民猪脂蛋白脂酶基因在冷诱导后表达变化的研究

脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase,LPL）是动物分解代谢的限速酶,是影响脂肪代谢通路中的一个重要基因。本研究将LPL基因作为影响民猪抗寒特性的候选基因,对其在心脏、肝脏、胃、脾脏、肾脏、肺脏、大肠、小肠、子宫、卵巢、背肌、腿肌、脂肪共计13个组织内的表达情况和低温冷诱导后在民猪肌肉组织内的表达变化情况进行了分析。结果表明,LPL基因在所检测的13个组织中均有表达,但表达量存在差异,心脏、背肌、腿肌、脂肪组织中的表达量较高,子宫和卵巢组织的表达量较低;LPL基因在民猪被冷诱导后表达水平无显著变化。     

寒冷环境下民猪冷诱导RNA结合蛋白基因的表达变化

为了研究民猪冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)基因组织表达及寒冷环境下表达变化情况,试验采用RT-PCR和Real-time PCR的方法检测CIRP基因在民猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脂肪、背最长肌等器官组织中的表达情况以及寒冷环境下在肌肉中的表达变化情况。结果表明:常温下CIRP基因在所检测的7个器官组织中均有表达,呈组成型表达;寒冷环境下CIRP基因在民猪背最长肌中表达水平显著升高(P0.05)。     

冷诱导下民猪磷酸葡萄变位酶基因的表达变化

磷酸葡萄变位酶(PGM)是糖代谢过程中的一个关键酶,为了研究其表达变化,研究采用RT-PCR和Real-time PCR方法,对PGM在大肠、腿肌、肺脏、脂肪、心脏、脾脏和肝脏组织的表达水平以及冷诱导前后民猪骨骼肌内PGM mRNA的表达变化进行了研究。结果表明:在所检测的7个组织中除大肠外其余组织PGM均高水平表达,而且冷诱导后PGM mRNA的水平出现了明显的下降。     

冷诱导下Y-box结合蛋白基因的表达变化

为了研究冷诱导下Y-box结合蛋白基因的表达,试验采用Real-time PCR的方法,将所得民猪的Y-box结合蛋白表达结果与长白猪的Y-box结合蛋白表达结果进行对比研究.结果表明:在-20℃条件下处理13 d后,民猪的Y-box结合蛋白基因的表达水平与常温组相比显著下降,而长白猪的Y-box结合蛋白表达无显著变化...     

冷应激后民猪肝素结合性表皮生长因子基因表达研究

肝素结合性表皮生长因子(hepafin-binding epidermal growth factor-like,HB-EGF)是表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)家族的成员之一。本研究采用Real-time PCR分析了在民猪冷诱导后该基因在骨骼肌内的表达变化情况。结果表明,低温组(－20 ℃)的HB-EGF基因的表达水平与常温组(10 ℃)相比出现了极显著下降(P＜0.01)。据此推测,冷应激抑制了HB-EGF基因的表达,也间接抑制了民猪的正常生长。     

冷应激下民猪黑素皮质素受体基因的表达变化

黑素皮质素受体3（melanocortins 3 receptors,MC3R）是G-蛋白耦联受体超家族的成员之一。研究采用Real-time PCR的方法,对冷应激下民猪腿肌内MC3R基因的表达变化情况进行了研究。结果表明,冷应激下,MC3R基因的表达出现了显著地上升（P〈0.05）。据此推测,民猪很可能是通过上调MC3R基因的表达来增加能量消耗而抵御寒冷气候的。     

民猪唾液酸合成酶基因的克隆、表达及进化分析

为进一步了解猪的唾液酸合成酶基因(SAS)的生物学功能,研究采用RT-PCR技术克隆了民猪唾液酸合成酶基因的全长CDS序列;采用生物信息学的方法对其编码的氨基酸序列进行分析;构建分子进化树;采用实时定量PCR方法对该基因在大肠、腿肌、肺、脂肪、心、脾和肝脏组织的表达情况进行分析。结果表明:民猪的唾液酸合成酶基因全长1080 bp,编码359个氨基酸,是一种跨膜蛋白。该蛋白存在1个似抗冻蛋白域标记,同时具有多个磷酸化位点。所构建的分子进化树与物种进化的拓扑结构基本一致。该基因在肺和脾中表达水平最高,其次是脂肪在大肠、肌肉、心和肝中表达水平较低。     

不同猪种腿肌中Cst B基因的表达研究

为了研究半胱氨酸蛋白酶抑制剂B(Cst B)基因在大白猪、野猪及野家杂交猪腿肌组织中的表达情况,试验采用RT-PCR方法对试验猪只进行检测。结果表明:在1日龄大白猪、360日龄野猪和各日龄的野家杂交猪中腿肌组织Cst B基因均有较高表达,总体上来说野猪和野家杂交猪腿肌组织中Cst B基因的表达高于纯种大白猪。     

脂肪酸转运蛋白1在荣昌猪不同组织中的表达规律及其与肌内脂肪沉积的关系

本试验旨在研究脂肪酸转运蛋白1(FATP1)在荣昌猪不同组织中的表达规律及其与肌内脂肪沉积的关系.试验选用80只1日龄健康荣昌仔猪饲养,分别在1、7、20、50、90、150日龄选取5只屠宰取样,检测FA TP1基因及其编码的蛋白质在荣昌猪体内的组织表达情况并分析其与肌内脂肪沉积的相关性.结果表明:FATP1基因及其编码的蛋白质在荣昌猪的各个组织均有表达,在肌肉和心脏中的表达水平最高,在脂肪和肝脏中的表达水平其次,而在小肠和肺脏中的表达水平最低.随着新生仔猪的生长,FATP1基因在肌肉中的表达水平逐渐升高,分别在50日龄以后的背肌和90日龄以后的腿肌中维持一个较高的水平.数据分析显示FATP1基因的表达与猪肌内脂肪沉积呈现显著正相关(P＜0.05).由此可知,FATP1基因的高表达对于猪的肌内脂肪形成和沉积具有重要影响.     

猪hnRNPUL1基因克隆及变异剪接体鉴定

旨在克隆民猪hnRNPUL1基因全长编码区(complete coding sequence, CDS)序列并进行可变剪接分析,研究其组织表达和亚细胞定位情况。本研究以3头3月龄民猪为试验材料,利用RT-PCR技术克隆hnRNPUL1基因CDS及可变剪接体,应用qRT-PCR检测其在心、肝、脾、肺、肾、胃、大肠、小肠、背肌、腿肌等组织中的表达情况,同时,在生物信息学预测的基础上,通过融合表达绿色荧光蛋白的方法鉴定核定位序列。研究结果表明,猪hnRNPUL1基因(GenBank accession No.:MN399154) CDS全长2 580 bp,预期编码的多肽链存在着hnRNPs家族的特征性结构域——SAP、SPRY和AAA;猪hnRNPUL1普遍表达于所检测的各组织中,其中在脾脏中表达量最高,在腿肌中表达量最低;核定位序列(NLS)位于多肽链的133～430 aa处,与生物学信息学预测的结果存在着偏差;同时获得了2个变异剪接体和11种可变剪接片段。本研究结果对进一步揭示猪hnRNPUL1基因功能及转录调控机制提供了基础。     

半胱氨酸蛋白酶基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

为了探讨杆状病毒的致病机理、改善杆状病毒表达系统的表达效率 ,将来源于家蚕核型多角体病毒ZJ8株的半胱氨酸蛋白酶 (cystenineprotease,CP)基因克隆到转移载体pVL 1393上 ,获得重组转移载体pVL cp ,与线性化的Bm BacPAK6病毒DNA共转染家蚕Bm 5贴壁细胞。通过蓝白斑筛选、纯化后得到的重组病毒经PCR鉴定证明 ,cp基因已被正确导入 ,注射感染家蚕 5龄幼虫 12 0h后表达产物活性达到最高。对表达产物进行SDS PAGE及酶活力分析 ,检测到半胱氨酸蛋白酶在家蚕生物反应器中的表达 ,其表达量约为 16 0 0U/mL。     

鹅细小病毒VP3基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

为真核表达鹅细小病毒（GPV）融合蛋白VP3基因,本研究通过PCR扩增GPV FY89株VP3基因,并将其克隆至杆状病毒转移载体pFastBac/HBM-TOPO中,经双酶切、PCR及测序鉴定正确后,转化感受态细胞DH10Bac,提取重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-VP3,将经PCR鉴定正确的rBacmid-VP3转染Sf9昆虫细胞,连续传代后,细胞病变明显。SDS-PAGE分析结果表明成功表达了分子质量约为61 ku的VP3蛋白;Western blotting分析结果表明重组VP3蛋白具有良好的抗原性。     

结核分支杆菌MPT83在真核、原核表达载体中的克隆、表达与鉴定

为了克隆、鉴定和表达结核分支杆菌抗原蛋白 MPT83 ,为结核病的诊断以及亚单位疫苗、核酸疫苗的制备和应用奠定基础。以结核分支杆菌标准菌株 H3 7RV基因组 DNA为模板 ,PCR扩增目的基因 mpt83 ,扩增产物酶切后分别克隆到真核、原核表达载体 p JW43 0 3和p ET2 2 b( )中 ,构成重组真、原核表达载体 83eu和 MPT83。经酶切和序列鉴定为正确的重组真核表达载体 83 eu和重组原核表达载体MPT83 ,分别转染 COS7细胞和转化 BL2 1( DE3 ) plys S。结果表明 ,经 SDS-PAGE、Westernblotting检测显示 ,IPTG诱导的原核表达载体MPT83在 2 .6万处有正确而特异的蛋白条带 ;转染 COS7细胞的真核表达载体 83 eu,Westernblotting检测表明也有与结核分支杆菌抗血清特异反应的蛋白条带     

鸡Mx基因原核表达载体的构建及其表达分析

旨在大肠杆菌中表达鸡抗病毒Mx蛋白,为进一步研究该基因抗病活性奠定基础.本研究通过设计一对特异性引物,从已构建好的鸡Mx基因真核表达载体pcDNA3.0-MMx上扩增出Mx基因开放式阅读框(2118 bp),并将其编码区重组于原核表达载体PGEX-6P-1中,经酶切和序列鉴定分析后,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)和Rossetta-gami(DE3),并比较其表达效率.结果显示,经不同浓度IPTG诱导后,该基因在Rossetta-gami(DE3)中获得表达.SDS-PAGE检测结果显示,蛋白大小与预期结果相符,说明重组质粒pGEX-Nix在大肠杆菌中成功诱导表达出鸡Mx蛋白,为下一步鸡Mx蛋白活性检测及抗体制备奠定基础.     

鹅源新城疫病毒NA-1株F蛋白基因在重组杆状病毒中的表达

将含有鹅源新城疫病毒NA-1株F蛋白基因的重组转座载体PFF转染昆虫细胞sf9,28℃培养,待细胞出现明显病变后,收取细胞,反复冻融,接种sf9昆虫细胞,如此再传代1次,收集细胞保留毒种,同时做表达产物的检测,结果表明,表达产物约占细胞总蛋白的10%,并有良好的反应原性。     

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在家蚕中表达人瘦素蛋白

瘦素(leptin)蛋白由肥胖基因编码,对人体能量代谢等多种生理过程起着重要的调节作用。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将人瘦素蛋白基因(lep)克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,并转化E.coli DH10Bac,获得重组杆粒Bacmid-lep,然后转染家蚕BmN细胞,获得重组杆状病毒。用SDS-PAGE和Western blotting方法在感染重组病毒的家蚕BmN细胞检测到大小约22 kD的蛋白条带,与预期的人瘦素蛋白分子质量相符。给家蚕5龄起蚕注射重组病毒液后的4～5 d出现发病症状,RT-PCR检测发病家蚕的血液中有lep基因转录,并通过SDS-PAGE和Western blotting检测到大小为22 kD的人瘦素蛋白的表达。研究结果表明,利用Bac-to-Bac表达系统能够获得含有人瘦素蛋白基因的重组杆状病毒,并且目的蛋白能在家蚕细胞及幼虫体内表达。     

人白细胞介素-4基因在家蚕杆状病毒表达系统中的表达

采用RT-PCR法从经LPS诱导刺激的人外周血淋巴细胞中克隆了人白细胞介素-4(human interleu kjn-4,hIL-4)基因。为高效表达hIL-4,促进其临床应用,将hIL-4插入家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,构建重组载体pBacPAK-hIL-4,并与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕BmN细胞,获得重组病毒BacPAK-hIL-4。将重组病毒感染家蚕5龄幼虫和蚕蛹(1×10~5PFU/头),表达产物以ELISA、SDS-PAGE和Western blotting方法检测,用活化的人外周血T淋巴细胞测定表达产物体外生物活性。ELISA法结果表明hIL-4在感染病毒后96h的蚕血淋巴和120h的蚕蛹中表达量最高,分别达到2．3μg/mL蚕血淋巴和10．2μg/mL体液;SDS-PAGE、Western blotting分析表明表达产物分子量约20kD;表达产物对活化的T淋巴细胞增殖具有明显促进作用。     

提高昆虫杆状病毒表达系统重组蛋白表达水平的技术

昆虫杆状病毒表达系统已广泛用于各种重组蛋白的生产。然而,由于各种因素重组蛋白的表达量远远达不到理想的水平。提高重组蛋白的表达水平成为提高昆虫杆状病毒表达系统效率的核心问题。根据目前的研究,提高外源基因表达水平的技术主要包括抑制目的蛋白降解、合理调控目的基因的转录、优化启动子类型以及利用活体昆虫而非培养细胞,如用家蚕幼虫或蛹进行表达等。这些技术也为家蚕成为更加高效的生物反应器奠定了基础。     

人血小板因子Ⅳ在家蚕杆状病毒表达载体系统中的表达

将人血小板因子Ⅳ (HumanPlateletFactorⅣ ,简称hPF4)基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中 ,获得重组转移载体pBacPAK PF4,并与线性化病毒Bm BacPAK6DNA共转染家蚕培养细胞 ,在细胞内发生同源重组 ,获得重组病毒BacPAK PF4。Southern杂交结果表明重组病毒基因组中含有hPF4基因。重组病毒以MOI=10感染家蚕培养细胞 (2× 10 6个细胞 )和家蚕 5龄幼虫 ,表达产物用体外培养的血管内皮细胞测定其生物活性 ,测得表达量在家蚕培养细胞中第 3天达到最高值为 6 0 88μg/ 2× 10 6个细胞 ;在蚕体内表达第 5天达到最高值 ,表达量明显高于家蚕培养细胞     

巴斯德毕赤酵母(P pastoris)表达系统

近年来，基因工程菌被广泛用于商业化生产外源蛋白。原核生物作为基因工程表达系统简单而易培养，有其一定的优点，但也存在着一定的缺陷，如不能对表达蛋白进行糖基化等翻译后修饰，特别是对核基因的表达，可能导致产物失去生活活性。自1981年Hitzeman等首次在酿酒酵母中表达了人重组干扰素基因后，相继又有多种外源基因表达成功。与大肠杆菌不同的是，酵母可对异源蛋白进行修饰，采用有信号肽的质粒时，蛋白能被正确折叠和加工，然后分泌到培养基中；与哺乳动