几种常用植物病原细菌分子检测方法

植物病原细菌(phytobacteria)是植物上一类重要的病原菌,这些细菌能引起多种农作物、经济作物、花卉、树木及牧草上的病害。它的快速检测是病害防治、预测预报及植物检疫必不可少的重要工作。其中,以PCR为基础的分子检测技术的进步使植物病原细菌的检测更快速、灵敏和可靠。本文对近年来植物病原细菌分子检测技术进行介绍,尤其是应用广泛的ITS-PCR(intergenictranscribedspace-PCR)、ARDRA(amplifiedribosomalDNArestric-tionanalysis-PCR)、rep-PCR(repetitiveDNA-PCR)和实时荧光定量PCR(real-timequantitativePCR)技术,旨在促进我国植物病原细菌研究的快速发展。     

利用双重PCR技术快速检测水稻细菌性谷枯病菌

根据水稻细菌性谷枯病ITS和gyrB基因,设计两对特异性PCR检测引物,建立了水稻细菌性谷枯病菌的双重PCR检测方法。用该方法对水稻细菌性谷枯病菌和其它植物源性细菌进行双重PCR扩增及灵敏度测试,并对采自不同地区的水稻样本进行水稻细菌性谷枯病菌的检测。结果显示,双重PCR方法能特异性地检测出8株水稻细菌性谷枯病菌,可从含水稻细菌性谷枯病菌浓度为102cfu/mL的菌液中检测出该病菌;采用该方法对我国不同地区的水稻材料进行检测,并未发现水稻细菌性谷枯病菌。     

基于PCR技术的植物病原真菌检测技术研究进展

植物病原真菌是可以在植物上引起病害的一类重要病原物,对该类病原的快速检测是对其进行植物检疫、监测预报及病害防治必不可少的基础工作.近年来,以PCR为基础的分子检测技术的日益发展使得植物病原真菌的检测更加快速、灵敏和可靠.本文对近年来基于PCR技术的植物病原真菌检测方法进行了介绍与评述,这些方法包括ITS-PCR、巢式PCR、多重PCR、PCR ELISA和实时荧光定量PCR技术.     

植物病原细菌DNA条形码检测技术

植物病原细菌是植物病原菌的重要组成部分,DNA 条形码技术在植物病原细菌的鉴定中应用非常普遍,本文综述了在植物病原细菌鉴定中常用的基因及目前应用的一些数据库,认为在细菌鉴定中比较适用的方法为先通过16S rRNA 基因分析确定到属,然后通过多态性更强的基因或多个基因的联合应用鉴定到种或种下阶元。DNA 条形码技术可以作为常规检测技术的一个强有力补充,提高病原菌鉴定的标准化与速度,尤其对检疫性病原细菌的鉴定具有重要作用。     

应用多重PCR技术同步检测柑橘4种重要嫁接传播病原

 柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV),柑橘碎叶病毒(Citrus tatter\|leaf virus,CTLV),柑橘裂皮病类病毒(Citrus exocortis viroid,CEVd)和柑橘黄龙病(Huanglongbing, HLB)亚洲种病原(Candidatus liberobacter asiaticus)是重要的柑橘嫁接传播病原。本文建立了同时检测HLB病菌、CTV、CEVd 和CTLV 4种柑橘嫁接病原的一步法、双温多重PCR检测技术体系,同时在体系中设置内参基因。应用该体系快速评价了4种嫁接传播病原在田间侵染情况,结果表明28个田间样品CTV、CEVd、CTLV和HLB感染率分别为89.3 %、17.9 %、10.7 %和28.6 %,接近半数样品为混合感染。并且将该方法应用于快速评价茎尖嫁接苗病毒的脱除情况。     

PCR技术检测种传植病细菌研究进展

本文综述了PCR技术在种传植病细菌检测方面近年来的研究进展状况，对各种检测方法进行了比较详细的介绍，着重阐述了种类、原理、灵敏度等方面的研究进展。     

植物病原细菌DNA分子检测技术

在DNA检测技术建立之前,种子上的病菌及未显症的病害的快速检测和鉴定几乎是不可能的.随着DNA检测技术的发展,在隐症植物材料上的病害检测变得快速可靠.本文主要介绍DNA检测技术在植物病原细菌检测中的应用.     

利用PCR技术专化性检测水稻细菌性条斑病菌

 设计水稻细菌性条斑病菌的专化性引物,并建立相应的PCR检测体系,分别对31株水稻细菌性条斑病菌和15株水稻白叶枯病菌及其它相关菌株进行了测试。结果表明,建立的PCR检测体系可专化性检测水稻细菌性条斑病菌,而水稻白叶枯病菌和其它菌株均没有扩增信号。检测灵敏度可以达到20个细菌菌体,从自然发病和人工接种发病的水稻种子成功地检测出条斑病菌。实现了对水稻细菌性条斑病菌的快速和专化性检测。     

马铃薯4种病毒多重PCR检测体系的建立

我国马铃薯病毒主要有马铃薯Y病毒(PVY)、马铃薯X病毒(PVX)、马铃薯S病毒(PVS)、马铃薯卷叶病毒(PLRV),常发生复合侵染。根据GenBank中4种马铃薯病毒的外壳蛋白(coat protein,CP)基因全长设计引物,通过RT-PCR扩增得到4种病毒CP基因全长片段,测序结果显示序列同源性96%以上;针对4种病毒CP基因的保守序列分别设计引物,在一个PCR体系中同步对4种病毒进行扩增,得到421、202、516、330bp的特异性条带,优化建立了能同步检测PVY、PVX、PVS和PLRV的多重RT-PCR检测体系。检测结果证明优化后的多重RT-PCR体系能在田间样品中快速、高效地检测出4种病毒。     

多重PCR检测转基因菜籽粕中的转基因成分

以油菜内源基因PEP、抗除草剂基因(BAR、PAT)、筛选基因NPTII、常见启动子(CaMV35S、FMV35S)和终止子NOS为检测对象,通过研究不同引物终浓度的配比以及退火温度对转基因菜籽粕多重PCR检测的影响,建立了菜籽粕转基因成分7重PCR检测体系。结果表明,本研究所建立的检测体系能有效检测出菜籽粕以及其他作物(大豆、玉米、大米、棉花籽)中的转基因成分,检测过程简便、准确,值得推广应用。     

蚜虫共生细菌多重PCR检测体系的建立

蚜虫中具有多种共生菌,使用常规PCR对它们进行检测,耗时耗力,而多重PCR可以更加高效地进行多种细菌的检测。沃尔巴克氏菌Wolbachia pipientis、杀雄菌属共生菌Arsenophonus和蚜虫U型共生菌Regiella insecticola是蚜虫中常见的3种共生菌。本研究针对沃尔巴克氏菌、杀雄菌属共生菌和蚜虫U型共生菌,分别选择以wsp基因、yaeT基因和gltA基因作为靶标,进行了多重PCR引物的设计和扩增体系的优化。结果显示,本研究建立的多重PCR体系在检测3种蚜虫常见共生菌时,具有较高的扩增特异性、准确性和直观性及较高的检测灵敏度,共生菌的最低检测浓度为104拷贝/μL,远低于共生菌在蚜虫1龄若虫总DNA中的浓度(108拷贝/μL),可以完全满足蚜虫共生菌检测工作的需要。     

A multiplex real-time PCR assay enables simultaneous rapid detection and quantification of bacteria associated with acute oak decline

Acute oak decline (AOD) is a syndrome affecting mature oak trees and is characterized by stem bleeds from vertical fissures on trunks, and inner bark necrosis caused by a polybacterial consortium, in which Gibbsiella quercinecans and Brenneria goodwinii, and to a lesser extent Rahnella victoriana and Lonsdalea britannica, play key roles. Here we report a novel multiplex real-time PCR assay that enables simultaneous and rapid detection and quantification of these four bacterial species from stem bleed swabs. Experiments with axenic cultures were performed to determine specificity and sensitivity of the multiplex quantitative PCR (qPCR). Whilst the primer/probe set for B. goodwinii was species-specific, primer/probe sets for the other three species were able to identify other members of their respective genera. There was no cross detection of genera within the multiplex qPCR, and non-target bacteria were not detected. The multiplex AOD assay had differential sensitivity for each bacterial species. The assay was evaluated on swab samples collected from stem bleeds of declining oak trees at a site in south-east England and was able to detect all four bacterial species. Absolute quantification of the bacteria from swab samples was possible through the inclusion of a standard curve prepared from dilutions of gene copy standards. This diagnostic tool will facilitate rapid detection of AOD-associated bacteria from samples that can easily be taken by non-specialists without specific training, and will also find application in other experimental work such as pathogenicity and control trials.     

基于多重PCR技术的西瓜噬酸菌分组检测方法及其应用

瓜类细菌性果斑病是瓜类作物上重要的种传细菌性病害,其病原菌西瓜噬酸菌Acidovorax citrulli为我国进境植物检疫性有害生物,种子种苗带菌是病害长距离传播的重要来源,种子种苗的快速检测对病害综合防控具有重要的意义。根据寄主的差异西瓜噬酸菌分为两个组,Ⅱ组菌株比Ⅰ组菌株具有更高的铜制剂敏感性,因此,西瓜噬酸菌的分组检测可为病害田间防治中铜制剂的精准使用提供科学依据,避免化学农药的过量施用。本研究筛选了现有的西瓜噬酸菌种间特异性引物和种内分组特异引物,建立并优化了一个多重PCR体系,实现了通过一步试验,就能够准确将西瓜噬酸菌与近缘种和其他植物病原细菌区分开来,并直接鉴定到西瓜噬酸菌不同组。该多重体系可以从带菌种子浸泡液和感病植物组织研磨液中直接检测到西瓜噬酸菌的不同组,且稳定性好,具有应用于生产实践的潜力。     

A PCR diagnostic assay for rapid detection of plant pathogenic pseudomonads

Molecular detection of phytopathogens is increasingly being applied to identify regulated organisms at the border in many parts of the world. However, even with molecular tests, complete phenotyping and identification of a strain is often time consuming and sometimes inconclusive. In this study, a leaf-based pathogenicity test was used to separate pseudomonads into two groups, Group A containing pathogens, and Group B containing saprotrophs. Comparative genomics of 56 pseudomonad genomes from different plant hosts (including 29 strains from kiwifruit) agreed with kiwifruit pathogenicity test results, placing pathogens into Group A and saprotrophs into Group B. Sixteen loci were found unique to Group A. A PCR assay was developed for amplification of one of these loci, the trehalose phosphatase gene. The generation of this 655 bp amplicon was associated with production of water-soaked lesions on inoculated kiwifruit leaves by pseudomonads in Group A. This test was validated for further strains from all seven pathogenic Pseudomonas phylogroups, non-pathogenic pseudomonads, and other bacterial genera. The sensitivity of the PCR was comparable to the limit of recovery of pseudomonads by culturing. This simple PCR assay could be used as part of a testing pipeline at the border and for general surveillance for screening plants with and without symptoms, offering the potential to detect uncharacterized pseudomonads that may pose a biosecurity risk. The method was shown to be able to rapidly identify pathogens cultured from plant material with symptoms, or, more importantly, to detect pathogens directly from plant tissue.     

烟粉虱中甘薯双生病毒(sweepoviruses)半巢式PCR快速检测技术的建立与应用

甘薯双生病毒(sweepoviruses)是侵染甘薯的一类重要病毒,通过烟粉虱以持久方式传播,我国甘薯上至少存在8种甘薯双生病毒.本研究根据我国已报道的8种甘薯双生病毒基因组保守区设计了一组引物,建立了单头烟粉虱中甘薯双生病毒的半巢式PCR快速检测方法.特异性和灵敏性分析结果表明,半巢式PCR具有较高的特异性和灵敏性,...     

4种番茄病毒多重RT-PCR检测及应用

<正>番茄是全世界栽培最为普遍的果菜之一,2011年世界番茄栽培面积约805万亩,年产量约3 773万t,我国是世界番茄种植大国之一,2011年面积96667公顷,产量约679万t,随着番茄种植面积不断扩大,番茄病毒病的危害逐年加重~([1])。世界范围内番茄除了已有的TMV抗病资源与育成的抗     

二重荧光定量PCR检测转基因大豆DAS81419

本文针对大豆内源基因Lectin和转基因大豆DAS81419品系的5′端插入位点序列,设计特异性引物及探针,建立了同时检测转基因大豆DAS81419品系和大豆内源基因Lectin的二重荧光定量PCR方法,运用15种转基因大豆、3种转基因玉米、1种转基因油菜、1种转基因水稻和非转基因大豆对该方法进行了特异性评价,并分析了该方法的灵敏度和稳定性。结果显示,该方法能准确从20种转基因样品和1种非转基因样品中检出靶目标,检测结果与待检样品信息一致,表明本方法具有良好的特异性;灵敏度高达0.01%;并具有良好的重复性。该方法特异性强、灵敏度高、稳定性强,适用于各口岸实验室进行转基因大豆DAS81419的快速、准确的检测。