氟苯尼考对三疣梭子蟹不同组织中ABC转运蛋白基因(ABCG)表达量的影响

为研究氟苯尼考(FLR)对三疣梭子蟹Portunus trituberculatus不同组织中ABC转运蛋白基因(ABCG)表达量的影响,采用RACE法进行了三疣梭子蟹ABCG基因克隆并对其生物学进行了分析,采用荧光定量PCR法进行了不同浓度(20、40、80 mg/kg)氟苯尼考对三疣梭子蟹肝胰腺、鳃和肌肉中ABCG相对表达量的影响研究。结果表明:三疣梭子蟹ABCG基因全长c DNA序列为2473 bp,共编码578个氨基酸;三疣梭子蟹ABCG不含信号肽,具ABC转运家族蛋白的典型结构域,包括1个高度保守的核苷酸结构域(NBD)和1个疏水性跨膜区(TMD),为半转运子;同源性及系统进化分析表明,三疣梭子蟹ABCG与中国对虾、凡纳滨对虾的ABCG聚为一支,具有较高的亲缘关系;不同浓度的氟苯尼考对三疣梭子蟹肝胰腺、鳃、肌肉中ABCG表达均具有诱导作用,且呈时间剂量效应,由此推测,三疣梭子蟹ABCG蛋白参与氟苯尼考的代谢转运过程。本研究结果可为揭示甲壳动物ABCG转运蛋白对抗生素的转运机制提供参考依据。     

CuO-ENPs在三疣梭子蟹不同组织中的积累效应研究

为研究CuO-ENPs在三疣梭子蟹不同组织中的积累效应,选择三疣梭子蟹的鳃、血淋巴、肌肉、肝胰腺、心脏和胃作为研究对象,开展了CuO-ENPs在20、40 mg/L浓度下对三疣梭子蟹的慢性毒性试验,探讨了CuO-ENPs在不同组织内的积累效应。结果表明:CuO-ENPs的富集含量从高到低的顺序为鳃血淋巴肌肉肝胰腺心脏和胃,三疣梭子蟹暴露于不同CuO-ENPs浓度的条件下,体内CuO-ENPs的积累量具有一定差异,除血淋巴外,随着CuO-ENPs浓度的增高,不同组织的CuO-ENPs残留量有一定程度的增加,表现出明显的浓度效应。三疣梭子蟹鳃对CuO-ENPs的富集能力较强,在20、40 mg/L浓度下富集系数分别高达76.35和58.15,血淋巴对CuO-ENPs的富集系数分别为2.6和1.4,肌肉对CuO-ENPs的富集系数分别为1.77和1.43,肝胰腺对CuO-ENPs的富集系数分别为1.3和0.8,心脏和胃对CuO-ENPs的富集系数分别为1.30和0.65。三疣梭子蟹鳃对CuO-ENPs的富集作用远高于三疣梭子蟹的血淋巴、肌肉、肝胰腺和心脏及胃等组织。     

三疣梭子蟹免疫相关基因Cystatin的鉴定与表达分析

半胱氨酸蛋白酶抑制剂Cystatin超家族在机体中参与包括免疫调节在内的多种生理病理功能。通过对三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）血细胞全长cDNA文库随机测序,鉴定了一个新颖的I型Cystatin基因,命名为PtCystatin。PtCystatin全长cDNA 960 bp,开放阅读框372 bp,编码123个氨基酸残基,N端19个氨基酸残基为信号肽。PtCystatin成熟肽有104个氨基酸残基,理论分子量为11 64030 Da,等电点pI为524,有一个Cystatin结构域。PtCystatin与I型Cystatin序列同源性高,人Cystatin A与靶酶结合的2个基序在PtCystatin中也保守（M26VPGG30,Q71VVAG75）,C端无二硫键。组织表达差异分析显示PtCystatin在胃中表达量高,其次为肝胰脏、鳃、血细胞,肌肉和眼中表达量低。致病菌副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）诱导3 h,血细胞PtCystatin表达量小幅上调121倍（P＜005）;而在6 h和12 h显著下调,分别为047倍（P<001）和057倍（P<005）;24 h恢复到诱导前水平,提示PtCystatin可能参与三疣梭子蟹的免疫防御反应,是一个免疫相关基因。     

壳寡糖对三疣梭子蟹免疫力的影响

为研究壳寡糖对三疣梭子蟹免疫功能的影响,设置了含壳寡糖0.0、0.5、1.0、1.5和2.0 g/kg（分别为T0、T1、T2、T3和T4组）的5组试验饲料饲喂三疣梭子蟹,分别在第10 d、20 d和30 d取血清进行酚氧化酶（PO）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、溶菌酶（LSZ）和过氧化物酶（POD）活性的测定,试验结束时测定血细胞的密度。结果显示,在基础饲料中添加适量的壳寡糖可以显著性提高ACP、T-SOD、LSZ、POD活力（P〈0.05）,对PO和AKP活力促进效果不显著（P〉0.05）。壳寡糖可以显著提高三疣梭子蟹血细胞密度（P〈0.05）,对3种血细胞所占比例有一定的影响（P〉0.05）。综合考虑,T2、T3组对三疣梭子蟹免疫促进效果较好,建议基础饲料中壳寡糖添加量为1.0～1.5 g/kg。     

低盐度对不同三疣梭子蟹群体幼蟹发育的影响

对野生三疣梭子蟹Portunus trituberculatus亲蟹繁育的Ⅱ期幼蟹进行低盐度胁迫,发现其120 h的半致死盐度为11.7,并比较了“黄选1号”三疣梭子蟹和低盐适应群体三疣梭子蟹在低盐度（11.7）水中和正常海水（盐度为35.0）中的存活率、变态率和生长状况.结果表明：“黄选1号”在盐度为11.7时的存活率比在正常海水中低,低盐适应群体在盐度为11.7时的存活率与在正常海水中差异不明显;在盐度为11.7的水中,两个群体幼蟹的变态率与生长指标均低于在正常海水中.试验结束时,“黄选1号”在低盐度（11.7）水中的存活率、变态率、全甲宽分别为20.00％、10.00％、（17.47±1.11） mm,在正常海水中的存活率、变态率、全甲宽分别为52.22％、53.33％、（20.43±1.21）mm;低盐适应群体在低盐度（11.7）水中的存活率、变态率、全甲宽分别为32.22％、13.33％、（17.69±0.93） mm,在正常海水中的存活率、变态率、全甲宽分别为27.98％、16.67％、（18.79±1.61） mm.研究表明,低盐适应群体抵抗低盐胁迫的能力较强,在正常海水中“黄选1号”幼蟹的存活率、变态率、全甲宽和体质量均高于低盐适应群体.     

低盐度对不同三疣梭子蟹群体幼蟹发育的影响

对野生三疣梭子蟹Portunus trituberculatus亲蟹繁育的Ⅱ期幼蟹进行低盐度胁迫,发现其120 h的半致死盐度为11.7,并比较了黄选1号三疣梭子蟹和低盐适应群体三疣梭子蟹在低盐度(11.7)水中和正常海水(盐度为35.0)中的存活率、变态率和生长状况。结果表明:黄选1号在盐度为11.7时的存活率比在正常海水中低,低盐适应群体在盐度为11.7时的存活率与在正常海水中差异不明显;在盐度为11.7的水中,两个群体幼蟹的变态率与生长指标均低于在正常海水中。试验结束时,黄选1号在低盐度(11.7)水中的存活率、变态率、全甲宽分别为20.00%、10.00%、(17.47±1.11)mm,在正常海水中的存活率、变态率、全甲宽分别为52.22%、53.33%、(20.43±1.21)mm;低盐适应群体在低盐度(11.7)水中的存活率、变态率、全甲宽分别为32.22%、13.33%、(17.69±0.93)mm,在正常海水中的存活率、变态率、全甲宽分别为27.98%、16.67%、(18.79±1.61)mm。研究表明,低盐适应群体抵抗低盐胁迫的能力较强,在正常海水中黄选1号幼蟹的存活率、变态率、全甲宽和体质量均高于低盐适应群体。     

饲料中DHA/EPA对三疣梭子蟹肝胰腺组织结构的影响

通过在三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)卵巢发育期间投喂添加半纯化鱼油配制的含不同比例DHA/EPA(0.39、1.24、2.19、2.89)的饲料,并以投喂新鲜缢蛏作为对照,研究了不同饲料组喂养的三疣梭子蟹的肝胰腺组织学差异。结果表明,饲料中DHA/EPA能显著影响三疣梭子蟹的肝胰腺指数(HIS)和肝胰腺细胞的组成,随着DHA/EPA的升高,HSI先升高后下降,同时肝胰腺中R细胞所占比例也呈先上升后下降趋势;而B细胞所占比例随DHA/EPA升高而升高,在Diet4组达到最大值。当DHA/EPA比例为2左右(Diet3组)时,卵巢发育最好,肝胰腺指数最大,最有利于营养物质储存。     

三疣梭子蟹雌激素相关受体基因在蜕皮过程中的表达分析

雌激素相关受体(ERR)在甲壳动物蜕皮过程中可能起着重要的调节作用,但是尚不清楚该基因在三疣梭子蟹不同组织和不同蜕皮阶段的表达模式。本文采用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术研究了三疣梭子蟹雌激素相关受体(Pt ERR)基因在不同组织和不同蜕皮阶段的表达情况。结果表明,Pt ERR-mRNA在C期三疣梭子蟹的Y器官和鳃中表达水平最高,其次眼柄和胃中表达水平也相对较高,在3种肌肉组织和三角膜中表达水平较低。在不同蜕皮阶段,13种组织中的Pt ERR-mRNA表达水平均差异显著。Y器官中Pt ERR-mRNA从AB期到E期呈显著上升趋势;胸神经节和眼柄中的Pt ERR-mRNA变化模式均为先上升后下降趋势,大颚器中的Pt ERR-mRNA变化趋势为先下降后上升;大螯肌肉、附肢肌肉和三角膜中的Pt ERR-mRNA表达水平均呈显著升高趋势,而腹部肌肉中Pt ERR-mRNA为先下降后上升趋势;就消化代谢器官而言,胃、肝胰腺和鳃中Pt ERR-mRNA在整个蜕皮周期中均为先升高后降低的趋势,其中D期达最高值;肠道中Pt ERR-mRNA相对表达量在D期最高,C期和E期较低;从AB期至E期,心脏中Pt ERR-mRNA表达水平一直显著增加,每期增加1倍左右。综上,Pt ERR主要在Y器官、鳃、眼柄和胃中表达,可能参与调控蜕皮过程、细胞增殖和能量代谢等。     

谷子ABC转运蛋白基因与抗旱关系的研究

[目的]ABC转运蛋白是一类广泛存在于生物体中最古老的蛋白家族,在植物的生长发育及抗逆胁迫中发挥着重要作用。本文旨在探究ABC转运蛋白基因与谷子抗旱性的关系,挖掘谷子抗旱基因,并为谷子抗旱分子机制的研究提供理论依据。[方法]以谷子抗旱品种勾勾母鸡咀(GG)和干旱敏感品种晋汾16(JF16)为研究材料,在苗期对二者用20%PEG胁迫处理,并取其叶片进行转录组测序,筛选出4个与ABC转运蛋白相关的差异表达基因。用生物信息学方法分析基因的基本信息、启动子顺式元件,并构建ABC抗逆相关基因的系统进化树以及对ABC转运蛋白基因进行表达模式分析。[结果]发现谷子ABC转运蛋白基因等电点范围在6.81~8.97之间,分子量范围在51 195.75~161 579.13Da;启动子中包含有许多响应胁迫的功能元件(ABA、Ethylene、GA、MeJA、Light、MYB、SA、热和低温响应元件等);在进化树分析中发现,Seita.1G039400.1和Seita.7G176000.1亲缘关系最近,其次与AtABCC5亲缘关系较近;经过干旱处理,只有Seita.7G176000.1基因在抗旱品种中表达增加,其余3个基因在抗旱品种中表达均降低。[结论]Seita.7G176000.1基因可能通过调节气孔开闭参与植物抗逆,进而调控谷子响应干旱胁迫,初步推测其为谷子ABC基因家族抗旱候选基因,为进一步研究ABC转运蛋白基因与植物抗逆性关系提供理论依据。     

西洋菜锌铁转运蛋白NoZIP1 基因的 克隆及表达研究

对西洋菜锌铁转运蛋白基因NoZIP1进行克隆及表达分析,为研究其在西洋菜生长发育过程中的生物学功能奠定基础。利用RACE技术克隆西洋菜NoZIP1基因,用生物信息学方法分析获得的基因序列结构,利用实时荧光定量PCR研究NoZIP1基因在不同组织及不同培养条件下的表达特性。结果表明,西洋菜NoZIP1基因c DNA全长1 239 bp,包含完整的阅读框,编码356个氨基酸。实时荧光定量PCR分析显示,NoZIP1基因的表达在锌或者铁胁迫条件下根、叶中均有诱导上调趋势。     

三疣梭子蟹不同地理群体线粒体DNA ND5基因序列的变异与分化

对大连、潍坊、日照和舟山4个三疣梭子蟹Portunus trituberculatus地理群体的线粒体DNA ND5基因序列进行了分析。结果表明：ND5基因序列A、T、G和C的平均含量分别为39.5%、31.5%、10.1%和18.9%,A＋T含量为71.1%,明显高于G＋C含量;共检测到16个变异位点,其中转换位点15个,颠换位点1个;氨基酸变异位点5个,其中184、235位的核苷酸突变分别引起碱性精氨酸错义成中性丝氨酸、非极性异亮氨酸错义成中性甲硫氨酸;12个测序样中有8种单倍型,核苷酸歧异度Pi为0.00289,单倍型多样性H为0.924。     

Phylogenetic relationships between purple and tea-green individuals of the blue swimming crab Portunus trituberculatus by PCR-SSCP analysis

Given the morphological characters of purple crabs identical with that of the tea-green ones except the body color, it is expected that the purple crabs and the tea-green ones were from the same species. In order to identify the phylogenetic relationships between them at the molecular level, we amplified and compared two conserved mitochondrial gene fragments of purple and tea-green crabs through PCR-SSCP and DNA sequencing analyses. The results showed that there was no distinct variation of DNA bands of both the CO1 and 16srRNA genes detected in polyacrylamide gels through SSCP analysis between purple and tea-green crab samples, and the following sequence analysis of color-different crab individuals presented 99.81% and 99.91% nucleotide sequence identity of the CO1 and 16srRNA genes respectively. These indicated that there was no species or subspecies differentiation between purple and tea-green crabs, meaning that they belonged to the same species, Portunus trituberculatus.     

连续九代家系内自交对三疣梭子蟹幼体变态和形态性状的影响

为研究自交对三疣梭子蟹Portunus trituberculatus幼体发育和形态性状的影响,通过人工定向交尾的方式,以建立的三疣梭子蟹连续1~9代家系内自交全同胞家系为材料,评价连续多代自交幼体发育和形态性状的影响。结果表明:在幼体发育方面,F1~F9代的排幼量无明显上升或下降趋势,但变态率研究中发现,溞状幼体和大眼幼体2个阶段中总体呈现衰退趋势,尤其自交家系程度高的F9代变态率最低,F9代Z1~M的4个阶段中变态率分别为74.87%、73.50%、59.17%、41.96%;在形态学方面,随着生长日龄与自交代数的增加,F3~F9代各项指标均低于F1、F2代家系,其中F9代各项指标皆为最小且与其他各代有显著性差异(P0.05),但在150日龄时对梭子蟹整齐度的研究发现,F9代甲宽、甲长、体高变异系数分别为7.636 5、7.559 1、8.328 2,在所有家系中为最小,整齐度最好;除F2代家系外,随着姊妹交系数的增加,相对于F1代,全甲宽出现-6.12%~-21.95%的衰退,甲宽衰退系数为-1.85%~-16.36%,甲长衰退系数为-10.08%~-27.66%,体高衰退系数为-9.39%~-22.70%,体质量衰退系数为-13.39%~-47.99%,排幼量衰退系数为-9.03%~-45.13%。研究表明,自交对三疣梭子蟹的幼体变态、个体形态大小和150日龄个体的生长特性产生的影响程度不同,造成一定程度的衰退。     

安氏隐孢子虫ABC2基因的克隆表达与营养物质转运

为探究安氏隐孢子虫(Cryptosporidium andersoni)ATP结合盒转运蛋白基因(CaABC2)对营养物质的转运功能,以安氏隐孢子虫基因组作为模板,设计合成CaABC2基因特异性引物,进行PCR扩增,获得CaABC2基因。将克隆的重组质粒CaABC2基因与真核表达质粒pEGFP-C1双酶切后再连接,构建重组真核质粒载体pEGFP-C1-CaABC2;再采用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-C1-CaABC2转入小鼠肠上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IEC),检测不同组IEC细胞对总胆固醇、还原型谷胱甘肽、葡萄糖和碱性磷酸酶的转运效果。结果表明:扩增出778bp的CaABC2基因,测序分析与预期片段大小一致;重组真核质粒载体pEGFP-C1-CaABC2转染小鼠IEC细胞后,观察到转染后的对照组和转染组IEC有绿色荧光;检测到在细胞内液中,转染组、对照组和空白组的总胆固醇浓度分别为15.99±0.12、11.80±0.35和12.43±0.16 mmol/L;还原型谷胱甘肽浓度分别为15.24±0.44、10.48±0.35和11.04±0.75mmol/L;在细胞外液中,转染组、对照组和空白组的总胆固醇浓度分别10.67±0.17、14.82±0.06和15.84±0.17 mmol/L;还原型谷胱甘肽浓度分别为10.20±0.79、14.60±0.45和15.60±2.50mmol/L。转染组总胆固醇、还原型谷胱甘肽浓度均显著大于空白组和对照组(P0.05),而在细胞外液中,转染组总胆固醇、还原型谷胱甘肽的浓度均显著小于空白组和对照组(P0.05)。在细胞内液和外液中,空白组与对照组总胆固醇、还原型谷胱甘肽的浓度之间均未见显著性差异(P0.05);转染组、对照组和空白组之间的葡萄糖和碱性磷酸酶浓度均没有统计学差异(P0.05)。CaABC2基因具有协助转运总胆固醇、还原型谷胱甘肽、葡萄糖和碱性磷酸酶的作用,其中转运总胆固醇效果最为明显。     

水流对三疣梭子蟹幼蟹运动行为和代谢的影响

在实验室条件下,观察了水流刺激对不同体重（小、中、大3种规格的体重分别为13．348g±1．751g、21．71g±1．247g、30．308g±3．009g）的三疣梭子蟹Portunus trituberculatus幼蟹运动行为的影响,研究了幼蟹在水流刺激（23cm／s）1h及恢复12、24h时的耗氧率、氨氮排泄率、氧氮比和血蓝蛋白含量的变化。结果表明：小、中、大3种规格幼蟹最大耐流流速分别为23．0、26．7、31．0cm／s,水流刺激对幼蟹的运动行为影响显著。当流速为23．0cm／s时,3种规格的幼蟹均在水槽底部顶流爬动;流速高于23cm／s时,小规格组幼蟹趴于拦网区不动。幼蟹的耗氧率和氨氮排泄率随体重增大而降低,在水流刺激1h后,3种规格幼蟹的耗氧率、氨氮排泄率和血蓝蛋白含量均下降,而氧氮比升高;静水中恢复12h,其氧氮比恢复至正常,耗氧率、氨氮排泄率和血蓝蛋白含量升高,至24h恢复到正常水平;与对照组相比,水流刺激1h后和恢复12h时幼蟹的耗氧率、氨氮排泄率差异显著（P〈0．05）,恢复24h后无显著差异（P〉0．05）。     

不同地理群体三疣梭子蟹非特异性免疫功能的比较

测定了海州湾、辽东湾、舟山沿海和莱州湾4个野生群体三疣梭子蟹(Porttmus tritubercalatus)的血淋巴、肌肉和肝胰腺组织中的抗氧化及其它与非特异性免疫相关的酶活指标,并对这些指标在不同群体间的差异进行了比较.结果发现:海州湾群体的三疣梭子蟹肝胰腺SOD酶活显著高于莱州湾群体(P<0.05).而与其它两个群体差异不显著;而血淋巴和肌肉组织SOD酶活各个群体间差异均不显著(P>0.05).海州湾群体血淋巴和肝胰腺组织GSH-px酶活显著高于莱州湾群体(P<0.05),而与其它群体差异不显著(P>0.05).不同地理群体三疣梭子蟹各体组织中MDA含量、LSZ和ALP酶活均没有显著性差异(P>0.05).笔者全面比较了4个地理群体三疣梭子蟹免疫相关酶活指标的差异,揭示了不同地理群体三疣梭子蟹免疫、抗病能力差异的内在因素.     

三疣梭子蟹呼吸器管的组织学研究

三疣梭子蟹的呼吸器官主要是鳃，两侧对称排列，每侧八枚。除第二枚关节鳃的鳃轴在一侧外，其余几枚的组织结构均相似，最外层为薄层角质膜，其深层为单层上皮。从鳃的横切面观察，背面血管为人鳃血管，腹面的为出鳃血管，连接这两条血管的结缔组织为鳃轴。鳃轴向两侧（或一侧）生出数条鳃丝。鳃丝主要由柱细胞和上皮细胞构成。扫描电镜观察发现，入鳃血管的侧壁上有成列的卵圆形孔，这些孔与鳃丝相通。采用汞溴酚蓝等４种方法，对上