柑橘病毒与类似病毒分子生物学和抗病毒基因工程研究进展

常见危害柑橘的病毒与类似病毒病有１０余种,我国已报道的有７种。综述了近年来有关柑橘衰退病,碎叶病,温州蜜柑萎缩病,环斑－鳞皮病,裂皮病,黄龙病和枯萎病病原性质和分子生物学研究方面的最新进展。总结了柑橘遗传转化的研究成果以及抗病毒基因工程对柑抗病育种的作用和意义。     

一步法RT-PCR检测柑橘鳞皮病毒

柑橘鳞皮病是一种极具破坏性的柑橘病害,广泛分布于南美及地中海地区。我国目前缺乏对该病害的快速检测技术。以柑橘鳞皮病毒(CPV)的外壳蛋白基因(CPG)为靶标,初步建立了一步法RT-PCR快速检测体系,扩增产物与NCBI数据库中已知CPVCPG的核苷酸序列进行比对,2者序列间同源性超过99%。     

柑橘黄化脉明病毒RT-LAMP检测方法的建立

柑橘黄脉病由柑橘黄化脉明病毒（Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV）引起,是中国近年来新发生的一种柑橘病害。根据CYVCV的外壳蛋白基因序列设计了一组特异性引物,经过一系列条件优化,建立了该病毒的RT-LAMP检测方法。结果显示该方法能特异扩增CYVCV,与其他6种柑橘病原物（柑橘衰退病毒、温州蜜柑萎缩病毒、鳞皮病毒、柑橘裂皮病类病毒、柑橘碎叶病毒和柑橘黄龙病菌）不发生反应;灵敏度为RT-PCR的10倍;田间样品的检出率为63.33%,与RT-PCR的结果一致,适用于田间样品的检测。在产物中加入荧光染料SYBR GreenⅠ直接用肉眼观察就可判断样品是否感染CYVCV,可省去电泳分析的时间。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点。     

柑橘褪绿矮化相关病毒LAMP检测体系的建立

根据GenBank登录的柑橘褪绿矮化相关病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDaV)的移动蛋白(MP)基因序列设计了一组特异性引物,经体系优化,建立了CCDaV的环介导等温核酸扩增(LAMP)检测方法。结果显示该方法能特异扩增CCDaV,与其他5种柑橘病原物(柑橘衰退病毒、柑橘碎叶病毒、柑橘裂皮病类病毒、温州蜜柑萎缩病毒和柑橘黄龙病菌)不发生反应;灵敏度为PCR的100倍,与实时荧光PCR的灵敏度相同。用LAMP方法对50个田间样品进行检测,与PCR和实时荧光PCR的检测结果一致,证明该方法可用于田间样品的检测。该LAMP检测方法可特异、灵敏、快速地对CCDaV样品进行检测。     

迟熟蕉柑茎尖嫁接及其病毒鉴定

采用田间结果树上的芽作为接穗进行茎尖嫁接,最终获得7株茎尖嫁接苗。对所获得的茎尖嫁接苗,应用指示植物腊斯克枳橙、墨西哥来檬和伊特洛格香橼亚利桑那861-S-1分别鉴定柑橘碎叶病、衰退病和裂皮病,用PCR检测技术鉴定柑桔黄龙病。结果表明：1、3、4、5、6号迟熟蕉柑单株不带碎叶病、衰退病、裂皮病和黄龙病,可用作繁殖无病毒苗木的备选材料。     

柑橘碎叶病毒研究进展

起源于我国的柑橘碎叶病是严重危害柑橘的一种重要柑橘病毒病,国内外关于柑橘碎叶病毒的研究对于控制该病害起到了重要的作用。概述了国内外关于柑橘碎叶病毒的生物学、分子生物学、病毒的株系和控制方面的研究进展,尤其是对近些年用分子生物学方法研究病毒的基因组和株系序列差异方面的情况作了详细的介绍。并对柑橘碎叶病毒研究仍未解决的问题和进一步深入研究的内容进行了分析探讨。     

我国柑橘近年新发生的病毒及类似病害研究进展

柑橘病毒类病害是由病毒、类病毒引起的严重危害世界柑橘产业的病害。随着柑橘产业的发展,新的柑橘病毒类病害不断出现,柑橘病毒类病害的危害也日趋严重。笔者对柑橘黄脉病、柑橘褪绿矮缩病、柑橘叶斑驳病、柑橘树皮裂纹类病毒、柑橘类病毒V和柑橘类病毒VI 6种我国近年来新发柑橘病毒类病害的发生分布、生物学特性和分子生物学特性进行总结,并对新发柑橘病毒类病害的检测和防治方法进行阐述,以期为我国柑橘产业的健康可持续发展提供借鉴。     

柑橘衰退病毒弱毒株筛选方法研究进展

柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)引起的衰退病是一种严重危害世界柑橘产业的病毒病害。随着我国柑橘产业的发展,柑橘衰退病的危害也日趋严重。目前交叉保护技术是防治柑橘衰退病最有效的手段。现有研究表明,由于CTV存在复杂的株系分化现象,导致弱毒株筛选仍存在诸多困难。对运用生物学方法、血清学检测以及分子生物学技术鉴定CTV弱毒株的最新研究进展予以综述,同时就现有交叉保护防治技术的不足和解决途径进行讨论和展望,旨在为更好地防治柑橘衰退病提供借鉴。     

我国柑橘近年新发生的病毒及类似病害研究进展北大核心CSCD

柑橘病毒类病害是由病毒、类病毒引起的严重危害世界柑橘产业的病害。随着柑橘产业的发展,新的柑橘病毒类病害不断出现,柑橘病毒类病害的危害也日趋严重。笔者对柑橘黄脉病、柑橘褪绿矮缩病、柑橘叶斑驳病、柑橘树皮裂纹类病毒、柑橘类病毒V和柑橘类病毒VI 6种我国近年来新发柑橘病毒类病害的发生分布、生物学特性和分子生物学特性进行总结,并对新发柑橘病毒类病害的检测和防治方法进行阐述,以期为我国柑橘产业的健康可持续发展提供借鉴。     

运用实时荧光RT-PCR技术检测柑橘碎叶病毒

柑橘碎叶病是由橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)引起的一种重要的柑橘病害,为更快、更准确的检测CTLV,合成了一对特异性引物ASG-Pf和ASG-Pr,建立了运用SYBRGreenI荧光染料法检测CTLV的实时荧光RT-PCR体系,并对该体系的特异性、灵敏性和适用性进行了测试。结果表明,该检测体系能特异的检出CTLV,对测试的衰退病毒、温州蜜柑萎缩病毒和鳞皮病毒都不能检出;灵敏度比常规PCR高100倍;适用性广,可检测出多种柑橘类植物中的CTLV。实时荧光RT-PCR检测整个过程完全闭管,无需PCR后处理,且SYBR GreenI荧光染料成本较低,适用于检测柑橘体内含量较低的CTLV病毒。     

柑橘衰退病晚期抑制差减cDNA文库的构建及初步分析

为了研究柑橘衰退病晚期应答的分子机理,利用经典的抑制差减杂交技术,以感染柑橘衰退病3年后的‘不知火’杂柑实生苗叶片组织的c DNA为测试方,以脱毒的‘不知火’实生苗叶片组织的c DNA为驱动方进行差减杂交,构建了柑橘衰退病诱导的正向抑制差减c DNA文库。随机挑取此文库中210个阳性克隆进行测序,获得了192条有效序列。将这些EST序列聚类拼接后,共获得77条非重复序列。对这些EST进行GO和KEGG分析,发现这些EST的功能主要与胁迫及防御、代谢、转录、转运、蛋白命运等途径相关。用实时定量RT-PCR验证了其中4个基因:几丁质酶基因、茉莉酸响应基因的转录抑制因子1基因(JAZ1)、钙调素结合蛋白基因、咖啡酸—氧甲基转移酶基因,结果表明在衰退病的诱导下,‘不知火’杂柑叶片中这4个基因的表达量均有明显提高,说明这些基因可能参与了‘不知火’杂柑叶片晚期衰退病应答。JAZ1基因的上调表达表明可能宿主衰退病晚期应答过程中的诱导系统抗性受到了抑制。     

柑橘病毒类病害诊断技术研究进展

柑橘病毒类病害对世界柑橘产业造成了严重的损失。诊断技术是防控柑橘病毒类病害的重要保障。对指示植物鉴定、电镜技术、血清学方法、核酸杂交、（RT-）PCR以及新近出现的环介导恒温扩增、基因芯片和高通量测序等技术在柑橘病毒类病害诊断中所取得的进展进行综述,并对今后的发展方向进行了展望,旨在为更好地防治柑橘病毒类病害提供借鉴。     

盐酸吗啉呱对番茄病毒病的药效试验

番茄病毒病是番茄上的一种主要病害,每年引起番茄大量减产,严重的甚至绝收。通过对番茄病毒病防治的长期研究,其结果表明,用盐酸吗啉呱和病毒A、微量元素配成复配剂对番茄病毒病的防治效果较好。     

柑橘黄龙病、裂皮病和衰退病病原的多重RT-PCR检测

 建立了一种同时检测柑橘黄龙病病原类细菌(Candidatus L iberibacter asiaticus, HLB) 、柑橘裂皮类病毒(Citrus exocortis viroid, CEVd) 、柑橘衰退病病毒(Citrus tristeza virus, CTV) 的多重RT-PCR技术体系。运用根据3 种病原核苷酸保守区序列设计的特异性引物, 成功的对同一样品中的HLB、CEVd、CTV进行多重RT2PCR扩增, 得到1 160 bp、371 bp、273 bp 3条特异性大小与试验设计相符的条带。就影响多重PCR 的主要因素引物浓度和退火温度进行了一系列优化, 建立了能同时检测HLB、CEVd、CTV的多重RT2PCR技术体系。该体系最低能从10 pg总RNA中检测出黄龙病类细菌和柑橘裂皮类病毒, 从1 pg总RNA中检测到柑橘衰退病毒。对采自田间37份材料的实际检测表明: 存在两种或3种病原的复合侵染。     

湖北广水萝卜病毒病的分子鉴定与防治

病毒病是萝卜生产上的主要病害之一,在湖北广水地区大面积发生,为有效防治萝卜病毒病,提高农民经济效益,对湖北广水地区萝卜花叶病毒病进行了调查和病毒种类的鉴定,并提出了具体的防治措施,即选择抗病萝卜品种、适期晚播、避免连作、加强苗期管理和药剂防治相结合。     

萝卜病毒病小RNA 分析及资源抗性表现

病毒病是为害萝卜的主要病害之一。基于核酸检测的植物病毒病检测技术，因其检测范围广、灵敏度高、适合大批 量检测而得以广泛应用。本试验利用小RNA 高通量测序方法鉴定萝卜病毒病的种类，并调查分析了264 份萝卜核心种质资 源及育种品系对病毒病的抗性。结果表明：萝卜病毒病的主要病原为芜菁花叶病毒（TuMV）。参试的核心种质资源和品系 多数表现出较好的抗性，且不同品系姊妹系间抗性表现基本趋于一致。田间抗病性调查结果显示：抗病材料有103 份，高抗 材料有64 份，且有25 份材料达到免疫。     

柑橘黄化脉明病毒的TGB基因生物信息学分析及亚细胞定位

柑橘黄化脉明病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)是一种正义单链RNA病毒。其基因组含有6个开放阅读框(ORF),其中ORF2、ORF3和ORF4组成了三基因连锁结构(triple gene block,TGB)。以感染CYVCV的尤力克柠檬[Citrus limon(L.)Burm.f.]植株的总RNA为模板,扩增和克隆了CYVCV的TGB基因,并开展了其编码蛋白的理化性质和分子特性等生物信息学分析;进而通过In-Fusion~?技术构建了TGB各基因的亚细胞定位载体,经农杆菌介导转化洋葱表皮细胞并在荧光显微镜下进行亚细胞定位观察。生物信息学分析结果表明,CYVCV-TGB具有与Potexvirus属病毒TGB相似的理化性质和分子特性,可能参与病毒在寄主中的运动且需要外壳蛋白的参与。亚细胞定位结果显示,TGBp1定位于细胞壁(膜)上,TGBp2和TGBp3主要定位于细胞壁(膜),少量呈星点状定位于细胞内。研究结果为揭示CYVCV在寄主中的运动机理奠定了基础。