H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的表达及纯化

参考GenBank上发表的H5亚型禽流感病毒(AIV)神经氨酸酶(NA)基因序列设计引物,PCR扩增NA基因,再将其克隆到原核表达载体pET-32a中,用E.coli BL21(DE3)原核表达,SDS-PAGE和Western-blot对表达蛋白进行鉴定.Western-blot结果表明,表达产物具有免疫学活性,蛋白的分子量约为61 kDa,位于包涵体中.包涵体经变性、复性处理,表达蛋白能与H5亚型AIV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性.ELISA检测结果表明,用此纯化蛋白作为包被抗原检测H5N1亚型AIV神经氨酸酶抗体具有良好的灵敏性.     

H1N1亚型猪流感病毒分离鉴定

用SPF鸡胚从2005-2006年采集自天津地区猪群样品中分离出3株猪流感病毒,测定了分离病毒的部分理化特性和生物学特性.3个猪流感病毒分离株均能凝集1%鸡红血球,将其制成琼脂扩散抗原与猪流感标准阳性血清反应均出现清晰白色沉淀线;经中国动物卫生与流行病学中心系统鉴定,3个毒株均为H1N1亚型,分别命名为A/Swine/...     

禽流感病毒H9亚型HN31株NS基因

为克隆和分析禽流感病毒（H9亚型）HN31株的NS基因的分子特征,通过RT-PCR方法扩增其NS基因,PCR产物与载体pMD19-T Vector连接,转化大肠杆菌DH5α,经蓝白斑筛选,调取阳性菌落,摇菌过夜,提取质粒进行PCR鉴定和酶切鉴定,送阳性重组质粒测序。结果显示RT-PCR产物大小为919 bp,HN31株的NS基因长度为890 bp;其与H6、H9亚型的A型流感病毒的亲缘关系比H5、H7、H3、H1亚型流感病毒更近。     

H9N2亚型禽流感安徽分离株CK/AH/1/10的分子特征

为了了解H9N2亚型禽流感病毒安徽分离株CK/AH/1/10基因组的分子特征,本研究采用RT-PCR方法扩增了CK/AH/1/10分离株8个片段的基因,克隆测序后进行同源性比较及遗传进化分析。结果显示:分离株CK/AH/1/10 HA蛋白的裂解位点为低致病性禽流感病毒,参照Guan等[4]对H9亚型禽流感病毒HA基因的分类标准,可将CK/AH/1/10株归属于欧亚系G9-like亚分支。     

口蹄疫病毒O/HN/93疫苗株的拯救及病毒活性鉴定

利用定点突变方法,构建含有预期突变的口蹄疫病毒O/HN/93株全长cDNA克隆,将全长cDNA的重组质粒线化后,与表达T7 RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,转染细胞盲传至第3代50 h后出现典型致细胞病变效应(CPE),第4代10 h出现典型的CPE。对收获的病毒分别用RT-PCR、分子标签测序、间接免疫荧光和电镜观察等进行鉴定,均证实成功拯救到了O/HN/93株FMDV。成功获得O/HN/93株的感染性分子克隆,为进一步研究抗原谱广、免疫原性好的候选疫苗株奠定了骨架基础。     

麻鸡新城疫病毒SX-1株F和HN基因在真核细胞中共表达研究

以山西省农业科学院畜牧兽医研究所预防兽医研究室克隆的pG-F和pG-HN质粒为模板,PCR扩增麻鸡新城疫病毒SX-1株F基因和HN基因,并以由15个柔性氨基酸构成的柔性短肽作为Linker将F及HN基因片段体外连接,插人pCI-neo真核表达载体,构建麻鸡新城疫病毒SX-1株F基因和HN基因共表达载体pCI-F-HN,...     

鸡传染性支气管炎病毒HN104株的鉴定及S1基因的分子特征

2010年4月从河南省某疑似患鸡传染性支气管炎鸡场中分离到一株病毒。通过SPF鸡胚致侏儒实验,鸡红细胞凝集试验,干扰新城疫病毒增殖试验和RT-PCR试验确认该病毒为一变异的鸡传染性支气管炎病毒。该病毒尿囊液凝集鸡红细胞的HA价为0,经胰酶处理后为27;EID50（鸡胚半数感染量）为10－5.5/0.1 mL;能够显著干扰鸡新城疫病毒La Sota株在鸡胚中的增殖;动物回归试验结果显示该病毒可致SPF雏鸡出现肾脏肿大,呈花斑肾。其S1基因全长为1617 bp,经序列分析发现与鸡传染性支气管炎疫苗Massachusetts株、T株、4/91株亲缘关系较远低于78%。     

新城疫病毒La Sota株HN基因的克隆与序列分析

旨在从分子生物学角度进一步研究新城疫病毒La Sota株HN基因,探究NDV La Sota HN基因的遗传变异情况。研究以试验室冻存的p NDV-HN为模版,根据Gen Bank中登录的NDV La Sota株序列设计引物扩增HN基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行鉴定,对鉴定正确的重组质粒p MD-NDV-HN进行测序分析。应用生物信息学软件对新城疫病毒Lasota株HN基因进行系统进化树分析、氨基酸序列同源性分析、糖基化位点、蛋白结构跨膜区分析及磷酸化位点预测分析。核苷酸序列测定结果表明:HN基因的序列长度为1743bp,该基因的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)总长为1716 bp,编码571个氨基酸。生物信息学表明:试验获得的HN基因具有6个潜在糖基化位点及12个半胱氨酸残基,第5个潜在糖基化位点(508-510 aa)发生缺失及第123位半胱氨酸残基被色氨酸残基取代。La Sota株HN基因编码的蛋白质中有29个丝氨酸、10个酪氨酸和16个苏氨酸可能成为蛋白激酶磷酸化位点。将试验获得的La Sota株HN基因序列和推导的氨基酸序列与新城疫毒株的HN基因相应序列比较后发现,它们的核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性最高均可达到99%,表明HN基因在种属间具有较高的保守性。研究为新城疫病毒的分子病毒学研究奠定了基础。     

H5N1亚型禽流感病毒核衣壳蛋白(NP)基因的进化及原核表达

参考GenBank上H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的核衣壳蛋白(NP)基因序列设计引物,PCR扩增NP基因,对其进行序列分析并构建分子进化树。将克隆的NP基因插入原核表达载体pET32a,在大肠杆菌中进行诱导表达,对诱导表达的NP重组蛋白进行纯化、Western-Blot鉴定及免疫原性分析。结果表明,克隆的NP基因与GenBank上发表的另外2个河南AIV毒株亲缘关系较近,诱导表达的NP重组蛋白主要以可溶性形式存在,分子量约为70 kDa,并且能够与H5亚型AIV阳性血清发生特异性反应,具有良好的抗原性。     

H5N1亚型禽流感病毒HA基因DNA疫苗的构建和活体电击免疫试验初报

将高致病力禽流感病毒A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)的HA基因克隆到质粒pcDNA4/His鄄Max和pRc/CMV上得到真核表达质粒pC4H5和pCMVH5。将pC4H5和pCMVH5经活体电击和肌肉注射接种于3周龄SPF鸡的右腿内侧,并设空白质粒对照。二次免疫后第二周用104.2ELD50的同源病毒进行攻击。结果pC4H5和pCMVH5活体电击免疫SPF鸡能诱导产生持续表达的高水平特异性抗体,可产生100%的保护率,并能有效地阻止H5N1病毒攻击后病毒在泄殖腔的排出,而肌肉注射组和空白对照组在攻毒后全部发病并死亡。结果表明活体电击免疫是一条可以与基因枪免疫相媲美甚至优于基因枪免疫的有效免疫途径。     

H5N1型禽流感病毒HA基因克隆及序列分析

为从分子生物学角度进一步研究H5N1型禽流感主要抗原HA基因,探究H5N1 HA基因的遗传变异情况及其蛋白结构,根据GenBank中登录的H5N1型禽流感HA基因的序列利用Primer 5.0设计引物扩增HA基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行鉴定,对鉴定正确的重组质粒pMD-H5N1-HA进行测序分析。应用生物信息学软件对禽流感病毒HA基因进行系统进化树分析、氨基酸序列同源性分析、保守区分析,磷酸化位点和序列重复区分析及HA蛋白二级、三级结构的预测。核苷酸序列测定结果表明：HA基因长1661 bp,共编码326个氨基酸;生物信息学分析结果表明：HA基因在种间具有较高保守性,HA基因的氨基酸序列与其他地方性禽流感H5N1病毒株HA基因的序列同源性最高可达99.7%,且为高致病性毒株;HA蛋白的二级、三级结构预测结果显示：HA蛋白多为α螺旋和β转角结构,无规则卷曲,是亲水性蛋白。该结果为禽流感病毒的分子病毒学研究奠定了基础。     

猪流感病毒M基因核酸探针的制备与应用

以地高辛(DIG)标记猪流感病毒(SIV)M基因的保守片段制成核酸探针,与H1及H3亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA、猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)的cDNA、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)的DNA、猪瘟病毒(CSFV)cDNA、猪伪狂犬病(PRV)的DNA进行斑点杂交,以检测探针的特异性,结果该探针仅与H1及H3亚型的猪流感病毒(SIV)的cDNA杂交呈阳性,与其余病毒杂交呈阴性;敏感性试验显示,探针最低能检出约5 pg的H3亚型的SIV RT-PCR产物.应用该探针对35份疑似SI临床病料进行检测,结果检出9份阳性,与RT-PCR检测结果一致.本研究结果表明,建立的DIG标记的核酸探针特异性强,敏感性高,适合于对SI的诊断和流行病学调查.     

H9N2亚型AIV HA基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

[研究目的]利用杆状病毒表达系统表达AIV H9N2亚型HA基因以获得可以利用的HA蛋白;[方法]应用DNAStar软件,参照Genbank中注册的AIV H9N2亚型HA基因序列,设计了一对引物,用RT-PCR方法成功地扩增出带双酶切位点的H9亚型AIV的HA基因,通过BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切位点将H9HA基因插入转移质粒载体pFastbacHTa中,获得重组转移载体pFastbacHTa-H9HA并将其转化DH10 Bac细胞,与Bacmid发生位点特异性转座作用,得到重组穿梭载体Bacmid-H9HA,再将其转染昆虫细胞High Five,进行PCR鉴定、SDS-PAGE和Westem Blot检测;[结果]HA基因正确地插入到病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下游,HA基因在High Five细胞中得到了表达,H9HA大小约为67 KD,而且表达的产物具有特异免疫学反应性;[结论]HA基因在昆虫细胞获得表达,为进一步生产检测H9N2亚型流感病毒的检测试剂或者构建亚单位疫苗奠定了基础.