山羊痘病毒P32基因在杆状病毒中的表达

采用PCR亚克隆了山羊痘病毒P32基因片段,将其插入杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ中,构建了重组质粒pFastBac-P32;再将该质粒转化DH10 Bac感受态细菌,进行体内重组,然后经三重抗性及蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-P32;将Bacmid-P32转染Sf9细胞,获得重组杆状病毒;最后用SDS-PAGE和Western-blotting对P32基因的表达进行检测.结果表明,P32基因在重组杆状病毒中获得表达,且表达产物可以被多抗所识别.     

山羊痘病毒P32基因真核表达载体的构建及表达

从重组克隆栽体pMD18-P32中扩增出山羊痘病毒P32基因,与毕赤酵母分泌性表达载体pPICgK相连接,构建重组表达载体pPIC9K-P32.重组质粒pPIC9K-P32用SaIⅠ线性化后,与毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115混合后电转化,使重组表达载体与酵母染色体发生同源重组.采用G418抗性梯度筛选法得到高拷贝重组菌株,甲醇诱导目的基因表达.SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,用酵母成功表达出了31 000的重组蛋白,该蛋白具有生物学活性,能被山羊痘阳性血清识别.     

山羊痘病毒P32基因重组表达载体的构建及原核表达

以含山羊痘病毒贵州LD株P32基因的质粒pMD18-T-P32/LD为模板,应用PCR方法扩增P32基因,将该基因片段克隆至原核表达载体pET-28a,构建了重组表达载体pET-28a-P32/LD,转化大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示,有分子量约为35.5 ku的融合蛋白获得表达,与预期结果相符;Western-Blotting证实该表达蛋白具有免疫学活性。P32蛋白的成功表达为山羊痘基因工程疫苗的研制及诊断方法的建立奠定了基础。     

羊痘病毒P32蛋白编码基因的克隆及表达

为获得山羊痘病毒膜蛋白重组P32抗原，根据其基因序列设计合成了1对特异性引物，对CaPVP32基因进行了PCR扩增，产物大小约为969bp；产物回收纯化后，将其克隆至pBAD／Thio—TOPO载体中，转化TOP10大肠埃希氏菌感受态细胞，与已报道的多株CaPVP32基因序列的同源性高达99％；相应地，氨基酸序列同源性为98％。经测序筛选出阳性克隆，该重组菌株经L—arabinose诱导，可稳定、高效地表达CaPVP32抗原。表达蛋白为融合蛋白，分子质量约51．53ku．     

羊痘病毒P32基因的截短表达与鉴定

根据GenBank上发表的羊痘病毒(CPV)P32基因序列,设计并合成一对引物,PCR扩增出837bp基因片段并克隆到pMD18-T载体中,酶切鉴定并测序。将P32基因定向克隆到pET32a表达载体中,酶切及测序鉴定正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。采用镍离子亲和树脂在变性条件下对蛋白进行纯化,Western blot证明该重组蛋白具有良好的反应原性。     

山羊痘病毒P32蛋白的原核表达及其免疫原性研究

为表达山羊痘病毒P32蛋白并研究其免疫原性,构建了含有P32基因的重组表达质粒p ET-P32,诱导表达和纯化了P32蛋白;分别运用SDS-PAGE和Western blot,对该蛋白进行了分析和生物活性鉴定;用分析鉴定后的P32蛋白免疫BALB/c小鼠,然后采集小鼠血清,用间接ELISA进行抗体检测;用小鼠脾淋巴细胞增殖试验,检测该蛋白对机体的细胞免疫活性。结果显示:表达纯化的含有GST标签的P32重组蛋白,大小约39k Da;Western blot显示P32重组蛋白具有较好的特异性;间接ELISA抗体检测和小鼠脾淋巴细胞增殖试验表明P32重组蛋白具有良好的免疫原性。本试验结果为深入研究P32蛋白的生物学功能以及对山羊痘的诊断与防治奠定了基础。     

羊痘病毒P32基因的克隆与原核表达

根据发表的羊痘病毒P32基因,设计一对特异性引物,PCR扩增P32全长基因,将其克隆入pMD-18-T载体,获得重组质粒pMD-P32.再将P32基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1,获得重组表达质粒pGEX-P32,转化大肠埃希菌BL21后用IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE分析.结果表明,P32全长基因在大肠埃希菌中以融合形式成功表达,分子质量为58 ku左右,与预期大小相符.     

基于山羊痘病毒P32蛋白ELISA检测方法的建立

P32蛋白是羊痘病毒株中特异性很强的免疫原性结构蛋白,本研究利用原核表达系统对山羊痘病毒P32基因进行表达,并应用该蛋白建立了检测山羊痘病毒血清抗体检测方法。将P32基因克隆至pGEX-6P-1表达载体,经抗性筛选,测序鉴定获得重组阳性克隆,成功构建了羊痘病毒重组pGEX-P32表达载体。经IPTG诱导表达,可稳定、高效地表达P32融合蛋白。融合蛋白纯化后SDS-PAGE结果表明,以终浓度为1mmol/L的IPTG进行诱导,8h后表达量最高,表达蛋白为融合蛋白,相对分子质量约56 000,表达产量约占菌体总蛋白的28%。Western-blotting检测表明,表达的融合蛋白能与羊痘阳性血清发生特异性反应,说明表达获得的产物具有良好的反应原性。用表达的融合蛋白建立了检测羊痘血清抗体的ELISA方法,经方阵滴定,确定抗原最佳包被质量浓度为每孔0.4mg/L,最佳血清稀释度为1∶20。符合率试验表明ELISA方法和琼脂扩散试验的阳性符合率为83.44%,并且所建立的方法具有很好的特异性、重复性和敏感性,这为应用该融合蛋白制备山羊痘病毒免疫血清学诊断试剂和疫苗研究奠定了基础。     

通用山羊痘病毒P32基因缺失转移载体的构建

为了构建GTPV P32基因缺失的通用GTPV转移栽体,试验根据山羊痘病毒疫苗株(GTPV-TY)的P32基因结构设计了2对引物,分别扩增得到与P32基因部分相邻的长度约为11kb的同源重组臂序列并插入到pGEM-T easy载体上,通过Smal位点重新连接,并在此位点插入CMV启动子、多克隆位点、BGH polyaA信号以及LacZ基因.结果表明,试验成功构建了通用山羊痘病毒P32基因缺失转移载体pdP32,此转移载体为改造GTPV-TY株以及开发二价或多价基因工程疫苗提供了有力工具.     

山羊痘病毒P32基因的截短表达及间接ELISA方法的建立和应用

为建立一种山羊痘病毒(GTPV)抗体快速检测方法,通过PCR技术扩增了P32蛋白优势抗原区(2-141AA)基因序列,将其连接至原核表达载体pET-28a(+)上,转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导后获得了重组蛋白,纯化后经Western blot鉴定表明该蛋白具有良好的特异性和抗原反应性。以重组蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件建立了快速检测GTPV抗体的间接ELISA方法,该方法具有良好的特异性、敏感性与可重复性,为GTPV的免疫抗体检测及流行病学调查提供了一种血清学诊断方法。     

基于山羊痘病毒P32蛋白间接ELISA方法的建立

通过Ni柱亲和层析和G-100层析技术对真核表达蛋白进行纯化,SDS-PAGE分析GPVP32蛋白纯化效果;应用琼脂扩散试验检测纯化蛋白的抗原反应性,并以纯化蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法。结果显示,从真核表达产物中获得了纯化的GPVP32蛋白,琼脂扩散试验显示纯化的GPVP32蛋白具有良好的抗原反应性;基于纯化蛋白建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、敏感性和重复性。结果表明,本试验建立的间接ELISA方法可用于山羊痘流行病学的调查和血清抗体水平的监测,为山羊痘的防控提供了有效技术。     

抗山羊痘病毒P32蛋白杂交瘤细胞的构建及其单克隆抗体的制备

本研究旨在以纯化的山羊痘病毒P32蛋白为免疫原,构建杂交瘤细胞株,制备P32蛋白单克隆抗体。用纯化的P32蛋白免疫BALB/C小鼠后,按常规方法进行细胞融合,构建抗山羊痘病毒P32蛋白的杂交瘤细胞,制备P32蛋白单克隆抗体,获得4株能识别重组蛋白且特异性强无交叉反应的杂交瘤细胞株,腹水抗体效价均在105以上。山羊痘病毒P32蛋白杂交瘤细胞株的构建及单克隆抗体的制备为进一步开展检测方法研究提供了材料。     

羊痘病毒P32蛋白的研究进展

P32蛋白是所有羊痘病毒具有的结构蛋白之一,含有重要的免疫原性决定簇。P32蛋白既是致病的关键因素,也是激发机体产生抗体并产生保护性免疫的主要成分。作者就羊痘病毒P32蛋白的基因组结构、抗原表位及P32蛋白应用于羊痘病毒诊断和免疫方面的研究进展作一综述。     

云南山羊痘流行毒株P32基因的克隆与表达

山羊痘是由山羊痘病毒引起的一种严重的、高度接触传染的动物疾病,被国际兽疫局(OIE)列为A类动物传染病.临床上以体温升高、全身性或局部性皮肤痘疹及内脏病变(特别是肺)乃至死亡为特征.山羊痘病毒(GTPV)属痘病毒科脊索动物亚科羊痘病毒属的成员,该属其他成员还有绵羊痘病毒(SPPV)、疙瘩皮肤病病毒(LSDV).P32抗原是一种结构蛋白抗原,包含有一个主要的抗原决定簇,存在于所有的羊痘病毒属的3个成员中.针对山羊痘病毒与副痘病毒属存在免疫交叉反应,缺乏有效的鉴别诊断试剂盒,本研究克隆表达出羊痘病毒属特异的P32蛋白,为进一步研制抗体及抗原检测试剂盒奠定前期工作基础.     

羊痘病毒P32蛋白基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

应用PCR方法扩增羊痘病毒特异性蛋白P32蛋白的基因,将其克隆至pMD18-T载体,测定核酸序列后将P32基因克隆至Bac-to-BacR杆状病毒表达系统中转移载体pFastBacl和pFastBacHTa,进而转化人含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,获得两种携带P32基因的重组转染质粒:Bacmid-Bacl-P32,Bacmid-BacHT-P32,经PCR试验鉴定,获得的这两种重组转染质粒是携带P32基因的杆状病毒表达载体,可分别用于转染Sf-9昆虫细胞以获得单一重组P32蛋白和六聚组氨酸融合体重组P32蛋白.     

禽流感病毒NA基因在巴斯德毕赤酵母系统中的表达

采用PCR扩增禽流感病毒(AIV)NA基因，克隆入pMD18-T载体中，再亚克隆入含有AOX1启动子和α分泌信号肽序列的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9k中，构建了重组转移载体pPIC9kNA。经电穿孔转化酵母宿主菌GSll5和筛选高拷贝重组转化子及筛选His^ Mut^ 表型转化子后，摇瓶培养，10mL／L甲醇诱导表达后，经SDS-PAGE、Western-blotting、双向琼脂扩散试验、神经氨酸酶试验分析证明，获得了几株高效表达重组表达株，并且该重组NA蛋白具有免疫学活性。     

山羊痘病毒贵州分离株P32基因的克隆及序列分析

山羊痘(goat pox)是由羊痘病毒属(capripox-virus)山羊痘病毒(goat poxvirus,GPV)引起的一种主要危害山羊的高度接触性传染病[1]。本试验应用PCR技术,从山羊痘病毒DNA中扩增P32基因,通过pMD18-T克隆载体转化到DH5α工程菌中,并进行重组质粒的鉴定,旨在探索山羊痘病毒贵州株与国     

山羊痘云南流行毒株及疫苗株P32基因序列分析

将本实验室分离到的山羊痘病毒云南流行毒株MYS、XW、XD及疫苗株VF4主要结构蛋白基因P32基因克隆到PMD18T载体后进行双向测序,所得序列与Genbank中羊痘病毒属成员:山羊痘病毒(GTPV)、绵羊痘病毒(SPPV)、疙瘩皮肤病病毒(SLDV)参考毒株相应序列作对比分析(ByClustalWMethod),结果显示:(1)MYS、XD毒株P32基因全长969bp,疫苗株VF4为974bp,XW毒株为975bp。(2)XW、疫苗株VF4在100～105bp位置处均插入6个A,在947bp位置缺失一个T;SPPV参考毒株在169～171bp位置插入GAT。(3)由于疫苗株VF4P32基因核苷酸序列第414位置处发生了T/A突变,在该处形成一个新的终止密码子TAA,导致完整的开放读码框架(ORF)被打断,只表达第1～411bp(137个Aa)的基因片段,而不能表达出完整的P32蛋白。其余6株毒株的开放读码框架均很相似。(4)在所构建的系统发生树中,LSDV与SPPV参考毒株、MYS和XD株、VF4和XW株、GTPV参考毒株各被划分为一组。所有7个毒株P32基因核苷酸序列的同源性都很高,均在97%以上。其中疫苗株VF4与SPPV参考毒株的同源性最低,为97.6%。XD与XW毒株的同源性最高,为99.8%。(5)酶切位点分析结果显示,MYS、XW、XD、VF4及GTPV和SLDV参考毒株具有唯一的HinfI酶切位点,大约在第694bp位置。SPPV参考毒株具有2个HinfI酶切位点,分别在第391bp和691bp位置处,该酶切位点较适合用来鉴别山羊痘和绵羊痘病毒,而疙瘩皮肤病在临床上就很容易与山羊痘和绵羊痘鉴别开来。     

山羊痘病毒p32基因的克隆、表达及单克隆抗体制备

本研究旨在表达山羊痘病毒p32蛋白、制备p32蛋白单克隆抗体。通过PCR克隆p32基因,连接到pMD18-T并测序;酶切、连接后将p32基因克隆到pET28a(+)中,将重组质粒转化大肠杆菌Rosseta,在IPTG诱导下成功表达p32蛋白;利用亲和层析法纯化p32蛋白,用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠后制备p32蛋白单克隆抗体,获得22株识别重组蛋白的单抗,通过间接免疫荧光鉴定,其中3株能识别病毒的p32蛋白。山羊痘病毒p32蛋白的表达和单克隆抗体的制备为山羊痘病毒抗原、抗体检测提供了生物材料。