狂犬病病毒P和M基因重组突变体的生物学特性分析

【目的】探索狂犬病病毒（RABV）强毒株P基因替换及P-M基因联合替换至弱毒株获得的重组突变体在宿主细胞内的传播能力、复制与转录能力及致病性,为掌握RABV强毒株P蛋白和M蛋白的生物学特性打下基础。【方法】以RABV广西街毒株GX01为研究对象,利用反向遗传技术将其P基因分别替换到弱毒株rRC-HL和r RC-HL(GX01M)株的对应位置,通过间接免疫荧光试验（IFA）及基因测序鉴定拯救的病毒,并测定重组突变体的多步生长曲线、荧光灶面积及N基因表达水平等,同时通过4周龄昆明小鼠攻毒试验验证P基因及P-M基因联合替换后对RABV致病性的影响。【结果】利用反向遗传技术能成功拯救重组突变体rRC-HL(GX01P)和rRC-HL(GX01P-M),通过IFA测定病毒荧光灶面积及多步生长曲线发现,r RC-HL(GX01P-M)株在BSR/T7-9细胞上的生长能力及传播能力均较rRC-HL(GX01P)株和rRC-HL(GX01M)株强。在复制与转录水平上,rRC-HL(GX01P)株的N基因相对表达量高于r RC-HL(GX01M)株,但低于rRC-HL(GX01P-M)株。在昆明小鼠攻毒...     

微管对狂犬病病毒胞内感染的影响

狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)依赖宿主细胞完成其感染周期,且在胞浆内复制。微管作为一种细胞骨架,是介导胞内物质运输的重要通道。为探究狂犬病病毒胞内感染是否依赖于细胞骨架——微管,利用小鼠神经母细胞瘤细胞(N2a),接种实验室标准攻击毒株CVS-11,通过诺考达唑(Nocodazole)抑制剂破坏微管形成,采用实时荧光定量PCR方法、Western Blot方法、免疫荧光方法检测微管对于RABV感染量的影响,并采用TCID_(50)法测定微管对RABV病毒滴度的影响。结果表明,Nocodazole通过抑制微管的形成,使RABV N基因水平降低25%、N蛋白水平降低50%,免疫荧光检测到病毒感染率降低70%,上清液中病毒滴度由10~(6.5)TCID_(50)/mL降低至10~(4.5)TCID_(50)/mL,说明狂犬病病毒胞内感染依赖于细胞骨架-微管的参与。该结果为进一步研究狂犬病病毒胞内运输及其复制机制的研究提供了理论依据。     

狂犬病病毒分子生物学研究进展

综述了狂犬病病毒基因组结构、基因型及其结构蛋白的结构与功能的分子生物学进展,为进一步认识和控制狂犬病奠定基础。     

狂犬病病毒G蛋白的过表达及对病毒的抑制

【目的】探究G蛋白在狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)复制中的作用,以揭示携带双G基因的重组RABV的Hep-dG与亲代毒株rHep-Flury在神经母细胞瘤(NA)细胞中滴度差异的原因,为RABV致病机制的研究奠定基础。【方法】通过病毒吸附、入侵、荧光定量PCR、Western-blot以及中和抗体阻断等试验,检测G蛋白过表达对IFN-β以及相关因子转录的影响。【结果】Hep-dG感染能显著上调NA细胞中IFN-βmRNA的表达,激活了下游因子STAT1的表达与磷酸化,在较低的感染复数(MOI=0.01)下,Hep-dG感染后24 h即可显著促进IFN-β基因的表达,36 h达到最高水平(P0.001)。该病毒进入细胞后,产生了更多的病毒Leader RNA和RIG-I mRNA,且与IFN-βmRNA的表达高度一致。抗体阻断IFN-β后,Hep-dG在NA细胞中的病毒滴度显著上升(P0.01),约为阻断前的7.9倍,且与亲代毒株rHep-Flury无显著差异。与阴性对照比较,5μg的pH-G质粒转染能刺激IFN-β的转录(P0.05),表明真核表达RABV G蛋白能在一定程度上刺激IFN-β的转录。【结论】本研究初步揭示了G蛋白激活先天性免疫应答的原因和作用。RABV G蛋白的过表达,通过促进病毒Leader RNA的转录,激活了RIG-I介导的IFN-β通路,进而抑制了Hep-dG在NA细胞的繁殖。G蛋白的过表达也对干扰素通路起到一定的作用。     

狂犬病病毒SRV9株磷酸化蛋白P基因和基质蛋白M基因重组质粒的构建

[目的]重组狂犬病病毒SRV9株磷酸化蛋白的P基因和基质蛋白的M基因,为构建狂犬病毒(SRV9)全长cDNA提供技术支撑.[方法]设计重组PCR引物,分别扩增SRV9的P基因和M基因,构建重组质粒pMD18-PM,并对重组质粒进行酶切、测序鉴定.[结果]PCR扩增的SRV9的P基因和M基因大小分别为893 bp和608 bp,与GenBank已发表的狂犬病病毒SRV9(登录号:AF499686)序列比较,同源性分别为99.66;和99.67;.融合基因PM片段大小为l 501 bp,与预期大小相同,且融合完全.[结论]应用重组PCR成功融合狂犬病病毒SRV9磷酸化蛋白P基因和基质蛋白M基因,为后续构建病毒全长cDNA及感染性克隆奠定基础.     

狂犬病病毒G蛋白的原核表达及反应原性分析

为优化狂犬病病毒G蛋白的原核表达条件,探究其反应原性,参照狂犬病病毒CTN-1V10株编码G蛋白基因序列,采用生物工程合成的方法合成编码G蛋白的基因片段,并将该片段命名为G5F。将该片段与pET-28a原核表达载体连接,构建重组表达质粒pET-G5F,并将重组质粒进行诱导表达,在IPTG浓度为0.2 mmol/L、温度为20℃、诱导12 h时,重组蛋白表达量最高。SDS-PAGE电泳及Western blot分析表明,G5F重组蛋白可溶性表达量高,且可以被抗狂犬病病毒单克隆抗体识别,反应原性良好。     

猪流行性腹泻病毒M蛋白的原核表达

本试验设计了M基因的特异性引物,扩增了M基因,成功构建了重组质粒,并转化至Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞中,优化了异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达条件.结果表明,重组表达的融合蛋白Pet-32a-M大小约为43 ku,与预期大小相符.十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测表明,M蛋白为包涵体蛋白,且在IPTG浓度为0.8 mmol·L-1,温度为37℃,诱导时间为8 h的条件下,蛋白表达效果最佳.蛋白免疫印迹检测结果进一步显示,重组蛋白Pet-32a-M在体外可以被成功表达.     

狂犬病病毒G蛋白昆虫细胞表达及其生物信息学分析

利用RT-PCR方法从SRV9株细胞毒基因组RNA扩增G蛋白基因,然后将其克隆到p MD18-T载体上,将得到的重组克隆质粒SRV9G-p MD18T进行PCR和测序鉴定。结果表明:克隆的基因全长为1 609 bp,阅读框正确;将此SRV9株G基因亚克隆到供体质粒p Fast Bac Dual后获得了重组供体质粒SRV9G-p Fast Bac Dual;进而将重组供体质粒转化DH10Bac感受态细胞,经2次抗性、蓝白斑筛选及PCR分析后,获得重组穿梭质粒SRV9G-Bacmid;将其转染Sf9细胞48 h后,通过细胞形态学和重组杆状病毒负染电镜观察显示,杆状病毒转染成功;通过Western blot检测显示,Sf9细胞成功表达了SRV9 G蛋白。随后,利用Ex PASy服务器上的在线分析工具和生物信息学分析软件DNAStar对G蛋白的基本性质进行了分析。试验采用昆虫细胞Bac-toBac杆状病毒表达系统,成功表达出G蛋白,并对其进行了生物信息学分析,为蛋白纯化及狂犬病诊断试剂盒的进一步研制奠定了基础。     

狂犬病病毒GX074株P-MS20F突变体构建及其生长特性鉴定

【目的】明确狂犬病病毒(RABV)强毒株GX074的P蛋白和M蛋白第20位苯丙氨酸(Phe)替换至弱毒株r RC-HL的重组突变体在宿主细胞内的生长特性,为P蛋白和M蛋白转录复制机理研究提供理论依据。【方法】运用反向遗传技术以强毒株GX074的M蛋白第20位Phe替换弱毒株r RC-HL(GX074P)的M蛋白第20位丝氨酸(Ser),构建r RC-HL(GX074P-M^S20F)突变体感染性c DNA克隆并拯救病毒。以重组突变体感染BSR/T7-9细胞,进行多步生长曲线测定,比较重组突变体与亲本毒株的生长能力,采用Western blotting检测N蛋白、P蛋白和M蛋白相对表达水平,利用实时荧光定量PCR检测N基因、P基因和M基因的相对表达量。【结果】经RT-PCR和测序鉴定,拯救的突变体r RC-HL(GX074P-M^S20F)M蛋白第20位Ser成功替换为Phe。多步生长曲线测定结果显示,构建的重组突变体在感染24、48、72和96 h后,病毒滴度均高于亲本弱毒株r RC-HL和对照弱毒株r RC-HL(GX074PM1),平均约为亲...     

RV野毒株的鉴定,毒力实验及其核酸探针的研究

对从我国不同地区、不同动物分离的３个疑似狂犬病毒分离物８２０２、ＢＲＶ、ＭＲＶ和无毒疫苗株ＳＲＶ９进行了ＥＬＩＳＡ和核酸探针的鉴定。同时，对它们的致病性和毒力进行了测定。结果表明，３个分离物均为狂犬病病毒，其毒力以鼠源ＭＲＶ最强，牛源ＢＲＶ最弱，同地下同动物分离的ＢＲＶ和ＭＲＶ毒力差异很大。疫苗株ＳＲＶ９对１２ｇ小鼠无致病性，研制的狂犬病毒地高辛标记核酸探针敏感性高，特异性强，适用于对狂犬病病料进     

禽流感病毒 HA 基因在狂犬病毒中的表达

为了研究狂犬病毒作为载体表达外源基因的特性,将禽流感病毒 HA 基因插入狂犬病毒全基因组cDNA感染性克隆pHEP-3.0 G基因与L基因的假基因位点,再通过反向遗传技术,获得了携带流感病毒 HA 基因的嵌合狂犬病毒(HepFHA),并进行了病毒传代与 HA 基因表达的研究. 结果显示,重组病毒经BHK-21细胞传代10次,病毒表达稳定,但各代次常规红细胞凝集试验均为阴性; Western blotting检测到病毒表达产物中存在部分HA蛋白的表达,其相对分子质量为39 540,与HA裂解的HA1蛋白相对分子质量相吻合.     

狂犬病病毒糖蛋白信号肽序列分析

为比较不同狂犬病病毒株糖蛋白信号肽序列的差异,测定了2株固定毒(CVS、3aG株)及2株街毒(Sx、PB3)的糖蛋白核苷酸序列,并推导了氨基酸序列.DNAstar软件分析表明:2株街毒糖蛋白信号肽同源性为100％,2株固定毒株同源性为84.2％,街毒株与CVS、3aG的同源性分别为78.9％和73.7％;2株街毒的信号肽序列与NCBI收录的我国近年来分离的街毒株的序列完全相同;街毒株与常用疫苗株间的同源性介于68.4％ ～ 84.2％,疫苗株PV与SRV9、PV与ERA、PV与SAG同源性均为100％.对糖蛋白信号肽疏水区(-15位到-4位)的二级结构预测和疏水值计算显示,街毒株信号肽的二级结构和疏水值均与常用疫苗株和固定株存在明显差异;在N2A细胞上效价测定显示,2株街毒的效价明显低于2株固定毒.     

狂犬病病毒免疫组织化学定位方法的建立

应用抗狂犬病病毒的特异性抗体及免疫组织化学方法检测接种了狂犬病病毒SRV-9毒株感染的小鼠脑组织,并对狂犬病病毒抗原进行了组织定位分析。结果表明:在小鼠的小脑分子层蒲肯野氏细胞胞浆出现明显的局灶型阳性颗粒。说明免疫组织化学方法检测狂犬病病毒敏感度高、直观,可作为诊断狂犬病病毒的辅助性方法,对研究狂犬病病毒在脑组织神经细胞及其他组织器官内的分布具有一定的意义。     

坦布苏病毒感染诱导雏鸭体内未折叠蛋白反应

[目的]检测坦布苏病毒在雏鸭体内诱导未折叠蛋白反应的信号通路(PERK、IRE1和ATF6),为揭示坦布苏病毒致病机制提供理论基础.[方法]取1日龄SPF雏鸭,腹腔接种坦布苏病毒(JS804株),于接种后12、24、36和48 h从对照组和攻毒组各取5只剖杀,分别取肝脏、心脏和脑组织,利用组织总RNA提取试剂盒提取各个...     

狂犬病病毒核蛋白的原核表达及纯化

采用RT-PCR方法扩增出狂犬病病毒(RV)CVS株核蛋白(N)基因,并将目的基因亚克隆入原表达载体pET-28 a(+)中,经PCR、双酶切以及序列分析,结果表明:已成功构建了重组质粒.将重组质粒转化至大肠埃希氏菌Rossetta(DE3),在37℃,1 mmol/L IPTG条件下进行诱导表达.诱导产物经SDS-PAGE分析,在分子量约为54 KD附近出现较粗的目的带,与预期的目的蛋白分子量相符合.经表达条件优化,用1 mmol/LIPTG在37℃诱导表达5 h,表达量达到最高,Western-Blotting鉴定目的蛋白有较强的免疫原性.为狂犬病毒的N蛋白的新型疫苗的制备奠定了基础.     

狂犬病病毒HEP-Flury株N基因的修饰及原核表达

为了高效表达狂犬病病毒HEP-Flury的核蛋白,选取抗原决定簇富集区,利用生物信息学技术分析了狂犬病病毒HEP-Flury N蛋白的核苷酸序列.根据大肠埃希菌Escherichia coli对密码子的偏嗜性,首先对所选取的核苷酸序列进行修饰、引入酶切位点,然后定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32-NP.将其转化表达宿主菌Escherichia coli BL21(DE3)pLysS,以IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE电泳,发现在相对分子质量34 000处有1条特异的蛋白带,与预期大小一致.Western-blotting检测结果显示,该蛋白可被鼠抗His单克隆抗体及犬抗RV多克隆抗体特异识别,表明所表达的N蛋白具有良好的免疫原性.     

重组狂犬病毒疫苗研究

世界上已有部分国家和地区成功地消灭了狂犬病,但我国每年仍有数千人死于狂犬病。接种狂犬病疫苗是目前防治狂犬病的唯一有效措施。与传统灭活疫苗相比,复制缺陷型重组狂犬病毒被认为是更为安全有效的候选疫苗,可在控制和消除狂犬病中发挥巨大的作用。对复制缺陷型狂犬病毒疫苗研究进展进行了综述。     

狂犬病毒糖蛋白基因的重排及病毒的拯救

为了从分子水平研究狂犬病糖蛋白基因（G）从第4位重排至第1位后病毒的结构、功能及病毒致病性的变化,运用基因突变、反向遗传技术的原理与方法,将狂犬病毒（RV）糖蛋白基因从野生型的第4位（N-P-M-G-L）重排于第1位（G-N-P-M-L）,并成功地拯救已发生基因重排的狂犬病毒．