应用正交设计优选秸秆降解菌组合

为了探索利用正交设计筛选秸秆降解菌组合的方法,优选产纤维素酶和木质素酶的秸秆降解菌的组合。利用正交设计以玉米秸秆粉为发酵底物,检测分析不同组合的降解率及酶活;采用平板拮抗试验测定组合内菌株间的拮抗作用,检测筛选的效果。结果表明,降解菌不同组合之间玉米秸秆降解率存在着极显著的差异。筛选出最佳组合为A1B3C1D4E1F2G1,即接种量F-11为1 mL,XX-10为2.0 mL,G-09为1.0 mL,降解率超过对照10%以上。部分降解菌菌株之间存在一定的拮抗作用,秸秆降解率与组合内降解菌株的组成有关。正交试验设计是筛选秸秆降解菌最佳组合的一种有效方法,筛选出的降解菌最佳组合秸秆降解能力强,具有较好的开发利用价值。     

高效降解纤维素菌系的筛选分离及复合菌系的构建

为了从土壤及腐烂的秸秆中筛选一组高效降解纤维素的复合菌系,并研究其在天然纤维素中的应用。通过采用刚果红染色液法对分离的菌株初步筛选,利用DNS法测定纤维素酶活力。选取无拮抗高效降解纤维素菌株进行组合培养构建降解纤维素复合菌系。结果表明,3株真菌混合培养后酶活力效果优于单一菌株。经过形态学和分子生物学鉴定,真菌F1为葡萄座腔菌(Botryosphaeria)、F2为米根霉(Rhizopus oryzae)及F5为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。复合培养后,在碳源为秸秆时,单菌株酶活值分别为F1 39.2 μmol/mL,F2 31.4 μmol/mL,F5 40.6 μmol/mL,真菌组合F1+F2+F5培养后酶活值为50.12 μmol/mL,复合真菌系酶活值比F5单菌株提高了23%。通过实验研究得出复合菌系对纤维素的降解效果优于单一菌株,菌株F1、F2和F5具有潜在的开发价值。     

高产纤维素酶菌株筛选及诱变选育

为了得到高产纤维素酶的菌株,达到缓解纤维素酶活不高、纤维素酶供不应求现状的目的。从自然界中筛选出较优良的产纤维素酶菌株并对其进行紫外、60Co-γ射线诱变选育获得高产纤维素酶活的突变株。从自然界筛选出来的菌株通过菌落、菌丝体以及孢子丝的形态初步鉴定为放线菌并命名为XZ-33。对XZ-33进行复合诱变选育并根据致死率和诱变剂量以及正突变率的相互关系,得出合适的诱变剂量即：紫外照射7 min,辐照剂量为0.6 KGy的γ射线对产纤维素酶的出发菌进行诱变,得到高产纤维素酶的突变株UV-Co16,其CMCase酶活达到66.15 IU/mL,以及PFAase酶活2.91 IU/mL,分别是出发菌的3.17倍和2.42倍。该突变株的获得为微生物发酵生产乙醇奠定了基础。     

一株纤维素降解菌的筛选与鉴定

为了解决玉米秸秆降解率低下问题,本研究从以氨基酸尾液为氮源的自然发酵堆肥中筛选稳定的纤维素降解菌,为制备高效的秸秆腐熟剂奠定基础。采用刚果红染色法进行初筛、采用纤维素酶活测定及玉米秸秆降解率测定来进行复筛,并通过形态学及分子生物学方法对高效降解菌株进行鉴定。结果表明筛选得到一株高效降解纤维素的菌株SC2,其滤纸酶活、内切葡聚糖酶活、外切葡聚糖酶活和β-葡聚糖苷酶活分别为17.70、58.97、16.85和79.26 U/mL,对玉米秸秆的降解率达到33.07%,根据其菌落特征、产孢结构、孢子形态及ITS序列鉴定SC2为黑曲霉(Aspergillus niger)。菌株SC2具有较好的纤维素降解能力,能够有效的促进秸秆的降解,可以用于制备玉米秸秆腐熟剂。     

云南松毛虫肠道产纤维素酶菌株的筛选鉴定及酶学性质

从云南松毛虫肠道中分离筛选得到28株产纤维素酶的菌株。经生理生化试验观察和16S rRNA序列比对分析,初步鉴定这些产酶菌株属于肠杆菌属、芽孢杆菌属、克雷伯氏杆菌属和约克氏菌属。同时筛选出一株产酶能力较高的菌株DK4,鉴定为蜡状芽孢杆菌,并构建系统发育树。对该菌株产酶特性进行了初步研究,其酶反应的最适温度是35℃,最适pH值7.0,连续发酵70 h左右时纤维素酶活达到最高值19.24 U/mL。     

耐高温木质纤维素降解菌株的分离筛选、鉴定及降解工艺的研究

本研究旨在筛选出在高温条件下具有较强木质纤维素降解酶活性的细菌菌株,探究其降解秸秆木质纤维素的特性。从太白山林区温泉采集土壤样品并在高温条件下进行富集培养,利用脱色圈试验和比色法筛选出目标菌株,通过形态观察和16S rDNA序列分析鉴定菌株种类。对高温富集初筛所得菌株的纤维素酶、漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶活性进行测定。菌株X-08的纤维素酶活为0.02872 U/mL,菌株M-17的MnP、LiP和Lac酶活分别为51 U/mL、672 U/mL和192 U/mL。鉴定出菌株X-08为Anoxybacillus rupiensis,M-17为Geobacillus thermocatenulatus。采用双菌降解玉米秸秆,20天后木质素和纤维素的降解率分别达到24.51%和20.47%。研究结果为农业废弃物生物降解提供了新的细菌菌种资源,并为秸秆中木质纤维素的降解处理方法提供了新的思路。     

湖水中低温菌的筛选及其产酶特性

为了探索湖水中低温微生物及其酶活的多样性,并获得具有应用价值的低温菌。以低温环境下湖水为样品,通过平板涂布法和划线分离法对其进行初步分离纯化,进一步进行菌落形态、微观形态观察以及生理生化性质的测定,筛选出能够在低温下生长的菌株。并进行蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、木质素酶功能的测定。结果显示共筛选出可培养的低温微生物22 株,包括细菌14 株,真菌5 株,放线菌3株。7 株具有蛋白酶活性,3 株具有淀粉酶活性,6 株具有木质素酶活性,6 株具有纤维素酶活性。其中WF-1 具有四种酶活性,WB-8 具有三种酶活性,其他菌株具有一种或者两种酶活力。筛选的低温菌株具有多种酶活性,具有潜在的开发价值。     

产漆酶菌株的筛选及其对烟秆降解效果的研究

为烤烟秸秆中木质素降解提供理论依据,丰富降解木质素的真菌资源。从腐殖质中分离高产漆酶的木质素降解真菌1株,对其进行形态学鉴定,并对其液态发酵产漆酶培养条件进行优化和对碳、氮源和Cu²⁺进行正交试验,最后测定了该株菌对烤烟秸秆的降解情况。结果表明：（1）该株真菌形态学鉴定为半知菌亚门,粘头霉属(Moniliales Gliocephalias sp.)命名为Z-1。基础培养基中产漆酶的最大值出现在液态发酵第4天,酶活为2.72 U/mL。（2）单因素试验中Z-1最适宜产酶发酵条件为：麦芽糖25 g/L、酵母膏10 g/L、Cu2 +浓度2.5 mmol/L。（3）正交试验中,培养基麦芽糖30 g/L、酵母膏12 g/L、Cu2 +浓度2.5 mmol/L处理产酶最高,酶活为3.24 U/mL,较基础培养基中高出18.89%。（4）液态发酵菌株对烟秆粉末降解30天后,失重率50%、木质素降解率39.39%、纤维素降解率36%。该株真菌产酶较高,对烤烟秸秆降解能力较强。     

一株兼性厌氧纤维素酶产生菌的筛选、鉴定及其酶学性质研究

从牛瘤胃内容物中筛选出一株兼性厌氧纤维素酶产生菌CR-14,根据形态特征、生理生化特征和16 S rDNA序列分析鉴定为纤维单胞菌(Celloulonmonassp.)。该菌株所产纤维素酶中主要组分酶包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶,其中CX酶酶活最高,C1酶和β-葡萄糖苷酶酶活较低。该酶的最适反应条件为温度50℃、pH6.0;在60℃以下、pH6.0~7.5条件下性能稳定;Mn2+、Fe2+能显著促进该酶的活力,Zn2+、Cu2+、Ca2+、K+对酶活力有抑制作用。     

产纤维素酶细菌的筛选鉴定与特性分析

为了筛选获得产纤维素酶细菌,为新型饲料添加剂的开发提供材料基础。本研究以玉米田土壤为样品,使用刚果红平板法筛选产纤维素酶细菌并分析其所产酶的特性。通过试验,筛选获得产纤维素酶菌株,经形态学和分子生物学法将其鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。对巨大芽孢杆菌XT2所产纤维素酶进行酶学特性分析,发现其最适反应条件为50℃,pH 6.0,具有一定的热稳定性,K⁺对纤维素酶具有激活作用,Mg²⁺、Ca²⁺和Mn²⁺对酶活具有抑制作用。该菌生长至20 h时,所产纤维素酶活力最高,达到0.774 U/mL。该产纤维素酶芽孢杆菌的成功分离获取为饲料新资源的开发以及新型饲料添加剂的研制提供了菌种材料。     

高效玉米秸秆降解菌复合系的构建

依据秸秆降解所需的酶系及微生物之间的协调性,通过增加菌种多样性,实现秸秆降解菌剂的高效稳定;首先采用驯化和分离纯化的方法,得到不同的天然菌群和单菌株,然后将其进行有效的组配和限制性继代培养,以构建秸秆降解复合菌剂。结果表明,通过单菌种组配,得到由纤维素降解菌Y11-4和X2、木质素降解菌L3、酵母菌J6组成的秸秆降解率最高的菌种组合:Y11-4+X2+L3+J6。以秸秆为唯一碳源进行限制性继代培养,依据pH恒定,得到5种分别来自腐烂秸秆、森林土、菜园土、竹林土及麦田土的驯化系。通过菌系组配,得到了一个来源于森林土、竹林土和腐烂秸秆的驯化系组合,其秸秆降解率为38.3%。进一步将驯化系组合与单菌株组合复配并限制性继代培养,得到的秸秆降解复合菌剂在14天内秸秆降解率达到45.7%。结果表明,通过增加菌种多样性和继代培养构建秸秆降解复合菌剂是行之有效的方法。     

秸秆降解菌系的筛选及其对酸碱度的响应

为给冷凉地区秸秆还田提供菌株资源,以常年处于低温环境的土壤与富含纤维素的腐烂物为菌源,以富集、继代培养方法筛选秸秆降解菌系和生产中主推的秸秆腐熟剂为试材,在15℃和20℃,pH 4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5条件下发酵秸秆,每隔24 h测定发酵液OD₆₀₀值,发酵15天测定滤纸酶、纤维素酶活性和秸秆降解率,探讨其对玉米秸秆的降解效果。结果表明,继代培养5~6代菌系分解纤维素的速度加快;15℃ 2种试材不同pH发酵液OD₆₀₀值第6天达到峰值,最高峰值均在pH 7.5;20℃ 2种试材不同pH发酵液OD₆₀₀值第7天达到峰值,秸秆降解菌系8号最高峰值为pH 8.5,秸秆腐熟剂最高峰值为pH 5.5。15℃ pH 8.5秸秆降解菌系8号滤纸酶活性显著高于秸秆腐熟剂;pH 7.5秸秆降解菌系8号纤维素酶活性显著高于秸秆腐熟剂;而秸秆腐熟剂纤维素酶活性在20℃ pH 4.5时高于秸秆降解菌系8号。15℃和20℃条件下,秸秆降解菌系8号pH 7.5秸秆降解率高,而秸秆腐熟剂为pH 4.5和pH 5.5秸秆降解率高;相同发酵条件下,秸秆降解菌系8号秸秆降解率显著高于秸秆腐熟剂。秸秆降解菌系8号降解秸秆适宜条件为中低温中性偏碱性,而秸秆腐熟剂为中温偏酸性。     

玉米秸秆混合发酵产酶条件的优化

为了显著提高纤维素酶的酶活,采用固态发酵的方法,深入研究了玉米秸秆预处理后的成分变化以及固液比,温度,pH等对发酵产酶的影响。结果表明,选择膨化预处理之后的秸秆混合发酵产酶的较优工艺条件为：固液比为1:(1.5~2)之间;pH 3~5;接种量为20%;秸秆:麸皮为1:1;硫酸铵含量为1.5%。在这些条件发酵之后的玉米秸秆,酶活为300 U/g。为下一步的玉米秸秆混合发酵产酶的中试实验提供理论依据。     

高产核酸酶菌株的分离、筛选与诱变育种

为获得具有自主知识产权,满足生产需求的高产核酸酶P1的菌株。以2%RNA作为唯一碳、氮源的筛选培养基,从桔园土壤中初步筛选出65株具有产生核酸酶P1的菌株。结果表明：以其中酶活较高的YC34号菌株为出发菌株,该菌株的初始酶活性为127.3 U/mL,通过紫外诱变、微波诱变、LiCl诱变3种方式依次进行复合诱变处理后,获得酶活最高的突变株YC34-1,其粗发酵液的酶活达到360.7 U/mL,较原始出发菌株酶活增长了183.3%,具有良好的应用开发潜力。经初步形态学鉴定该菌株可归属为青霉属柑桔青霉(Penicillium citrinum)。     

松毛虫肠道产蛋白酶菌株的筛选鉴定及培养条件研究

为了获得产蛋白酶能力高的细菌资源。采用酪蛋白平板法从松毛虫肠道中分离筛选得到16株产蛋白酶的菌株。通过比较透明圈大小和测定发酵后酶活力,筛选出一株产酶能力较高的菌株2N01。根据序列比对结果,构建关于2N01的系统发育树,将其鉴定为Enterobacter hormaechei。研究培养条件对该菌株生长的影响,确定2N01产酶培养的最适温度是40℃,最适pH 8.0,培养72 h左右出现产酶峰值,酶活力达50.07 U/mL。通过研究表明,菌株2N01是产蛋白酶的较好材料,具有一定的应用前景。     

一株有机磷农药高效降解菌的筛选及酶学性质研究

为了从有机磷农药严重污染的土壤中分离筛选出一株有机磷农药高效降解菌,并对其进行鉴定及其酶学性质研究。通过有机磷农药驯化培养、形态学和生理生化特性及其16S rDNA序列分析等试验对其进行了初步鉴定,并初步研究了pH值、温度、底物及金属离子等外界因素对其粗酶液酶学性质的影响。分离筛选出一株有机磷农药高效降解菌J7-4,经形态学和生理生化特性及其16S rDNA序列分析等试验,初步将其鉴定为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri),其降解酶为胞内酶,该酶最适pH为9.0,最适反应温度为45℃;最适底物为甲基对硫磷,并且该酶具有广谱降解特性;Mg2+、Ca2+等金属离子对其有不同程度的激活作用,Co2+、Cr3+对该酶有轻微的抑制作用,而Mn2+、Fe3+、Zn2+、Al3+、Hg+、Cd2+、Ba2+、Ag+对该酶有强烈的抑制作用。成功地从有机磷农药严重污染的土壤中分离筛选出了一株有机磷农药高效降解菌J7-4,并对其降解酶的性质进行了初步研究。     

蛋白酶产生菌的筛选及酶学性质研究

从养牛厂附近的土壤中分离得到一株产蛋白酶性质优良的菌株,初步鉴定为芽孢杆菌,对其最适产酶条件进行了研究。试验表明,最适碳源为玉米粉,最适氮源为玉米浆,300mL摇瓶最适装液量为60mL,最适接种量为2%,起始pH值为4.5和6.5时有2个产酶高峰,并对其进行酶学性质的研究。该酶最适温度为65℃,最适pH值为7.5,该酶在50℃以下保温30min酶活仍较高,在70℃以上酶活全部丧失。在pH值7.0～9.0时比较稳定,而在pH值5.0以下时酶活下降很快。金属离子Pb2+,鳌合剂EDTA能抑制蛋白酶的活性,而Fe2+能激活蛋白酶活性。     

寒地水旱轮作及秸秆还田对土壤相关酶活性的影响

以黑龙江省水稻→玉米轮作系统为研究对象,结合秸秆还田长期定位试验,研究了水稻→玉米轮作及秸秆还田对土壤酶活性的影响,为确定适宜的寒地水稻→玉米轮作技术模式提供理论支撑。试验结果表明,与水稻连作相比,水稻→水稻→玉米轮作提高了土壤碱性磷酸酶和乙酰基β-葡萄糖胺酶活性;与玉米连作相比,水稻→水稻→玉米轮作降低了木聚糖酶活性。秸秆还田条件下,玉米连作处理提高了过氧化氢酶（CAT）活性,而水稻→水稻→玉米轮作和水稻连作处理却降低了土壤CAT活性;秸秆还田条件下,玉米连作处理降低了乙酰基β-葡萄糖胺酶活性,水稻→水稻→玉米轮作处理提高了蔗糖酶活性。