培养,从河北省奶牛场分离出1株牛轮状病毒。分离毒株在Marc145细胞上产生明显的细胞病变,测其TCID50=10-4.70/0.1mL;提取该分离毒株的RNA,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测其电泳型为4∶2∶3∶2型,属于A群轮状病毒;RT-PCR方法扩增出342bp的目的条带,特异性检测均未见目的条带,进一步证实为轮状病毒。     

新生牛轮状病毒的分离及其基因型鉴定

为了解轮状病毒在腹泻奶牛中的流行情况,从2008年12月到2009年6月,我们在大庆某牛场共收集117份小于7日龄新生牛的腹泻标本,用A群轮状病毒抗原诊断试剂盒对腹泻标本进行检测;应用MA104细胞对阳性标本进行分离,扩增细胞分离株保护性抗原VP7基因,并对该基因进行序列分析。腹泻标本中有10份标本(8.5%)经A群轮状病毒抗原检测试剂盒确认为阳性,成功的分离出一株轮状病毒,命名为:DQ-75,分离株DQ-75VP7基因的基因型是G10,该分离株中VP7基因与现有G10型轮状病毒毒株的VP7编码区氨基酸的系统进化树分析提示其可能是随着奶牛的购入而进入我国。     

四株猪轮状病毒对不同细胞的感染性试验

测定了４株狸轮状病毒对７株传代细胞和１１种原代细胞的感染敏感性。结果是：四株猪轮状病毒，都能迅速适应于ＭＡ１０４传代细胞株上生长敏殖，并能连续传至数十代以上，耐对其他的传代细胞和原代细胞均不适应。     

抗猪轮状病毒VP6单克隆抗体的制备与鉴定

用纯化的重组PRV VP6蛋白免疫BALB/c小鼠,运用淋巴细胞杂交瘤技术,通过间接ELISA筛选,获得了1株稳定分泌抗PRV VP6的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名C5D10。经鉴定C5D10为IgG1亚类,杂交瘤细胞的平均染色体数为93,细胞培养液上清及腹水效价分别为18∶00和11∶×106,且C5D10单克隆抗体不与猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒发生交叉反应,显示良好的特异性。     

牛轮状病毒的分离及其RT-PCR鉴定

采用MAl04细胞从疑似轮状病毒腹泻犊牛粪样中进行轮状病毒分离，盲传4代后接种细胞出现明显细胞病变（CPE），对分离病毒进行核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳条带为4：2：3：2型，具备典型A群轮状病毒特征。依据NCBI等登录的牛轮状病毒的VPl基因序列设计一对引物，对其VPl基因进行克隆及序列分析，结果分离毒与国外牛轮状病毒分离株RF的核苷酸同源性为98．9％，与UK的核苷酸同源性为91．5％，证明分离毒株是一株牛轮状病毒。     

2017-2019年四川地区猪A群轮状病毒的分子流行病学调查

[目的]通过对四川地区规模化猪场A群轮状病毒(RVA)的分子检测,从而了解RVA流行情况及分子特征,为猪RVA疫苗研制提供理论基础.[方法]2017-2019年从四川省14个地区40个猪场采集303份仔猪腹泻样本,用荧光定量RT-PCR方法调查RVA的分子流行率,用RT-PCR方法对RVA阳性样本进行分型和VP4和VP...     

NSP4基因突变的重组牛轮状病毒的拯救及其鉴定

【目的】 通过反向遗传技术结合RNAi筛选和蚀斑克隆方法,拯救出毒力减弱的轮状病毒(rotavirus, RV)。 【方法】 以野生型轮状病毒CHLY基因组RNA为模板,通过重叠PCR方法在NSP4基因93-104 nt引入5个沉默突变核苷酸,并将毒力位点区135aa、136aa和138aa对应的核苷酸进行定向突变,构建了含有突变位点的转录质粒△pT7-NSP4/89/M。将该质粒与携带RNA聚合酶基因的重组质粒pcDNA3.1/T7-RNAP共转染已接种野生型RV病毒的MA104细胞单层,继续培养24 h,获得了携带NSP4变异基因的RV病毒粒子和野生型RV病毒粒子的混合病毒。将获得的混合病毒接种MA104细胞,通过RNA干扰和蚀斑克隆方法逐步筛选纯化以获得拯救RV。 【结果】 成功拯救出了NSP4基因变异的RV,该病毒在MA104细胞上的病变和致乳鼠腹泻效果较野生型RV明显减弱。【结论】 通过反向遗传技术结合RNAi筛选和蚀斑克隆方法成功拯救出毒力减弱的RV;NSP4毒力位点135aa、136aa和138aa的变异对RV毒力改变和腹泻严重程度有影响。     

G6P[5]型牛轮状病毒的分离鉴定

轮状病毒(Rotavirus,RV)是全世界范围内引发多种幼龄动物及婴幼儿病毒性腹泻的最主要病原之一,给畜牧业发展和人类健康造成严重危害。通过RT-PCR对来自宁夏犊牛腹泻粪样进行检测,选取阳性样品经MA104细胞进行病毒分离。细胞盲传4代后出现CPE,至7代后细胞CPE现象明显,获得1株牛轮状病毒,扩增VP7、VP4基因并测序分析,结果表明该分离株属于G6P[5]型轮状病毒,命名为NX28。研究明确了G6P[5]型在国内牛群中的存在及流行,并为下一步的牛轮状病毒的分子流行病学研究奠定基础。     

一株苯并芘高效降解菌的筛选鉴定

为了寻找可降解苯并芘的高效降解菌,从长期受苯并芘污染的焦化厂周边土壤和废水中取样,以苯并芘为唯一碳源反复驯化,分离、筛选出1株高效降解苯并芘的菌株A18。经形态特征和分子生物学分析,初步鉴定为木贼镰刀菌(Fusarium equiseti)。菌株A18在苯并芘溶液浓度为5 mg/L下,28℃振荡培养12 d,苯并芘的降解率达到44.8%。该菌株首次被证实具有降解苯并芘的能力。     

牛A组轮状病毒VP4全基因的克隆与原核表达

以G6型牛轮状病毒总RNA为模板,应用RT-PCR技术扩增牛轮状病毒VP4开放性阅读框,通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pEASy-T3载体中,成功构建出克隆质粒pEASY-T3-VP4.经双酶切后再将该基因重组于原核表达载体pET32a(+)中,构建出原核表达质粒pET32a-VP4.将pET32a-VP4转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约108 KD的融合蛋白带,成功构建了能够稳定表达VP4蛋白的基因工程菌株,为进一步研制牛轮状病毒基因工程疫苗奠定了基础.     

一株兼具砷氧化还原功能微杆菌的筛选和鉴定

[目的]为获取兼具砷氧化还原功能的多功能菌株。[方法]通过多次分离、纯化,先从广西河池砷污染地区的水源洞水样中筛选出砷耐受菌,再从砷耐受菌中筛选出在好氧条件下既能还原As（Ⅴ）又能氧化As（Ⅲ）的多功能菌株CLL-B7。[结果]经测定16SrDNA的序列,鉴定菌株属于Microbacterium sp.,GenBank中的注册号是JF975617。该菌株能耐受高达115mmol/LAs（Ⅴ）和40mmol/LAs（Ⅲ）,不能利用除营养肉汤外的多种有机碳源,在pH6条件下生长情况最好。该菌株在3d内几乎能完全还原10mmol/LAs（Ⅴ）,并从第7天开始表现出砷氧化功能。[结论]该菌株能在好氧环境下进行砷还原,可能利用有机碳源作为电子供体。     

一株溶藻弧菌H1B6的分离与鉴定

从患病的半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)溃疡体表处筛选到一株H1B6优势菌株,根据形态观察、16S rDNA检测、生理生化鉴定结果,H1B6菌株与溶藻弧菌最为接近,而在以16S rDNA序列构建的系统发育进化树模型中,H1B6菌株也与溶藻弧菌菌株聚为一支。Biolog微生物鉴定结果显示,H1B6菌株为溶藻弧菌的可能性为98.6%,确定H1B6菌株为溶藻弧菌。斑马鱼攻毒试验结果显示,H1B6菌株24 h的半数致死浓度(LD_(50))为4.58×10~6 CFU/mL。