陆地棉干旱胁迫基因GhRBCO的克隆与表达分析

Rubisco蛋白(ritmlose-1,5-bisphosphosphate carboxylase/oxygenase,Rubisco)的上调表达是植物应对非生物胁迫的特征之一.本研究在前期蛋白质组学分析的结果上,利用同源克隆获得陆地棉'KK1543'在干旱胁迫下差异表达的基因GhRBCO.GhRBCO基因编码区长...     

陆地棉GhDAHP基因的克隆与表达分析

棉花黄萎病是制约棉花产业健康发展的一种重要病害,在生产上未发现有效的根治办法,使用现代基因工程技术,从基因库中挖掘抗黄萎病相关基因,为棉花抗黄萎病育种工作的提供理论基础。本研究根据在GenBank中检索到抗黄萎病基因SDAHP(GU479467,1,3-脱氧-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶),从陆地棉基因组数据库中检索到3个同源基因(NM_016893351.1,XM_016849738.1和XM_0168151150.1),根据3个同源基因核苷酸序列设计引物,以陆地棉cDNA为模板进行克隆,获得3个目的基因,依次命名为GhDAHP-1、GhDAHP-2和GhDAHP-3。利用ProtParam和Prot Scale等在线软件对目的基因进行生物信息学分析;RT-PCR分析黄萎病菌诱导后目的基因在陆地棉叶片中的表达量。结果表明:GhDAHP-1序列全长1983 bp,氨基酸总数为539,分子质量约59.45378 kD,理论等电点pI为8.7;GhDAHP-2序列全长1832 bp,氨基酸总数516,分子质量约57.02998 kD,理论等电点pI为7.68;GhDAHP-3序列全长1652 bp,氨基酸总数517,分子质量约56.95491 kD,理论等电点pI为8.52。系统进化树分析,GhDAHP与雷蒙德氏棉(Gossypium raimindii)、木本棉(Gossypium arboreum)的亲缘关系最近。棉花叶片在黄萎病菌的处理下,GhDAHP基因表达量呈现先升高后降低的趋势,推测受到黄萎病诱导后,GhDAHP基因可能参与了黄萎病菌侵染的防卫过程。     

阳春砂WRKY40的克隆、分析及原核表达

转录因子可有效调控植物次生代谢产物的生物合成,本研究从姜科药用植物阳春砂(Amomum villosum Lour.)中克隆获得两个WRKY转录因子基因,命名为AvWRKY 40-1和AvWRKY 40-2。两个基因的编码框分别为852 bp和885 bp,分别编码283和294个氨基酸。Av WRKY 40-1和Av WRKY 40-2编码的蛋白序列一致性为75%,在GenBank中均比对上拟南芥的WRKY 40,且均含有WRKY转录因子家族所共有的WRKKYGQK七肽序列及CX5CX23HNH锌指结构域。系统发育进化树表明:Av WRKY 40-1和Av WRKY 40-2与菠萝(Ananas comosus)的AcWRKY 71亲缘关系最近,且与单子叶植物的WRKY聚为一支。两个基因在阳春砂果皮和种子团中的表达有差异,并且与阳春砂转录组中筛选出来的萜类合酶基因表达相关性也存在差异,AvWRKY 40-1表现出与萜类合酶基因更高的相关性。成功构建了两个基因的重组表达载体pDEST 17-Av WRKY 40-1和pDEST 17-Av WRKY 40-2,经诱导表达得到其融合蛋白。本研究首次克隆阳春砂的WRKY类转录因子基因并获得其融合蛋白,为后续Av WRKY 40-1和Av WRKY 40-2的功能鉴定及其对萜类的代谢调控研究提供基础。     

陆地棉基因GhWRKY40-1的克隆及表达分析

【目的】WRKY转录因子通过激活下游一系列抗逆应答基因的表达而提高植株的综合抗性。本研究旨在研究WRKY转录因子在陆地棉中的功能。【方法】通过基因芯片筛选鉴定出1个逆境诱导的陆地棉WRKY转录因子基因,由于此基因编码蛋白含有1个典型的WRKY结构域,且与拟南芥At WRKY40具有较高相似性,故命名为GhWRKY40-1。采用电子克隆及反转录-聚合酶链反应技术获得GhWRKY40-1基因c DNA全长,并对其进行序列分析及结构与功能预测。【结果】GhWRKY40-1的开放阅读框为981 bp,编码326个氨基酸,预测蛋白相对分子质量为35.78×103,等电点为8.39。GhWRKY40-1在拟南芥原生质体中瞬时表达定位于细胞核,且具有转录激活活性。RT-PCR结果表明,GhWRKY40-1受甘露醇诱导上调表达。【结论】推测GhWYKY40-1可能参与干旱胁迫应答反应,并且在植物逆境胁迫中发挥重要作用。上述分析为进一步从分子水平上验证其抗逆生物学功能以及揭示棉花非生物胁迫抗逆机制奠定了基础。     

三个陆地棉水孔蛋白基因的克隆与表达分析

从陆地棉SSH-cDNA文库的测序结果中得到一条具有完整ORF的陆地棉水孔蛋白基因序列,将其命名为GhAQP2。以该基因编码的氨基酸序列为探针,在棉花EST数据库经同源搜索得到2个相似性较高的EST,利用RACE技术获得其全长cDNA序列,将其基因命名为GhAQP3和GhAQP4。基因结构分析发现GhAQP2和GhAQP3各有4个外显子,3个内含子;GhAQP4有3个外显子,2个内含子。生物信息分析表明3个基因编码蛋白均含有6个跨膜区,2个NPA结构域,其氨基酸序列具备MIP超家族典型的蛋白保守区序列特征。多序列比对发现3个基因的氨基酸序列与其他物种PIP2类水孔蛋白氨基酸序列具有很高的同源性。qRT-PCR分析表明,GhAQP2在纤维伸长后期优势表达,GhAQP3在下胚轴和子叶中高表达,GhAQP4在纤维伸长前期优势表达,推测3个基因在不同的组织中发挥作用。GhAQP2在20DPA优势表达,为研究该基因在纤维伸长向次生壁加厚期转化过程中的表达调控提供了重要信息。     

一个陆地棉类烯醇酶基因的克隆及其表达分析

 采用改良的CTAB法提取陆地棉总RNA,运用RT-PCR技术首次克隆了陆地棉类烯醇酶基因的CDS序列,该基因已经在GenBank上登录,登录号为 EU169604,其开放阅读框为1338 bp,编码445个氨基酸残基。对其序列和进化分析表明,陆地棉烯醇酶基因与其它植物中的烯醇酶基因有较高的相似性,该基因在进化过程中是相当保守的。半定量RT-PCR表达分析结果显示该基因在陆地棉的叶、根、茎中均有表达,但在根中的表达量高于叶和茎。     

马铃薯晚疫病菌应答WRKY基因的结构功能预测与植物表达载体构建

WRKY是一类广泛参与高等植物各种抗逆调控活动的转录因子,可以通过激活下游相关信号转导途径调节自身的应激反应,进而增强植物抗逆性。本研究通过RNA-Seq从马铃薯(Solanum tuberosum)中筛选出一个晚疫病菌诱导WRKY转录因子基因StWRKY。采用RT-PCR技术获得该基因CDS全长,并对其进行序列分析及结构功能预测。根据StWRKY蛋白序列进行同源性搜索,得到与其蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列,使用MEGA7软件对St WRKY蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建了系统进化树。利用在线工具ProtParam对StWRKY进行氨基酸理化性质分析;利用SMART在线工具进行蛋白序列分析;利用SWISS-MODEL在线工具和PredictProtein在线平台分别对StWRKY蛋白二级结构和三级结构进行分析。结果表明,StWRKY核苷酸序列CDS全长为957 bp,编码含318个氨基酸的蛋白质,预测蛋白分子量为36.17 k D,等电点为6.49。既不是分泌蛋白也不是膜蛋白,未发现跨膜区、信号肽和复合螺旋区。StWRKY三维空间结构主要由无规卷曲以及β-折叠组成。通过XcmⅠ酶切、连接将StWRKY装载到pCXSN载体上,构建了该基因的超表达载体pCXSN-StWRKY。StWRKY基因的克隆,为进一步从分子水平上验证其抗晚疫病的生物学功能以及揭示马铃薯生物胁迫抗逆机制奠定基础,并为马铃薯抗病育种提供新的基因资源。     

陆地棉EPSPS 基因的克隆及其组织特异性表达分析

 5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）是莽草酸途径中的一个重要酶,它是非选择性除草剂草甘膦的靶标酶,在高等植物中定位于叶绿体质膜上。根据EST拼接的序列设计引物,从陆地棉品种珂字棉312中获得了全长为1834 bp的cDNA序列,其最大可读框为1565 bp,编码521个氨基酸。陆地棉EPSPS基因与其它植物中同类酶在氨基酸水平上有广泛的同源性。通过与已知的其它高等植物叶绿体转运肽剪切位点比对,推断棉花EPSPS基因含有74个氨基酸叶绿体运输肽和447个氨基酸组成的熟蛋白。该酶具有保守的PEP结合位点及催化位点的特征序列。半定量分析表明,该基因产物广泛存在于棉花根、茎和叶等各组织中,在叶片中表达量较高。进一步扩增棉花核基因组获得了3344 bp的DNA序列,它包含8个内含子和7个外显子。棉花EPSPS基因的克隆为抗草甘膦棉花种质资源的创制提供了理论基础。     

苜蓿WRKY56基因的克隆及生物信息学分析

WRKY转录因子是高等植物特有的转录因子,也是近年来研究较为广泛的转录因子,且在植物生长、根系发育、果实成熟、衰老等代谢过程中发挥着重要的作用。本研究利用PCR技术克隆到紫花苜蓿(‘WL525HQ’,‘WL712’,‘肇东’)的LbWRKY56和LmWRKY56基因,片段长度均为379 bp左右,编码379个氨基酸,其分子量分别为33.48、30.12 kD;同源序列分析显示与蒺藜苜蓿、白三叶的亲缘关系最近,同源性分别达到97%和93%。RT-qPCR分析其在不同时期不同品种的紫花苜蓿不同组织中的表达特性,结果显示该基因在‘WL525HQ’、‘WL712’和‘肇东’的茎和叶中均有表达。在分枝期和初花期,WRKY56在‘肇东’的茎中的表达量最高,在‘WL525HQ’的叶中的表达量最高。从分枝期至初花期,该基因在茎中的表达量逐渐减少,在叶中表达量逐渐增多;并且该基因在初花期的叶中的表达是急剧上升的,在初花时期相对表达量最多。因此该基因可能在不同时期不同品种苜蓿的不同组织中有促进苜蓿生长发育的作用。     

三个桑树肌动蛋白基因的克隆与组织表达分析

肌动蛋白基因在植物各种生理活动中具有极其重要的作用,通过同源克隆与反向PCR的方法,克隆了3个肌动蛋白基因的核心片段,其中一个为已报道的MaACT1,另两个分别被命名为MaACT2和MaACT3,进而PCR扩增获得MaACT1和MaACT2肌动蛋白全长CDS,其中MaACT2基因全长1 704 bp,由4个外显子和3个内含子组成,CDS为1 134 bp,编码377个氨基酸残基。采用RT-PCR的方法分析了3个基因在叶、茎、果、根等组织的表达情况以及在茎、叶和托叶的生长过程中的表达变化。MaACT1在茎中表达量较弱但有随着茎的生长逐渐增强的趋势,在幼叶中有较高的表达,MaACT2与MaACT3在根、茎、叶等组织中都有较高表达,MaACT3在叶、托叶和茎的各个发育时期表达都很稳定,可以作为桑树基因表达研究的内参基因。     

棉花磷胁迫响应基因GhWRKY6克隆及功能分析

【目的】提高棉花在低磷胁迫下的抗性,挖掘棉花磷胁迫相关功能基因。【方法】用生物信息学方法分析Gh WRKY6基因的结构特征和进化关系;构建基因超表达载体转化拟南芥,分析转基因拟南芥在低磷胁迫下的抗性;利用荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)分析拟南芥中磷信号途径Marker基因表达量的变化。【结果】以陆地棉cDNA为模板克隆得到Gh WRKY6基因,生物信息学分析表明该基因序列含有一个WRKY保守结构域,是WRKY家族转录因子。在低磷胁迫下,转基因拟南芥与野生型相比,种子萌发速度、主根长度、侧根数目、生物量均低于野生型,而在正常生长条件下两者并无差别。qRT-PCR分析表明GhWRKY6能够影响关键的磷转运蛋白基因的表达。【结论】GhWRKY6作为一个负调控因子参与到植物低磷胁迫响应信号途径中。     

一个棉花类受体蛋白激酶基因的克隆与表达分析

 利用简并引物扩增、染色体步移以及RT-PCR的方法,分离了棉花的一个类受体蛋白激酶基因的全长序列。序列分析表明,该基因没有内含子,开放读码框的长度为2964 bp,编码的多肽序列含有988个氨基酸并与拟南芥控制花器官脱落的基因HAESA-like2具有60%左右的相似性,将该基因命名为GRLK5。半定量RT-PCR分析发现GRLK5在种子、茎皮、根和纤维中的表达量较高,并且受ABA的诱导表达。将GRLK5整合到植物表达载体pCAMBIA2301中,构建植物过量表达载体,通过农杆菌介导,采用叶盘法转化烟草,PCR检测证明目的基因已经整合到烟草基因组中。     

棉花S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因的克隆及低温下的表达分析

根据棉花S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase, SAMDC)基因已知EST序列设计引物,采用RACE和RT-PCR技术克隆获得该基因的全长cDNA序列,命名为GhSAMDC (GenBank登录号为JN020148)。生物信息学分析表明,GhSAMDCcDNA序列全长1 874 bp,涵盖tiny ORF (tORF)、upstream ORF (uORF)和main ORF (mORF) 3个植物SAMDC基因特征ORF。其中mORF长1 064 bp,编码含355个氨基酸残基的SAMDC酶原,预测分子量为38.25 kD,该酶原含有高度保守的酶原剪切位点结构域(LSESSLF)和与SAMDC蛋白快速降解有关的PEST (TIHVTPEDGFSYAS)结构域。GhSAMDC基因组DNA序列全长2 743 bp,包含3个内含子,均位于5'' UTR,其中一个位于uORF内。聚类分析表明,GhSAMDC与葡萄中该蛋白的同源关系最近,并且与其他双子叶植物聚为一类。荧光定量PCR分析结果表明,GhSAMDC表达受低温诱导,在冷敏感品种新陆早1号中基因表达水平明显高于在耐冷品种新陆早33号中。     

棉花亲环素基因(GhCYP1)克隆及在干旱胁迫下的表达分析

本研究从已构建的棉花(Gossypium hirsutum)干旱胁迫抑制性差减杂交(suppressive subtractive hybridization,SSH)cDNA文库分离得到一个含有植物亲环素保守结构域的EST片段,测序并结合cDNA末端快速扩增(5'-RACE)技术获得了1个779bp的cDNA序列。序列分析表明,该cDNA5'非翻译区为70bp,3'非翻译区为187bp,并含有一个编码174个氨基酸蛋白的开放阅读框。Blast分析表明,该基因的编码产物为一个亲环素蛋白,将该基因命名为为GhCYP1,序列提交到GenBank,登录号为GQ292530。半定量RT-PCR分析表明,干旱胁迫处理后,该基因在叶片中的表达量迅速提高,并在胁迫2h达到最高,这一研究暗示该基因的表达与棉花抗旱胁迫相关。     

陆地棉一个丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白基因的克隆与表达分析

通过RT-PCR获得一个编码棉花丝氨酸/苏氨酸激酶类似蛋白全长的cDNA片段,其编码的氨基酸序列与拟南芥ATPK3的相似度达到82%,这个基因暂被命名为GhPK1。基因全编码区包括1038个核苷酸,编码346个氨基酸的蛋白。GhPK1的编码产物在265~270个氨基酸处有一个跨膜区并可能结合在内质网膜上。GhPK1在种子和纤维中的表达水平较其它组织高。另外,GhPK1的表达量在受到盐胁迫后上升,说明GhPK1可能参与了盐胁迫反应。     

陆地棉Dirigent-like基因(GhDIR)的克隆与分析

Dirigent-like基因(DIR)编码蛋白质参与木质素的形成,与植物体的病菌防御有关.本研究以抑制差减杂交( SSH)技术获得DIR的EST为信息探针,对棉花EST数据库进行同源搜索和序列拼接,获得了全长为768 bp的DIR基因cDNA全长,将该基因命名为GhDIR.该基因序列的开放阅读框(ORF)位于70 ～...