流式细胞术检测芜菁倍性与相对DNA含量方法

为探究合适的解离液类型用于流式细胞术检测芜菁倍性与相对DNA含量,明确新疆地区主栽芜菁品种的DNA含量和倍性,同时检测游离小孢子培养所获得的再生植株倍性。本研究选取‘阿恰芜菁’、‘温州盘菜’及小孢子培养所获得的再生植株群体为试验材料,在常用的10种解离液中筛选适合芜菁的解离液类型。LB01适合作为流式细胞术检测芜菁样品的最适解离液。以四倍体紫花苜蓿‘金皇后’为外标,检测芜菁的DNA含量及倍性后发现‘温州盘菜’的DNA含量为0.657 pg,倍性为二倍体。‘阿恰芜菁’的DNA含量为0.723 pg,倍性为二倍体。小孢子再生群体Ⅰ的DNA含量为0.626 pg,倍性为二倍体。小孢子再生群体Ⅱ的DNA含量为2.225 pg,倍性为四倍体。本研究为流式细胞术检测芜菁倍性和DNA含量的方法提供了数据参考,也将为芜菁群体变异、种质资源评价和新品种选育等研究提供基础。     

澳洲坚果种质资源的SRAP分析及指纹图谱构建

为了分析澳洲坚果种质资源的遗传多样性及其亲缘关系,加速澳洲坚果种质的遗传改良和新品种选育,本研究以45份澳洲坚果为材料,利用相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism,SRAP)分子标记对其基因组扩增并进行遗传多样性分析。结果表明24对引物组合中能筛选出多态性较好的引物10对,利用这10对引物在45份澳洲坚果中共扩增出63条谱带,其中多态性条带47条,多态性比率74.60%。45份澳洲坚果种质资源的遗传相似系数范围为0.5873?0.9683,均值0.7778。UPGMA聚类分析表明:在遗传相似系数为0.785处可将45份澳洲坚果种质资源划分为6个类群,其中,‘黔澳1号’和‘黔澳3号’之间的遗传相似系数最大,高达0.9683,说明这两种坚果资源遗传背景相似,‘兴澳1号’和‘黔引36’号间的遗传相似系数最小,仅为0.5873,说明二者亲缘关系较远。本研究表明了SRAP技术适用于澳洲坚果种质资源的遗传多样性分析且45份澳洲坚果间的遗传变异较为丰富,为澳洲坚果种质资源的挖掘、遗传改良和进一步的分子辅助育种提供了科学依据。     

望谟地区澳洲坚果花粉生活力和开花生物学特性

以‘Kau (344)’、‘Pahaha (788)’、‘H2’、‘桂热1号’4个不同澳洲坚果品种为材料,分析花粉生活力和开花生物学特性。澳洲坚果的花粉粒呈现三角形或近三角形,形态观测法显示‘344’花粉生活力最强,联苯胺染色法显示‘H2’花粉生活力最大为90.35%,综合来看,利用联苯胺染色法澳洲坚果的花粉生活力最强,是一种比较适合测定澳洲坚果花粉生活力的方法。澳洲坚果开花期集中在3月上旬至4月中旬,变异系数由大到小依次是:初花期花期长度末花期盛花期坐果期。在所观测的澳洲坚果品种中,‘H2’小花开放顺序是由花序轴中部向两端依次开放,而‘788’‘、344’‘、桂热1号’均是自花序轴基部向顶端依次开放。‘H2’、‘桂热1号’的小花颜色是白色,‘344’、‘788’小花颜色是乳白色,4个澳洲坚果品种均存在不同批次开花现象。澳洲坚果的花序长度变化范围在17.90～20.63 cm之间,小花长度在12.33～13.27 mm之间,花柄长度在2.70～2.90 mm之间,单个花穗小花数在191～227朵之间。掌握开花生物学规律对指导实际生产、合理配置品种及杂交育种等方面具有重要参考意义。     

干热河谷地区澳洲坚果果实发育特性及落果调查

为研究澳洲坚果在云南省干热河谷地区果实生长规律以及落果规律,同时为干热河谷地区澳洲坚果的生产提供理论依据以及科学指导,以3 个澳洲坚果品种‘HASE695’、‘HASE900’、‘Own Choice’为材料,对果实生长特性及落果特点进行调查。结果表明：澳洲坚果果实生长膨大的关键时期为4 月中下旬—5 月中旬,增长了1.38~1.54 cm;在潞江坝干热河谷地区澳洲坚果存在2 个落果高峰期,第1 落果高峰期主要以授粉受精不良以及果实快速生长营养不良导致,第2 高峰期则主要表现为熟前落果,HASE695’、‘HASE900’、‘Own Choice’在这期间的落果分别占落果总数的2.7%、2.11%、4.51%,这期间澳洲坚果果实已经达到恒定大小。研究发现,澳洲坚果的保果措施应该主要针对这一期间进行深入研究,使落果减少,提高产量。     

应用流式细胞术测定药用植物黄芩基因组大小

为了探讨和优化应用流式细胞术(FCM)测定药用植物的基因组大小（或称C值）的方法,本文分别以新鲜、幼嫩和硅胶干燥的叶片为材料,采用Otto和LB01两种细胞核提取液,利用流式细胞术对黄芩C值进行测定。结果表明,选用豌豆为内标植物时,相比LB01一步法,Otto两步法在低温提取、离心和保存条件下,碘化丙啶染色浓度为0.02 mg/mL,得到的细胞核散点图相对集中,碎片较少,容易准确取门,CV较小。不同提取材料表明,幼嫩叶片和新鲜叶片利用Otto二步法均能到高质量的细胞核悬液,细胞核数量多且散点图集中,有利于取门和测定的C值更准确。而干燥叶片提取的细胞核得到的散点图分散,无法准确取门和测定C值。最终,以黄芩为例系统地优化了利用流式细胞术测定药用植物基因组大小的方法,并首次成功测定黄芩1C值为0.58 pg,基因组大小约为562 Mbp,从而为了解物种的遗传背景和基因组值在系统演化中的变化规律,以及黄芩属药用植物资源的遗传评价和保护利用等方面的研究提供理论基础。     

澳洲坚果bHLH基因家族成员MibHLH48的结构与功能分析

bHLH (Basic/helix-loop-helix)转录因子具有螺旋-环-螺旋结构,在植物中参与调控植物体生长发育、信号传导和抗逆生理等过程。澳洲坚果含有丰富的具有药用和保健价值的营养物质,但其产量和品质问题影响了澳洲坚果产业在中国的发展。为分析bHLH家族成员在澳洲坚果产量形成中的结构与功能,本研究采用电子克隆技术对MibHLH48进行组装拼接,并利用生物信息学方法对其结构进行分析预测。结果表明,MibHLH48 cDNA全长为1 838 bp,开放阅读框的长度为669 bp,共编码222个氨基酸;MibHLH48蛋白存在bHLH结构域,定位于细胞核、无信号肽、无跨膜结构的稳定亲水的bHLH家族蛋白。同源分析表明MibHLH48与荷花NnbHLH48氨基酸序列同源性最高。系统进化分析将MibHLH48与拟南芥AT3G-57800.1 (bHLH060)、AT2G42300.1 (bHLH048)聚为一枝。利用转录组数据分析MibHLH48基因在‘桂热一号’和‘695’澳洲坚果品种枝条、花和叶片中的表达模式表明,MibHLH48在‘桂热一号’品种花中的表达量最高,‘695’品种花中的表达量最低。推测MibHLH48与澳洲坚果产量形成相关。研究结果为研究MibHLH48基因在澳洲坚果中花发育的机理和产量形成机制的作用打下基础。     

澳洲坚果果仁中4种关键微量元素的FAAS法测定

为探明澳洲坚果果仁中Fe、Mn、Cu、Zn 4种关键微量元素的含量及其测定方法,运用火焰原子吸收分光光度法(FAAS),采用干灰化、混酸消解、微波消解3种不同样品消解方式,对4个澳洲坚果品种果仁中Fe、Mn、Cu、Zn的含量进行了测定。结果表明：Fe、Cu经3种不同消化方式处理后的含量测定结果无显著差异;而Mn、Zn经微波消解处理后的测定值虽然略高于干灰化和混酸消解2种方式,但未达到显著水平;澳洲坚果果仁中4种微量元素的含量为Mn>Fe>Zn>Cu,其中Mn元素含量在品种间的变异较大;在4个供试品种中,‘云澳51号’的Fe含量为最高,而‘云澳58号’的Mn、Cu、Zn 3种微量元素含量均为最高。3种样品消解方式均可用于澳洲坚果果仁微量元素含量的FAAS法测定。     

澳洲坚果组织培养研究初报

以澳洲坚果为供试材料,从澳洲坚果成年树上取含芽茎段进行组织培养,通过采用不同灭菌方法在培养基中添加不同浓度的激素,探索研究澳洲坚果的快速繁殖方法。结果表明,采用升汞直接浸泡可获得较好的灭菌效果。以1/2MS培养基为基本培养基,并添加2.0 mg/L BA和1.0 mg/L GA3可有效提高澳洲坚果外植体的萌芽率、增殖率和芽苗伸长长度。通过对澳洲坚果组织培养的研究,可为未来澳洲坚果的快速繁育和推广提供参考依据。     

改良CTAB法用于苹果果实基因组DNA的提取

针对苹果果实多糖、多酚含量高的特性,以成熟期‘澳洲青苹’果实为材料,嫩叶作为对照,采用三种改良CTAB法提取苹果果实基因组DNA。实验表明,方法三提取的DNA效果最佳。该方法综合了多步除杂步骤,即在细胞裂解前加入干扰物清除液,提高β-巯基乙醇、PVP的浓度抑制多酚氧化,沉淀DNA时加入1/10体积3 mol/L Na AC,有效去除了果实中多糖和多酚等物质。紫外分光光度计检测和琼脂糖凝胶电泳表明,提取的DNA纯度较高、完整性好。以所提取的DNA为模板,用ISSR引物进行PCR扩增,条带清晰。Eco RⅠ酶切检测表明,所提的DNA能被完全酶切。因此,确定方法三是适合苹果果实基因组DNA提取的最佳方法,该方法为DNA提取过程中多糖、多酚的去除提供了参考。     

马齿苋的基因组大小估算及基因组调查测序

马齿苋作为蔬菜、传统中药和动物饲料具有悠久的应用历史。然而,马齿苋的分子生物学研究一直比较滞后,缺乏组学数据是一个重要的障碍。本研究以栽培品种‘北农1号’(BN1)为实验材料,采用流式细胞术和基因组调查测序等技术对马齿苋基因组特征进行了初步研究。细胞遗传学染色体计数表明马齿苋BN1的体细胞有52条染色体(2n=52)。流式细胞术分析估算BN1的基因组大小在1 089～1 445 Mb之间。运用第二代DNA测序技术和K-mer分析,估算马齿苋BN1的基因组大小约为1 295 Mb,基因组杂合率为0.103%,重复序列含量为59.27%。本研究进一步利用获得的DNA序列数据,从头组装了一个大小为963.2 Mb的马齿苋基因组,重叠群N50长度为20.1 kb。BUSCO分析表明基因组完整度为90.4%。本研究为马齿苋的基因组测序和分子育种研究提供了有价值的数据。     

樱桃ACC氧化酶基因的克隆和序列分析

以樱桃基因组DNA为模板定向克隆其ACC氧化酶基因。对PCR扩增的目的片段用1％琼脂糖凝胶电泳检测后，进行回收、连续转化，通过蓝白筛选挑取白色菌落提取质粒DNA进行酶切鉴定，确定重组子后采用双脱氧终止法测定DNA全序列。DNA测序结果显示，樱桃的ACC氧化酶基因序列全长为1310bp，由2个外显子和3个内含子构成，外显子总长为1000bp。同源性分析可知，樱桃与桃的ACC氧化酶基因DNA序列同源性达97．8％。     

一种简单快速测定对虾白斑综合症病毒浓度方法的建立

测定出对虾白斑综合症病毒（WSSV）中基因组DNA在WSSV总质量的比例,再根据WSSV的基因组大小计算出其质量,计算出完整的WSSV病毒颗粒的质量为3.079×10^-15 g。同时测定了各个不同组分在WSSV干重中所占的比例：核衣壳包括基因组DNA和蛋白质,其比例分别为10.17%和43.07%,囊膜包括膜蛋白和各种脂类物质,比例分别为24.76%和22%;测定出WSSV悬液中WSSV浓度与其OD₆₀₀的换算关系为C=OD₆₀₀×6.79×10⁸个/μL。     

转植酸酶基因玉米phyA2基因标准质粒分子构建及其检测应用

质粒分子以其良好的适应性被较多地用作转基因标准材料的替代品。本文根据转植酸酶基因玉米phyA2基因设计引物与探针,并构建了一种包含phyA2基因片段(243 bp)和内标基因片段(178 bp)的质粒分子pPZ。选取不同转基因模板DNA作用于phyA2特异性引物,PCR结果显示只有转植酸酶基因玉米出现131 bp的目的条带;选取不同转基因作物检测体系作用于质粒分子pPZ,只有以pPZ DNA为模板时出现目的条带(131 bp和88 bp)。同时采用pPZ质粒分子和转基因玉米阳性基因组DNA为标准对4个转植酸酶基因玉米混合样品(3.0%、1.0%、0.5%和0.1%)进行定量检测,t检验表明,2种标准产生的斜率、线性相关系数和定值结果没有显著差异。这些结果表明,pPZ质粒分子可以作为转植酸酶基因玉米替代品用于定性和定量检测。     

南江黄羊体重性状的微卫星标记研究

通过10个微卫星位点，对周岁体重差异较大的南江黄羊极端个体基因组DNA进行扩增检测，方差分析寻找与体重性状显著相关的微卫星标记。然后，利用该引物对随机群体进行检测，应用线性模型计算含有相应标记个体体重性状的标记效应和替代效应。结果发现，BM3413位点的186bp和190bp等位基因、MFA70位点的109bp等位基因、INRA063位点的178bp和184bp等位基因、MB066位点的110bp等位基因、MB3501位点的176bp等位基因，这些标记基因与南江黄羊周岁体重呈极显著正相关，相关系数在0.5180～0.7375之间。BM3413位点的182bp等位基因、MFA70位点的115bp等位基因、MB066位点的98bp等位基因，这些标记与南江黄羊周岁体重呈显著（极显著）的负相关，相关系数在-0.6539～-0.388之间。     

澳洲坚果种质资源形态性状的遗传多样性分析

为了解引入澳洲坚果种质的遗传背景,以64份澳洲坚果种质为试材,采用41个形态性状对其进行了遗传多样性分析。41个形态性状的差异性和R型聚类分析结果表明：各性状间差异达到极显著水平;在欧氏距离（D）≈11.72处,41个性状聚为两组,组内各性状的欧氏距离较远,绝大多数性状间相对独立,对澳洲坚果种质的演化各具独立的意义,在澳洲坚果的分类中有较好的分辨能力。Q型聚类分析结果表明：64份种质的欧氏距离在3.15~12.39之间,具有较高的遗传多样性。在D≈12处可将64份种质划分为二个类群：第一类群仅包含T2 1份种质,为澳洲坚果栽培种的近缘种;第二类群包含剩下的63份种质,为澳洲坚果的栽培种。第二类群在D≈10处,可细分成3个亚类：第Ⅰ亚类包括7份种质（即695、Tet.-2、900、D4、HY、Tet.-1和广9）,属于粗壳种与光壳种的杂交种;第Ⅱ亚类包括A4和A16两个品种,属于粗壳种与光壳种的杂交种,但更偏重于光壳种;第Ⅲ亚类包括其他54份种质,都是光壳种的后代。获得的聚类结果与现有的分类体系一致;同时,获得了64份种质的形态性状聚类的亲缘关系图,其在生产种植中的品种搭配、育种中的杂交亲本选择和引种方面都具有指导意义。     

鸡白痢沙门氏菌与鸡伤寒沙门氏菌基因组消减文库的构建

为了解鸡白痢沙门氏菌与鸡伤寒沙门氏菌的基因组差别,筛选鸡白痢沙门氏菌特有的序列,利用SSH对鸡白痢沙门氏菌C79-13（实验方）与鸡伤寒沙门氏菌Sg9（驱动方）基因组进行了比较。选择四碱基内切酶Rsa I将C79-13与Sg9基因组DNA酶切,酶切的C79-13基因组DNA分成两份,分别与接头1和接头2R连接,然后进行两轮杂交和两轮PCR ,得到消减混合物, 将其与PCR?2.1克隆载体连接,转化感受态E.coli DH5α建立消减文库。结果共获得400个阳性克隆;筛选240个克隆制备质粒进行PCR检测,均扩增出100～2000 bp大小的片段。差异DNA消减文库的构建为进一步筛选、克隆鸡白痢沙门氏菌特异的未知新基因、建立分子鉴别新体系奠定了基础。     

基于nrDNA-ITS序列的10种枸杞属植物亲缘关系研究

以10种枸杞属植物为材料,利用nrDNA-ITS序列,探讨其遗传多样性及亲缘关系。采用改进CTAB法提取枸杞叶片基因组DNA,利用合成的ITS4和ITS5为引物对其DNA中的nrDNA-ITS区进行扩增、对目的片段测序,并对测序结果进行聚类分析。测序结果表明,10种枸杞属植物ITS的长度为582~656 bp,保守位点(C)560个,变异位点(V)95个,其中简约信息位点(Pi)70个,单核苷酸变异位点(S) 25个;5.8S序列的长度均为154 bp,保守位点(C)136个,变异位点(V)18个,其中简约信息位点(Pi)12个,单核苷酸变异位点(S)6个。10条序列聚类图明显地分为2大类5个小组,‘0901’与‘蒙杞1号’处于同一分支,亲缘关系最近,‘宁杞3号’和‘宁杞7号’为同一分支,亲缘关系最近,‘宁杞5号’和青海诺木洪黑果枸杞单独为一分支,与其他几个枸杞品种的亲缘关系最远。10条枸杞属植物的ITS序列已上传至NCBI,登录号为KJ189761~KJ189770。本研究测序和分析了10种枸杞属植物的ITS序列,聚类结果表明了它们之间的亲缘关系与差异,为枸杞遗传多样性和系统发育研究奠定了基础。     

二倍体及四倍体枳橙DNA甲基化变异的MSAP分析

为探讨染色体加倍对四倍体枳橙(Citrus sinensis (L.) Osb.×Poncirus trifoliate (L.) Raf.)叶片基因组DNA甲基化修饰的影响,明确四倍体枳橙基因组DNA甲基化水平及模式的变化特征。本研究以枳橙二倍体为对照,利用MSAP分子标记技术对同源四倍体枳橙叶片基因组DNA甲基化水平及模式变化进行分析。结果表明,10对选择性扩增引物共扩增出775条条带,二倍体和同源四倍体枳橙扩增带数分别为391条和384条,对应的总甲基化率分别为31.97%(含全甲基化率16.37%,半甲基化率15.6%)和31.25%(含全甲基化率18.49%,半甲基化率12.76%);MSAP扩增条带统计表明,同源四倍体的总甲基化率变化较小,全甲基化率高于二倍体,半甲基化率较二倍体均有所降低,相比二倍体对照,四倍体枳橙叶片基因组DNA主要发生了甲基化模式的变化。