牦牛外周血单个核细胞抑制消减cDNA文库的构建及部分差异表达分子的克隆分析

为筛选牦牛外周血单核细胞(PBMC)差异性基因,以刀豆素A(ConA)和脂多糖(LPS)联合刺激的PBMC cDNA为实验组,未经诱导刺激的PBMC cDNA为驱动组,利用抑制性消减杂交技术(SSH)构建了丝裂原诱导刺激PBMC的消减文库并对其部分阳性克隆进行了EST序列分析.从消减文库中随机挑取16个阳性克隆,进行PCR鉴定,显示克隆的重组率大于93%,插入片段大小大部分集中在200 bp～1 000 bp之间.随机挑取100个克隆进行测序及同源性分析,初步获得27条差异表达基因片段,其中24个为已知基因,3个为新ESTs序列;随机选择非重复的6个差异表达的序列设计引物,以半定量PCR方法验证其消减效率.结果显示,均从构建的消减文库中扩增到目的片段,其中5个为诱导性差异表达分子,1个为诱导特异性表达分子,说明该文库有较高的质量.本研究应用抑制消减杂交技术构建了牦牛PBMC的差异表达cDNA文库,并高通量克隆鉴定了相关功能基因片段,表明该技术手段有助于快速发现牦牛新功能基因.     

牛多杀性巴氏杆菌诱导家蝇幼虫抑制性消减文库的构建

采用牛多杀性巴氏杆菌针刺法诱导3日龄家蝇幼虫,提取诱导后的家蝇幼虫总RNA并分离纯化得到高质量的mRNA.运用抑制性消减杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建家蝇幼虫差异表达的cD-NA消减文库,并利用反向Northern杂交技术筛选差异表达基因.结果表明,随机挑取的阳性克隆片段大小均在200～750 bp,通过反向Northern杂交共筛选出183个差异表达基因,经BLAST比对分析后鉴定出大量与家蝇免疫防御功能相关的基因和一部分无同源性基因.     

发情期湖羊卵巢组织差异表达基因的筛选与分析

为了筛选与湖羊发情相关的候选功能基因,试验以发情期湖羊卵巢组织cDNA为试验组,乏情期的湖羊卵巢组织cDNA为对照组,采用抑制性消减杂交(SSH)技术构建湖羊卵巢组织消减cDNA文库,并对筛选获得的功能基因进行生物信息学分析。结果表明:应用SSH技术成功构建了湖羊发情期卵巢组织消减cDNA文库;共挑取89个克隆进行测序分析,获得27个已知物种的同源基因序列和3个Novel序列;随机挑取16个阳性克隆进行PCR扩增,插入片段主要分布在150~750 bp之间;对27个已知同源基因进行功能分类,其中酶功能相关基因5个、核糖核酸结合功能相关基因10个、载体运输功能相关基因2个、调节功能相关基因3个、转运功能相关基因3个、未分类基因4个。说明试验成功筛选获得湖羊发情相关候选功能基因。     

猪肺炎支原体诱导家蝇幼虫抑制性消减文库的构建

采用抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)构建猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumonia,Mhp)诱导家蝇幼虫后产生差异表达基因的消减cDNA文库,并利用反向Northern杂交技术获得差异基因.结果表明,随机挑取的阳性克隆的大小均为200～750 bp,通过斑点杂交技术共筛选出186个差异基因片段,对其克隆、测序及同源性分析后鉴定出20种编码蛋白的基因片段和21个无同源序列.家蝇幼虫经猪肺炎支原体诱导后产生与抗病原体相关的基因及大量的未知基因.     

高繁殖力黄淮山羊大卵泡颗粒细胞上调表达基因的研究

旨在对山羊卵巢有腔卵泡发育中基因表达特点进行研究。本研究应用抑制消减杂交技术(SSH)对黄淮山羊卵泡期卵巢非闭锁大卵泡(6 mm)和小卵泡(4 mm)颗粒细胞内差异表达基因进行了研究,建立了消减cDNA文库,通过斑点杂交分析,从正向文库中随机挑取96个克隆进行差异表达的筛选,结果发现,其中有8个与已知功能基因高度相似,12个全新的表达序列标签(EST)。结果显示,这些基因可能影响着山羊卵泡的发育成熟和排卵。     

抑制性消减杂交技术在对虾基因克隆中的应用

抑制性消减杂交技术是一项筛选、分离未知差异表达基因的试验方法,该技术具有快速、简便、灵敏、特异、高效,所需起始样本量较少等优点。利用该技术构建对虾组织消减cDNA文库,鉴定差异表达相关基因及其表达特性。通过对对虾差异性表达的免疫相关基因、抗病基因及其他性状基因的了解,旨在为进一步研究对虾抗病机理奠定基础,为利用抗病基因进行抗病育种提供一个有效途径,为提高对虾的经济效益提供前景。     

猪胸膜肺炎放线杆菌血清7型抑制消减杂交文库的构建和分析

为了研究猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（APP）不同血清型之间的差异表达基因,采用抑制消减杂交（SSH）法,以APP血清7型DNA作为测试方（Tester）、APP血清1型DNA作为驱动方（Driver）,进行2轮杂交和2轮选择PCR扩增,将PCR扩增产物连接pMD18-T载体,筛选阳性克隆后进行测序和序列比对.结果显示,15个阳性克隆中的13个为已知序列,其同源性为88%～100%,2个为未知序列,其结构和功能还需进一步研究.首次构建了APP7的抑制消减杂交文库,为APP感染和致病机制的研究奠定了基础.     

猪蛔虫感染期幼虫抑制消减cDNA文库的构建

为筛选与线虫感染性相关的基因,本研究以猪蛔虫为对象,构建猪蛔虫感染期幼虫差异表达消减cDNA文库,为研究线虫期特异性发育的分子机制奠定基础。分别提取感染期幼虫和其它各期幼虫及成虫的总RNA,纯化mRNA后,采用Clontech公司PCR-selectTM试剂盒进行反转录合成cDNA并进行抑制消减杂交(SSH),构建猪蛔虫感染期幼虫差异表达的消减cDNA文库,并采用Southern斑点杂交进行消减效率的检测。随机从文库中抽取45个克隆进行测序及在线BLAST分析。试验结果表明,感染期幼虫差异表达的消减cDNA文库具有较强的特异性;在得到的41个表达序列标签(ESTs)中,有40个ESTs与已报道的基因有较高的相似性,主要代表猪蛔虫第三期幼虫基因和成虫头部基因,有1个cDNA片段可能代表新基因。猪蛔虫感染期幼虫差异表达消减cDNA文库的成功构建,为进一步研究幼虫发育差异表达基因的功能奠定了基础。     

紫茎泽兰处理鸡柔嫩艾美耳球虫后差异基因筛选和分析

为获得紫茎泽兰处理鸡柔嫩艾美耳球虫后差异基因,将0.5%紫茎泽兰提取液作用于鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊孢子化过程,采用抑制消减杂交技术（SSH）筛选处理后卵囊的差异表达基因,通过GO和COG功能预测分析,并采用实时荧光定量PCR验证差异表达的基因。结果显示,采用SSH成功构建了紫茎泽兰处理前后鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊的cDNA消减文库,获得86条ESTs序列,经拼接和聚类后得到31条独立基因（Unigenes）,其中有23个基因有功能注释,8个基因没有功能注释,另外有4个基因没有同源性匹配。为进一步验证文库的特异性,从中随机选取3个差异表达基因,运用实时荧光定量PCR技术验证表面抗原13、3-羟酰辅酶A脱氢酶和细胞色素P450基因在紫茎泽兰处理前后的表达差异,结果显示,3个基因在经紫茎泽兰处理的鸡球虫孢子化卵囊中的表达量明显低于未处理组,说明紫茎泽兰对柔嫩艾美耳球虫卵囊具有一定的活性抑制作用。本试验获取了紫茎泽兰作用柔嫩艾美耳球虫卵囊的主要调控基因,为将紫茎泽兰研发成环境杀虫剂奠定了良好的理论基础,也可为球虫致弱疫苗或基因缺失疫苗的靶标筛选研究提供参考。     

紫茎泽兰处理鸡柔嫩艾美耳球虫后差异基因筛选和分析

为获得紫茎泽兰处理鸡柔嫩艾美耳球虫后差异基因,将0.5%紫茎泽兰提取液作用于鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊孢子化过程,采用抑制消减杂交技术(SSH)筛选处理后卵囊的差异表达基因,通过GO和COG功能预测分析,并采用实时荧光定量PCR验证差异表达的基因。结果显示,采用SSH成功构建了紫茎泽兰处理前后鸡柔嫩艾美耳球虫卵囊的cDNA消减文库,获得86条ESTs序列,经拼接和聚类后得到31条独立基因(Unigenes),其中有23个基因有功能注释,8个基因没有功能注释,另外有4个基因没有同源性匹配。为进一步验证文库的特异性,从中随机选取3个差异表达基因,运用实时荧光定量PCR技术验证表面抗原13、3-羟酰辅酶A脱氢酶和细胞色素P450基因在紫茎泽兰处理前后的表达差异,结果显示,3个基因在经紫茎泽兰处理的鸡球虫孢子化卵囊中的表达量明显低于未处理组,说明紫茎泽兰对柔嫩艾美耳球虫卵囊具有一定的活性抑制作用。本试验获取了紫茎泽兰作用柔嫩艾美耳球虫卵囊的主要调控基因,为将紫茎泽兰研发成环境杀虫剂奠定了良好的理论基础,也可为球虫致弱疫苗或基因缺失疫苗的靶标筛选研究提供参考。     

利用抑制消减杂交技术筛选鹅就巢行为相关基因

旨在利用抑制消减杂交技术构建鹅就巢与产蛋cDNA基因文库,筛选就巢母鹅上调与下调表达的基因.以就巢期和产蛋期鹅卵巢组织互为检测子和驱动子,进行正反双向消减杂交,获得鹅卵巢差异表达基因文库.从双向文库随机挑选单菌落进行PCR验证,结果表明文库质量良好.选取654个阳性克隆进行测序分析,获得641条表达序列标签(ESTs).对ESTs进行去除载体序列、质量检测、聚类及拼接,经BLASTn比对,有166条ESTs找到与之匹配的同源序列,其中92个是功能基因.比较就巢与产蛋SSH文库,发现就巢SSH库中参与细胞凋亡、信号转导及细胞结构的基因出现频率较高;产蛋特异性基因文库中参与物质能量代谢、细胞防御的基因较多;尚有许多差异片段属于未知功能蛋白或理论推定蛋白.结果提示,催乳素受体、抗苗勒管激素以及雌激素受体基因在就巢期上调表达可能与鹅就巢行为的启动与维持有关.该结果为进一步研究鹅就巢行为分子调控机制奠定基础.     

家蚕第2白卵近等基因系差异表达基因的筛选

为了解与家蚕第2白卵(w-2)性状形成相关的差异表达基因信息,以家蚕正常型黑卵及其第2白卵近等基因系的转色期蚕卵为材料,构建抑制消减杂交(SSH)文库,筛选差异表达基因。对SSH文库中部分克隆的测序分析表明,该文库对差异表达基因的富集性较好。随机挑选SSH文库中的300个克隆制作家蚕cDNA芯片,对家蚕正常型黑卵及第2白卵近等基因系转色期蚕卵进行检测,获得11个差异表达基因。对这11个差异表达基因进行实时荧光定量RT-PCR验证分析,其结果与芯片数据分析结果趋势一致,在正常型黑卵与第2白卵近等基因系之间,这些基因的表达差异为0.1倍至数千倍。     

Validation of the suppressive subtractive hybridization method in Mycoplasma agalactiae species by the comparison of a field strain with the type strain PG2

The subtractive suppressive hybridization (SSH), a method that allows the identification of sequences that are present in one genome (tester) but not in the other (driver), is a promising technique for the comparison of Mycoplasma agalactiae pathogenic strains. The optimal conditions for SSH were established by subtracting the M. agalactiae type strain PG2 DNA from the M. agalactiae strain 5632 DNA. Because these two strains possess different vpma gene repertoires, 5632-specific vpma sequences (and possibly other 5632-specific sequences) were predicted to be retrieved by SSH. The subtracted tester DNA was PCR-amplified and cloned into the pGEM-T easy E. coli vector. Two independent libraries were generated and used to prepare individual probes that were tested by Southern blot with genomic DNA from various field isolates and mycoplasma reference strains. Sequence analysis of two overlapping clones showed that they potentially code for a large carboxyterminal portion of a new vpma ORF. Several DNA fragments homologous to insertion sequences were also found in 5632 and related strains. These preliminary data suggest that SSH is a powerful method to investigate differences between mycoplasma strains, and may be applied to molecular epidemiology, diagnostic, and host specificity or pathogenicity determinant discovery.     

家蚕单性生殖早期胚胎SSH文库的构建及其序列分析

为了探讨家蚕早期胚胎性别决定的分子机制,以非减数分裂孤雌生殖(AMP)和双精雄核发育(BSA)技术获得的家蚕单一性别早期(2~24 h)发育蚕卵为材料,利用抑制消减杂交(SSH)技术构建了正向和反向抑制消减杂交cDNA文库。在正向与反向抑制消减杂交文库中分别随机选择62个和46个克隆测序,分别获得43种和29种cDNA序列,其中25个为新的cDNA序列。生物信息学分析显示,抑制消减杂交文库中与单性生殖有关的高温、低温、辐射等诱导表达基因出现的频次较高。对部分文库序列进行半定量RT-PCR分析表明,这些基因在两种单性生殖早期发育胚胎中存在差异表达。     

抑制性消减杂交技术及其在动物基因研究中的应用

抑制性消减杂交(SSH)是结合抑制性PCR和消减杂交技术发展起来的一种高效分离差异表达基因的方法,具有特异性高、假阳性率低、操作简便、灵敏度高等特点.在两种状态下基因的表达变化、差异基因的克隆和鉴定对基因表达调控有着重要意义.SSH在动物抗病、抗应激及药物的靶基因等方面的研究中取得了重要的进展.     

家蚕黄血近等基因系SSH文库的构建及部分EST的序列分析

以家蚕黄血品系KY和白血品系HB构建家蚕黄血近等基因系。用回交18代的家蚕黄血基因(Y)近等基因系群体中的黄血个体和白血个体中肠为材料,构建了家蚕黄血近等基因系抑制消减杂交(SSH)cDNA文库。从该抑制消减杂交cDNA文库随机挑选出46个阳性克隆进行测序,并用CAP3软件聚类拼接,得到4个假定基因(contig)和9个已知功能基因(unigenes)。通过BLAST比对和对所得表达序列标签(EST)的同源分析表明,这些基因主要涉及能量代谢因子、RNA分子水平相关调节因子、酶类、结构蛋白等,由此初步探明了参与黄血基因(Y)协同作用的相关基因表达蛋白的种类和数量,可为进一步研究蚕茧着色的分子机制及通过遗传选择培育天然有色茧品种提供基础信息。     

马铃薯病毒诱导应答基因抑制消减杂交文库构建及分析

马铃薯病毒积累引起的种薯退化是马铃薯生产中造成产量和品质下降的重要原因之一。本研究以马铃薯病毒病携带植株叶片cDNA为试验组(Tester)、脱毒种苗叶片cDNA为驱动组(Driver),采用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)技术构建了马铃薯病毒诱导应答基因的cDNA文库;为验证文库构建效果,从文库中随机挑取了98个阳性克隆经PCR验证后测序,获得了45条高质量的有效非重复序列;经与GenBank进行同源比对后发现,其中14条非重复序列属于马铃薯病毒基因序列,22条与已知基因序列同源性较高,9条无同源参考基因;选取文库中出现频率较高的2个ESTs(expressed sequence tag,表达序列标签)用qRT-PCR技术分析发现,其表达量受马铃薯病毒侵染的诱导。结果表明,该SSH文库构建较为成功,为进一步筛选与马铃薯病毒致病、防御相关的应答基因,解析马铃薯与病毒互作的分子机理,利用生物技术手段培育抗病毒马铃薯奠定了基础。     

Molecular study on chicken tumor necrosis factor receptor-II and tumor necrosis factor receptor-associated factor-5

Tumor necrosis factor (TNF) receptor-associated factors (TRAFs) were identified as signal transducers for the tumor necrosis factor receptor (TNFR) superfamily. In this study, we cloned and characterized two genes that encode chicken TNFR-II and TRAF5. The initial cDNA fragments were obtained by suppressive subtractive hybridization (SSH) of chicken spleen cells with or without lipopolysaccharide stimulation (Salmonella typhimurium SL1181 (RE-mutant)). The results showed that chicken TNFR-II is 1518 bp in length with an open reading frame (ORF) of 1386 bp having 31% homology with human TNFR-II. Expression analysis of chicken TNFR-II revealed that it is highly expressed in the spleen and bursa of Fabricius. The chicken cell lines IN24, MSB1 and 1104B express TNFR-II abundantly. The time course analysis of expression in spleen, bursa of Fabricius and IN24 cell line showed that TNFR-II is maximally expressed at 6 h after stimulation in bursa of Fabricius and after 8 h stimulation in the IN24 cell line. With regard to TRAF5, the complete sequence was 1936 bp in length with an ORF of 1671 bp that showed 71.3% homology with human TRAF5. Expression analysis showed that, among the tissues examined, TRAF5 was strongly expressed in spleen and bursa of Fabricius, while among the cell lines examined, it was maximally expressed in IN24. Thus, both genes were expressed in the same tissues and cell line among examined materials. These results suggest that chicken TNFR-II may interact with TRAF5 adaptor protein to complete its signal transduction pathway.