植物基因工程的新方向—叶绿体基因工程

叶绿体(质体)基因转化技术由于其独特的优越性,已开始成为植物基因工程中新的研究热点。本文就目前叶绿体基因工程进展及其应用作一简单的综述,涉及转化载体的构建、遗传转化系统、转化子的同质化和叶绿体基因工程的应用。     

水稻叶绿体基因组定点表达载体的构建及增强型绿色荧光蛋白原核表达分析

分别克隆了水稻叶绿体基因组同源重组片段trnI和trnA、具有3种不同核糖体结合位点(RBS)序列的增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)、来自烟草叶绿体的16S rRNA基因启动子Prrn和psbA基因终止子TpsbA,将上述元件通过酶切位点依次连接到质粒pUC19上,构建了3种能编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的水稻叶绿体基因组定点整合表达载体pIA - EGFP1、pIA - EGFP2和pIA - EGFP3.进行分子检测验证后,对上述载体进行了大肠杆菌EGFP原核表达检测,结果携带来源于λ噬菌体T7基因10的5′端非翻译区的载体pIA - EGFP3荧光最强,适合用于水稻叶绿体转化.     

低温条件下小麦叶绿体基因启动子甲基化的变化

为建立小麦叶绿体基因启动子甲基化的检测体系,检测低温胁迫下小麦叶绿体编码基因甲基化的变化规律并分析叶绿体编码基因表达的调控模式,以低温敏感型小麦返白系及其对照矮变1号为材料,选取4个在低温条件下两个材料间表达有差异的叶绿体基因petN、trnC、petD和rrn16S,通过亚硫酸盐测序法(BSP-seq)分别测定低温处理后这些基因(TaMET1,TaDRM和TaCMT)启动子的甲基化率,并用qPCR的方法对这4个基因以及预测定位于叶绿体的三个DNA甲基转移酶基因进行表达量检测。结果显示,叶绿体基因组总的甲基化水平在低温条件下持续增加,基因间启动子甲基化水平变化并不完全一致,基因型之间也略有差异。4个基因的表达量与甲基化水平的相关性不同,petN的表达对甲基化比较敏感,低温诱导甲基化率增加,基因的表达量则下调,但其余3个基因的表达与甲基化率的变化无直接相关性。返白系中三个DNA甲基转移酶基因的表达在低温条件下都呈上调趋势,但矮变1号中的TaMET1与TaCMT基因表达下调。结果为深入研究低温下小麦叶绿体基因甲基化的变化规律及其对叶绿体基因的调控机理奠定了基础。     

3个木薯品种的叶绿体基因组16S rRNA-23S rRNA基因间隔序列的特征分析

以华南6、8、10号木薯为材料,通过PCR克隆3个木薯品种的叶绿体16S-23S基因间隔序列,与其他17种植物的该序列进行亲缘关系分析。从进化树可以看出,该序列进化分析符合Webster分类系统,同科植物可以很好的聚为1类。此外,3个木薯品种的16S-23S基因间隔序列相似性高达99.94%;大戟科间的序列相似性为97.52%;其他植物科内的序列相似性不低于96%。该研究还分析了3个木薯品种16S-23S基因间隔序列的基因分布,该序列的基因分布情况一致,包含16S rRNA 5′端,trnI基因,ycf68基因,trnA基因,23SrRNA3′端,ISR-B,发现该序列的保守性较强,个别碱基差异并不影响基因分布,该研究可为后期木薯叶绿体遗传转化体系建立提供理论依据。     

NPTII标记转基因棉花再生株的延其筛选

新霉素磷酸转移酶(Neomycin Phosphotransferase Ⅱ,NPTⅡ)基因是迄今植物遗传转化中应用最为广泛的选择标记.该基因编码新霉素磷酸转移酶亦称氨基糖苷-3＇-磷酸转移酶(aminoglycoside-3'-phosphotransferase Ⅱ),其编码产物可使氨基糖苷类抗生素(aminoglycoside angibi-otics)如卡那霉素(kanamycin,Km)、新霉素(neomycin)、G418等磷酸化而失活.卡那霉素等氨基糖苷类抗生素能与植物细胞叶绿体和线粒体中的核糖体30S小亚基相结合,影响70S起始复合物的形成,干扰叶绿体及线粒体的蛋白质合成,从而导致植物细胞死亡.     

小麦属植物叶绿体基因组结构的比较分析

为了从叶绿体角度解析小麦属植物的起源进化关系,以14个小麦属植物叶绿体基因组为对象,利用比较基因组分析方法,比较了小麦属植物的叶绿体基因组基因含量、序列变异、结构特性、进化关系和RNA编辑的异同。结果发现,14个小麦属植物叶绿体基因组大小相近,结构特征比较保守,但基因数量存在一定的差异,主要是由于tRNA的数目不一致引起的;IR区的伸缩分析发现硬粒小麦和乌拉尔图小麦在IRb-SSC边界基因存在明显的差异,其他麦类作物间差异很小;基于叶绿体全基因组的系统进化分析发现,有AABB基因型的物种聚在一起,而AAGG型的单独为一支,基本反映了其系统进化关系;对这14个叶绿体基因组的RNA编辑位点进行了预测和比较分析,发现有35个编辑位点在所有小麦属物种中均发生,同时还鉴定到多个物种特异的编辑位点,为从RNA编辑角度解析小麦属植物的系统进化关系提供了重要数据。     

大豆rbcL基因克隆、序列分析及原核表达

利用叶绿体基因组保守性的特征,根据菜豆、豌豆、烟草的rbcL基因序列设计引物,从大豆叶绿体DNA中克隆rbcL基因,全长序列为1488bp,包括1449bp的开放阅读框,编码482个氨基酸。相似性比较显示,此序列与其它10个物种rbcL基因核苷酸的同源性为85.37%～95.31%,氨基酸的同源性为90.87%～96.47%。将该基因与表达载体pET-30a（+）连接,转化大肠杆菌Rosseta感受态细胞,PCR和酶切鉴定筛选阳性克隆,阳性菌液IPTG诱导后经10%SDS-PAGE分析,结果显示：诱导表达出分子量约为60kD的特异融合蛋白。     

甜菜叶绿体基因组研究概况

确证植物叶绿体中存在遗传物质DNA(一般称CtDNA)及其相应基因表达系统的时间是本世纪六十年代(4、21),从此证实了早在本世纪初Correns等人根据某些影响叶绿体发育的因子的非孟德尔遗传方式所得的叶绿体中可能存在某些特殊的遗传因子的推论。以后的二十年间,叶绿体基因的研究如雨后春笋,不仅建立了从叶绿体中有效地分离和纯化ctDNA的方法,且对于它的一系列性状(包括理化性质、大小、基因定位等)和相应的遗传特性(如与细胞质雄不育的关系)进行了比较深入的研究。     

甜菜叶绿体中小分子DNA的发现

八十年代以来,由于分子遗传学的迅速发展,甜菜叶绿体DNA的组织结构及其功能的研究逐步受到人们的重视,先后有美国、日本等国的科学家研究甜菜叶绿体基因组的结构及其遗传特性,并且已经确定了甜菜叶绿体DNA的分子大小及其部分编码的蛋白质的基因定位。对于叶绿体DNA与甜莱的一些遗传性状的关系也进行初步的揭示。然而,叶绿体中小分子DNA的存在尚未有人报道。     

一年蓬叶绿体基因组特征及系统进化分析

一年蓬（Erigeron annuus）作为一种入侵植物，对我国农林业发展、本地物种多样性及生态系统具有严重的影响。本研究利用Illumina NovaSeq 6000测定一年蓬的DNA序列，采用SPAdes v3.10.1软件组装一年蓬叶绿体基因组，以小蓬草（Erigeron canadensis, MT806101.1）叶绿体基因组为参考，对一年蓬叶绿体基因组结构、特征、SSR位点、IR边界以及进化树进行分析，结果表明：一年蓬叶绿体基因组全长为153 283 bp,AT、GC含量分别为62.95%、37.05%。包括大单拷贝区（LSC）84 833 bp，小单拷贝区（SSC）18 412 bp，反向重复区（IRa和IRb）25 019 bp，一年蓬叶绿体基因组共编码到132个基因，包括蛋白编码基因88个，转运RNA基因36个，核糖体RNA基因8个。按照功能分类将它们分成四大类：光合作用相关基因共45个、自我复制相关基因共73个、其他基因共6个、未知功能基因共8个。在一年蓬叶绿体基因组中共查找200个符合条件的SSR位点，分布在LSC、SSC、IR区域的SSR数量分别为126、40、...     

粗山羊草叶绿体基因RNA编辑位点的鉴定与分析

RNA编辑是高等植物叶绿体基因转录后表达调控的一种重要方式。本研究利用生物信息学方法,预测出粗山羊草叶绿体基因组分布于15个蛋白编码基因的34个RNA编辑位点,均为C到U的转换,其中以ndhB最多,有9个编辑位点。通过与数据库中EST和高通量测序数据(SRA)进行比对分析,检测到分布于20个基因的29个编辑位点。综合上述研究结果,最终确定分布于9个基因的10个RNA编辑位点是真实存在的。分析这些位点RNA编辑现象对蛋白质结构的影响,发现ndhB编辑后β-折叠数增加,跨膜结构增加。这是首次有关粗山羊草叶绿体蛋白编码基因RNA编辑位点的报道。与禾本科水稻、玉米、大麦、黑麦和甘蔗的叶绿体RNA编辑位点进行比较,表明粗山羊草与黑麦、大麦的亲缘关系较近。本研究结果可为解析粗山羊草叶绿体基因的表达调控和探讨禾本科物种的起源进化提供理论依据。     

肿瘤坏死因子α单链抗体基因的优化及衣藻叶绿体表达载体的构建

通过在EMBL数据库中搜索鼠源TNF-α单链抗体基因同源性最高的人胚系抗体基因TNF-α-ScFv,进行人源化改造,并选择衣藻叶绿体偏爱的密码子对TNF-α-ScFv基因进行优化,随后构建带psbA启动子：TNF-α-ScFv：：psbA 3′终止子表达框的中间载体,再将psbA启动子：TNF-α-ScFv：：psbA 3′终止子表达框插入衣藻叶绿体表达载体p322中,通过PCR和酶切鉴定,确定已成功构建了TNF-α-ScFv基因的衣藻叶绿体表达载体。     

水稻白条纹突变体st13的表型分析及基因定位

【目的】叶色突变相关基因鉴定和克隆有助于研究光合作用,补充并完善叶绿体发育机理和色素合成代谢途径,为开展水稻的高光效育种提供理论依据。【方法】从粳稻品种Dongjin的组培后代中分离出一个白条纹突变体st13,成熟期测定野生型和st13的主要农艺性状,苗期测定色素含量并观察叶绿体的超微结构;将st13和Dongjin进行正反交,观察F_1植株表型,并对F_2表型分离进行卡方检验,对st13进行遗传分析;利用st13×南京11(籼稻品种)的F_2和F_(2:3)群体,对st13突变基因定位;采用qPCR分析叶绿体发育和叶绿素合成相关基因在st13与野生型相对表达量。【结果】与野生型Dongjin相比,该突变体的株高、单株有效穗数、穗长、结实率和千粒重等主要农艺性状显著下降。苗期的色素含量降低,分蘖期无差异。突变体的叶绿体中既有含丰富的类囊体膜结构的正常叶绿体,也存在无类囊体结构的叶绿体。遗传分析和基因定位结果表明,st13的突变表型受1对隐性核基因控制,突变基因位于第3条染色体长臂InDel(Insertion-Deletion)标记I3-21和I3-22之间。进一步在这两个标记之间设计了6对InDel标记,最终将基因定位在94kb区间内,此区间共有8个候选基因。【结论】这8个候选基因中,有5个假定的蛋白,其他三个都是有功能注释的蛋白,而这三个蛋白在水稻中均未见报道,因此,st13突变是由一个新的叶色基因突变引起的;同时st13中叶绿体发育、叶绿素合成和光合系统相关基因的表达也发生了显著改变,推测ST13可能是调控叶绿体发育的关键基因。     

青稞叶绿体基因RNA编辑位点的预测、鉴定与比较分析

为了阐明青稞叶绿体基因组RNA编辑位点的组成与特性,首先利用生物信息工具对青稞叶绿体基因的RNA编辑位点进行了预测,结果发现了35个分布于15个基因的编辑位点,所有编辑均为C到U的转换,其中基因ndhB包含的编辑位点数量最多,达9个,这与其他麦类作物相似;进一步利用RT-PCR结合克隆测序,对预测的35个位点进行了实验验证,发现18个编辑位点被证实发生了C到U的编辑;对编辑前后编码蛋白质的结构进行了比较分析,发现RNA编辑引起了编码蛋白的结构变化,暗示RNA编辑可以造成编码蛋白功能的改变。最后,将青稞叶绿体基因RNA编辑位点与栽培大麦、野生大麦的叶绿体RNA编辑位点进行了比较,发现青稞与栽培大麦的RNA编辑组成完全一样,而野生大麦缺失了 ndhA-563位点,初步印证了大麦的起源进化关系。     

一个水稻低温移栽白条纹突变体wltt的鉴定和基因定位

【目的】叶色突变相关基因的鉴定与克隆为研究叶绿体发育、叶绿素合成和光合作用等分子机制提供理论基础。【方法】从常规粳稻镇糯19杂交后代中分离出一个低温移栽后叶色转成白条纹的自然变异突变体,命名为wltt (white stripe leaf after transplanting at low temperature)。成熟期测定野生型和wltt的主要农艺性状,分别在苗期、移栽后15 d和同时期直播条件下测定新生叶片的色素含量并观察叶绿体的超微结构;将wltt和野生型正反交进行遗传分析;用wltt与籼稻9311杂交产生的F_2作为定位群体进行基因定位;采用RT-qPCR分析叶绿体发育、叶绿素合成和光合作用相关基因在野生型和wltt中的表达水平。【结果】wltt突变体在苗期表现正常绿色,移栽15 d后心叶出现白条纹叶表型,至分蘖末期心叶叶色恢复;而不经移栽,突变体不会出现白条纹叶。人工模拟实验表明该表型是由低温条件下根损伤引起的。与野生型相比,wltt突变体移栽后的新生叶色素含量显著降低,光合速率下降;同时株高变矮,穗长、剑叶长和每穗粒数均显著降低。叶绿体的超微结构显示,突变体的叶肉细胞中,仅少数细胞含有正常的叶绿体,其余大部分叶肉细胞不含叶绿体。进一步研究发现,突变体中部分光合系统相关基因和叶绿体发育相关基因表达下调,叶绿素生物合成相关的14个基因表达也下调。遗传分析表明,该突变性状受一对隐性核基因控制。利用wltt突变体/9311的F_2群体,将该基因定位于水稻第2染色体着丝粒附近853kb区间内。目前,该区间内没有叶色相关基因的报道。【结论】WLTT是低温条件下移栽调控叶片转色的关键基因,在叶绿体发育过程中发挥重要作用。     

野生二粒小麦叶绿体基因RNA编辑位点的预测、鉴定与分析

RNA编辑是高等植物叶绿体基因转录后表达调控的一种重要方式。为了解野生二粒小麦叶绿体基因RNA编辑的组成及其与其他麦类作物的异同,通过生物信息学预测结合RT-PCR的方法,对野生二粒小麦叶绿体基因的RNA编辑位点进行了预测和鉴定。生物信息学预测共发现了分布于15个基因上的35个编辑位点,均为C到U的转换,其中ndhB基因包含的编辑位点数量最多,达9个;在此基础上,随机选取5个基因对其编辑位点进行了测序验证,结果共鉴定了18个C→U的编辑位点;进一步对编辑后编码蛋白的二级结构和跨膜结构域进行了预测,发现编辑后所有基因均发生了二级结构的改变,但只有ndhB基因的跨膜结构域发生了改变;最后,将确定的野生二粒小麦叶绿体基因RNA编辑位点与7个禾本科物种的RNA编辑位点进行比较,共发现17个编辑位点在这些种间具有保守性,相比于其他物种,野生二粒小麦与普通小麦和粗山羊草具有更相似的编辑位点组成。     

菠萝叶绿体基因组密码子偏好性分析

叶绿体基因组密码子偏好性影响基因的表达效率,对于叶绿体基因工程应用及物种遗传改良具有重要的科学意义.为了明确菠萝叶绿体基因组密码子偏好性的使用特征及主要影响因素,本研究以菠萝叶绿体基因组为研究对象,利用生物信息学软件分析其密码子的使用模式和偏好性.密码子偏好性相关参数分析显示:(1)菠萝叶绿体基因密码子的GC含量平均值...     

玉米叶肉原生质体瞬时表达系统建立与优化

以玉米B73黄化苗叶片为研究材料，采用酶解法分离并获得高活性的玉米叶肉原生质体细胞，优化PEG-Ca²⁺介导的玉米叶肉原生质体细胞转化条件，探索电击介导玉米叶肉原生质体细胞瞬时转化方法。同时，以荧光蛋白为报告分子融合细胞器定位信号，建立玉米叶肉原生质体亚细胞定位系统，进一步验证该瞬时表达系统具备可用于基因功能研究的可能性。结果表明，通过酶解法分离获得的玉米叶肉原生质体细胞经过FDA染色统计发现，95%的细胞结构完整且活力较高。在PEG-Ca²⁺介导瞬时转化方法中，当PEG浓度40%且质粒量增加至25 μg时转化效率达到最高，为51.28%。在电击介导瞬时转化方法中，当电压为350 V且电击时间为5 ms的条件下电击转化效率最高，为32.66%。通过将核定位信号NLS与eGFP基因融合转入玉米叶肉原生质体细胞，eGFP成功定位于细胞核。通过将叶绿体定位基因ZmMSH1与DsRed2基因融合并转入，DsRed2蛋白成功定位于叶绿体中。在玉米叶肉原生质体细胞中过表达ZmDHDPS基因，通过qRT-PCR和Western Blot等技术确定了ZmDHDPS高表达活性，并显著提高原生质体细胞内游离赖氨酸含量。