猪繁殖与呼吸综合征RT-LAMP检测方法的建立和初步应用

根据Genbank上已报道的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因组序列设计了2对LAMP引物(P-F3/P-B3、P-FIP/P-BIP),通过反转录-环介导等温扩增技术(RT-LAMP)反应条件的优化,建立了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)RT-LAMP检测方法,并通过酶切的方法对阳性结果进行了验证。本方法最低可以检测到反应体系内1pg的PRRSV的RNA,表明本方法具有较高的检测灵敏度;通过在反应中加入SYBR-Green I荧光染料后可以方便地用肉眼对试验结果进行可视化判定。所以,本研究建立的PRRSV的RT-LAMP检测方法能够满足基层临床PRRSV病原的快速检测要求。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型RT-LAMP检测方法建立

本研究针对猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型ORF6基因的6个区域,利用2对引物建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的RT-LAMP快速检测方法,该方法具有高灵敏度,高特异性的优点,在2小时左右即可得出结果,其灵敏度与PRRSV荧光RT-PCR检测方法相近,高于普通RT-PCR检测方法。将灭活的猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲型培养物作10倍系列稀释,结果显示建立的荧光RT-PCR的检测极限可达10-7,RT-PCR检测方法的检测极限为10-5,RT-LAMP检测方法达到10-8,表明建立的RT-LAMP检测方法非常灵敏,可用于检测猪组织样本中的美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒。     

基于PEDV M基因RT-LAMP快速检测方法的建立与应用

为建立一种快速、灵敏、方便的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)早期诊断方法,本研究针对PEDV的M基因片段设计了4条引物,对反应体系的时间、温度进行了优化,对试验的特异性和敏感性进行了评估,初步建立了逆转录环介导恒温扩增技术(RT-LAMP)。结果表明,建立的PEDV RT-LAMP方法在65℃恒温下扩增60min,可通过琼脂糖凝胶电泳或SYBR Green I染料肉眼判断结果,灵敏性较普通RT-PCR高100倍。该方法与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)等无交叉反应,具有良好的特异性。采用该RT-LAMP对100份临床疑似发病粪便拭子、小肠组织、初乳样本进行检测,结果较RT-PCR更灵敏。因此,本研究初步建立了可用于临床PEDV检测的RT-LAMP检测方法,为PEDV的临床快速诊断和综合防控提供了一种新的手段。     

逆转录环介导等温扩增技术检测H3亚型猪流感病毒

基于环介导等温扩增技术(RT-LAMP),建立了一种用于快速检测H3亚型猪流感病毒的方法。根据GenBank中收录的H3N2亚型猪流感病毒(SIV)HA基因保守区的序列,设计一组对应HA序列6个区域的4条特异性引物,建立RT-LAMP反应体系;经优化,确定了最佳的LAMP反应条件。扩增后产物形成的焦磷酸离子和溶液中的镁离子结合而形成焦磷酸镁沉淀,结果可视。同时用特异性内切酶HhaⅠ对所获得的产物进行酶切鉴定,所得的酶切产物大小与理论值完全符合。用已建立的RT-LAMP技术检测临床样品,检测结果与RT-PCR方法符合率均达到100%。结果表明,本研究建立的RT-LAMP检测猪流感病毒方法,操作简单,灵敏度高,特异性强,是一种适用于现场诊断的检测技术。     

猪流行性腹泻病毒RT-LAMP检测方法的建立与应用

为建立一种适用于现场快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因编码区序列,分别设计合成3组引物,通过对引物的筛选和反应条件优化,建立了PEDV RT-LAMP可视化快速检测方法。灵敏度和特异性试验结果显示,本方法在65℃45 min对PEDV的检测灵敏度为2 copies/μL,与猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应。利用该方法对30份送检的临床样品进行检测,检出阳性样品8份,与荧光定量RT-PCR检测结果一致。试验表明,所建立的RT-LAMP检测方法具有特异性好、灵敏度高、快速、结果可视、设备适用范围广等优点,适用于PEDV现场快速检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

为建立一种快速、灵敏、简便的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）早期检测方法,本研究利用逆转录环介导恒温扩增技术（RT-LAMP）,针对PRRSV的ORF5基因片段设计了4条引物,利用Bst DNA聚合酶在65 ℃恒温条件下进行逆转录扩增,通过1.0%琼脂糖凝胶电泳和加入SYBR Green Ⅰ染料肉眼判断结果,建立了PRRSV RT-LAMP检测方法。结果表明,该检测方法具有良好的特异性,与其他常见病毒如猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒等无交叉反应,较普通RT-PCR灵敏性高100倍。采用RT-LAMP和RT-PCR分别对10份临床样本同时进行检测,符合率为100%。因此,本研究建立的RT-LAMP是一种可适用于临床PRRSV检测的快速、简单、灵敏、特异的检测方法。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量RT-PCR和RT-LAMP快速检测方法的建立

猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是世界各地重要猪病毒性病原之一,每年给养猪业造成重大损失。本试验建立了应用TaqMan-LNA的荧光定量RT-PCR和逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)2种PRRSV检测方法。结果表明荧光定量RT-PCR和RT-LAMP检测下限分别为10²和10¹ 拷贝数/μL,都具有良好的特异性。临床样本检测结果同样表明2种方法都具有良好的特异性和灵敏度。本试验所建立的TaqMan-LNA荧光定量RT-PCR和RT-LAMP可有效的应用于PRRSV的检测。     

猪繁殖与呼吸综合征RT-LAMP检测方法研究

应用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),利用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核衣壳蛋白(N蛋白)ORF7基因保守序列的6个区域设计2对特异引物,经反应体系、反应条件优化及敏感性和特异性试验,建立了PRRSV RT-LAMP检测方法。研究结果表明,该检测方法不需要复杂仪器,仅用一台普通恒温水浴锅,在等温条件(63 ℃)保温1 h,即可完成核酸扩增反应,加入核酸染料SYBR GreenⅠ后,用肉眼即可对试验结果进行准确判定,为田间和基层部门检测猪繁殖与呼吸综合征病毒提供了一种廉价、简便、快速、敏感、特异的新方法。     

美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP可视化快速检测方法的建立与应用

为建立一种快速诊断美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(NA-PRRSV)的可视化检测方法,根据GenBank已发表的美洲型PRRSV经典病毒株JXA1序列,运用在线生物软件设计合成并筛选出1组引物,通过反应体系优化,建立了NA-PRRSV RT-LAMP可视化快速检测方法,并验证了该方法的特异性、敏感性,同时开展了初步临床应用。结果显示:该方法具有良好的特异性和较高的灵敏度,可检测病毒RNA模板的最低浓度为10 copies/μL;应用该方法检测30份临床样品,结果与实时荧光RT-PCR方法符合率为100%,进一步证实了该方法的可行性。结果表明,所建立的RT-LAMP检测方法具有特异性好、灵敏度高、快速、可视等优点,适用于NA-PRRSV的现场快速检测。本研究为NA-PRRSV的快速、准确鉴别提供了有效手段。     

猪瘟病毒RT-LAMP快速检测方法的建立和应用

为了研究检测猪瘟病毒(CSFV)的快速诊断方法,试验采用反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)分别设计了6条针对CSFV5′端保守基因特异引物,经条件优化后建立猪瘟病毒RT-LAMP快速检测方法。结果表明:在63℃恒温条件下45 min就能很好地扩增出CSFV目的片段;RT-LAMP产物经XhoⅠ酶切确定产物即为目的片段;将CSFV和其他6株与CSFV同属的病毒进行RT-LAMP扩增,结果只有CSFV得到阳性结果,其他均为阴性,说明此方法的特异性强;RT-LAMP对CSFV的最低检测量为1×101个基因拷贝,是常规RT-PCR敏感度的100倍;用CSFVRT-LAMP法和RT-PCR检测方法分别对27份临床样本进行检测,结果证明CSFV RT-LAMP与RT-PCR方法检测结果的符合率为92.6%。     

猪乙型脑炎病毒Ⅰ、Ⅲ型的RT-LAMP检测方法建立与应用

参考Gen Bank中猪乙型脑炎病毒(JEV)Ⅰ型和Ⅲ型毒株的E基因序列,通过比对分析,选取8个保守区域设计了6条引物,经条件优化及临床样品验证,本研究建立了能同时检测JEVⅠ型和Ⅲ型毒株E基因的RT-LAMP方法。该方法的最低检测灵敏限度为15 copies,具有较好的特异性,对猪常见病原如猪流感病毒(SIV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV),猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),猪细小病毒(PPV)和伪狂犬病病毒(PRV)等均没有特异性扩增。与RT-PCR检测方法相比,其灵敏性高10倍。用本研究建立的RT-LAMP方法检测来自屠宰场的1 500份猪血清,阳性检出率为0.4%,与RT-PCR吻合率达100%,表明本试验建立的RT-LAMP方法适用于Ⅰ、Ⅲ基因型JEV的快速、批量筛检,为JEV感染的流行病学调查提供了必要的技术手段。     

施马伦贝格病毒RT-LAMP检测方法的建立

通过对施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)及其同属各病毒基因序列进行比对分析,设计了针对SBV S基因节段的一组6条特异性引物,经优化建立了SBV RT-LAMP检测方法,可在63℃恒温条件下,于50min内完成目的序列扩增,通过染料法和琼脂糖凝胶电泳法观察结果,其灵敏度可达10TCID50,与荧光RT-PCR方法具有相同的敏感性。特异性试验显示,本方法与同属的沙门达病毒(Shamonda virus)会发生交叉反应,需借助沙门达病毒S基因节段上的一个特异性酶切位点Afl II进行酶切,实现两者的鉴别诊断。对103份临床样品的检测结果显示,本方法与荧光RT-PCR方法符合率为100%。本研究建立的RT-LAMP方法快速、简单、灵敏度高,不仅适用于实验室鉴定,还可应用于口岸、野外等的临床大规模监测。     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒双重RT-PCR检测方法的建立

为建立一种猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速、鉴别诊断方法,根据GenBank中已发表的2种病毒的基因组序列,选择病毒的保守基因各设计了一对特异性检测引物,建立了可以同时鉴别检测猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒的双重RT-PCR方法.该方法能从猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒分别扩增出310 bp和161 bp的特异性片段,对2种病毒混合基因组同时扩增出310 bp和161 bp的特异性片段;该方法对猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒的扩增结果均为阴性;该方法最低可以检出0.2 pg病毒RNA含量.本研究建立的RT-PCR方法具有良好的敏感性、特异性、重复性,在一个PCR反应体系中就可以准确、快速鉴别检测出猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒,可以用于临床病料的快速检测.     

病毒样颗粒内标在荧光定量RT-PCR检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒方法中的应用

为建立对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（H-PRRSV）快速准确的检测方法,本试验构建兽医临床用病毒样颗粒内标表达载体,制备检测H-PRRSV的病毒样颗粒内标。在H-PRRSV Nsp2基因保守区域设计了1对特异性引物和1个TaqMan荧光探针,通过对反应体系和扩增条件的优化,建立了检测H-PRRSV的荧光定量RT-PCR检测方法;将MS2噬菌体的成熟酶蛋白和衣壳蛋白基因序列定向插入pET-32a载体的相应位置,在载体下游插入人工合成包含引物和探针的内标基因序列,采用双酶切和PCR鉴定阳性质粒,将阳性质粒转化大肠杆菌BL21工程菌,IPTG诱导表达,制备了病毒样颗粒内标。试验结果表明,所建立的方法特异性强,灵敏度高,对8份已知病毒的检测结果显示特异性为100%,检测滴度为1 TCID₅₀/mL病毒液,对42份临床样本的检测结果与农业部备案试剂盒检测结果完全一致,体现了较好的实用性。     

猪流行性腹泻病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

为建立一种适用于现场快速检测的猪流行性腹泻病毒(PEDV)LAMP技术,基于羟基萘酚蓝(HNB)的可视化显色特点,根据PEDV M基因编码区序列,设计合成1套引物,通过反应物浓度和反应条件优化,建立了可闭管检测的PEDV RT-LAMP检测方法。特异性和灵敏度试验结果显示,建立的RT-LAMP检测技术快速、灵敏、特异,可于1 h内检出0.2 mL 0.1 TCID₅₀/mL的病毒RNA,与实时荧光RT-PCR检测方法灵敏度一致,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪链球菌2型核酸不发生交叉反应。利用该方法对187份送检的粪拭子及病死猪组织样品进行应用检测,检出阳性样品9份,与荧光定量RT-PCR方法检测结果一致。试验结果表明,所建立的方法快速、特异,重复性满足要求,适用于送检样品的PEDV快速检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒经典株与变异株RT-PCR鉴别诊断方法的建立及应用

本试验旨在建立一种快速的猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)经典株和变异株的鉴别诊断方法。根据GenBank中已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)经典株与变异株Nsp2基因序列,设计1对特异性引物,建立能鉴别诊断PRRSV经典株和变异株的RT-PCR检测方法;该方法能从经典株与高致病性株PRRSV基因组中分别扩增出549和459 bp的特异性片段;该方法对猪瘟病毒、猪乙型脑炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒的扩增结果均为阴性;该方法能分别检测出1 pg经典株和0.1 pg变异株RNA含量。建立的RT-PCR鉴别检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,可以准确、快速鉴别出PRRSV经典株与变异株,将为猪繁殖与呼吸综合征病毒的临床诊断、病料检测和分子流行病学调查等提供一种高效、快速、特异、灵敏的鉴别诊断方法。     

猪繁殖与呼吸综合征诊断方法研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是引起猪繁殖障碍的主要疫病之一。目前对PRRSV的致病机制和自身复制机制尚不完全明确,因此不能从根本上清除PRRSV的存在。这就使得对PRRSV的检测显得尤为重要。国内外研究表明用于猪繁殖与呼吸综合征检测的方法主要有酶联免疫吸附试(ELISA)、间接荧光抗体试验(IFA)、病毒分离、RT-PCR,同时一些新的检测方法如套式PCR,双重实时荧光定量PCR以及RT-LAMP技术也相继建立起来。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因RT-LAMP检测方法的建立

本研究根据GenBank中登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)M基因保守序列6个特异性部位设计了2对引物,建立了PRRSV的环介导逆转录等温检测方法.结果表明,该方法灵敏度比RT-PCR高100倍;全部反应可在1 h内完成并可得到其特有的阶梯状条带,而且猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒的扩增结果均为阴性;在反应体系中添加SYBR GREEN Ⅰ染料后,可通过肉眼观察有无荧光而直接判定结果.该方法灵敏度高、特异性好,可作为猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速诊断方法.     

反转录环介导等温扩增技术快速检测猪水疱病毒方法的建立

为了建立一种针对猪水泡病毒(SVDV)的反转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),用于减少猪水泡病与口蹄疫因临床症状相似而造成的误诊,试验针对SVDV VP1基因序列设计4个LAMP引物,其中外侧引物用于SVDV PCR检测,并利用RT-LAMP和RT-PCR方法进行敏感性试验、特异性试验以及临床样品检测。结果表明:针对SVDV的RT-LAMP检测方法的敏感性是RT-PCR的10倍; RT-LAMP方法的特异性良好,与口蹄疫病毒无交叉反应;两种方法对临床样品检测的符合率为100%。说明试验建立的RT-LAMP方法具有敏感性高、特异性强、快速等特点,适合实验室和临床对SVDV的快速诊断。     

口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒二重RT-LAMP鉴别检测方法的建立

LAMP技术是一种快速新型的核酸检测技术,该技术利用4条引物在恒温下扩增目的 DNA,特异性好敏感性高。本试验旨在建立一种能同时鉴别诊断FMDV和VSV的二重RT-LAMP检测方法。根据口蹄疫病毒(FMDV)3D基因和水泡性口炎病毒(VSV)N基因的保守序列,设计了2套特异性引物,在每套引物的内引物中插入酶切位置EcoRⅠ,对反应条件进行了优化,建立了恒温快速的检测方法。结果显示:该方法特异性好,能检测到口蹄疫病毒的A,O,Asia1亚型和水泡性口炎的NJ和IND亚型,并与其他对照牛病原体不发生交叉反应;敏感性高,最低能够检测个100个FMDV病毒RNA和100个VSV病毒RNA;干扰性小,能同时检测两个模板的不同浓度组合。本试验建立的口蹄疫和水泡性口炎二重RT-LAMP方法具有简便、快速、特异、敏感等优点,可用于FMDV和VSV的临床检测和流行病学调查。