巴西橡胶树HbUBC22基因克隆与表达分析

泛素蛋白酶体途径（ubiquitin proteasome pathway, UPP）是细胞内最重要的且具有高度选择性的蛋白质降解途径,而泛素结合酶E2/UBC是该途径的一个关键酶。本研究通过对巴西橡胶树同源EST序列拼接和RT-PCR扩增的方法,克隆了一个巴西橡胶树的泛素结合酶基因HbUBC22,该基因的开放阅读框（ORF）共807 bp,编码268个氨基酸,编码蛋白含有一个保守的UBC结构域和一个高度保守的半胱氨酸催化位点。系统进化关系分析发现,HbUBC22蛋白与蓖麻、杨树、油茶和葡萄的UBC蛋白的同源性最高,分别为89%、85%、85%和81%;在拟南芥基因组中,HbUBC22则与AtUBC22的同源性最高达到73%。表达谱分析结果显示,HbUBC22受乙烯利和茉莉酸甲酯诱导显著上调表达。原核表达分析结果表明,经IPTG诱导后,HbUBC22能够在大肠杆菌中表达出目标蛋白。本研究结果为进一步研究HbUBC22在橡胶树中的生物学功能奠定了良好基础。     

巴西橡胶树Profilin基因克隆及生物信息学分析

为了研究橡胶树中Profilin 蛋白的功能,利用橡胶树Profilin 基因部分已知序列设计引物,采用 3′-RACE技术获得Profilin 基因完整开放阅读框,该基因编码131 个氨基酸,含有一个保守的PROF结构域。在HbPro1 蛋白中没有预测到跨膜区和信号肽,二级结构分析表明HbPro1 属于混合型蛋白。对 25 个Profilin 蛋白系统进化分析表明,HbPro1 在进化上具有保守性,属植物类Profilin 蛋白家族。 HbPro1 基因的克隆和生物信息学分析为深入研究其功能奠定了基础。     

巴西橡胶树HbSIP1基因启动子的克隆和序列分析

为研究橡胶焦磷酸酶基因的表达特征及其在天然橡胶生物合成中调控机理,根据巴西橡胶树焦磷酸酶基因HbSIP1序列,利用GenomeWalker方法对HbSIP1基因启动子序列进行了分离,对其序列进行了生物信息学分析,并构建了含有该序列的植物表达载体pSIP1-1381Z。结果表明：分离获得了1198 bp的HbSIP1基因启动子序列,该序列具有真核生物典型启动子结构特征,并含有众多应答激素和胁迫信号的调控元件。对HbSIP1的启动子区的克隆和分析,为进一步研究HbSIP1的功能和表达调控机制奠定基础。     

橡胶树HbDHAR2基因克隆及表达分析

脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)通过调节抗坏血酸水平在植物生长发育和抗逆过程中发挥重要作用.为明确橡胶树DHAR基因的序列特征、表达特性以及潜在的生物学功能,采用RT-PCR技术,从橡胶树中克隆了DHAR基因HbDHAR2.该基因开放阅读框为639 bp,编码212个氨基酸.预测HbDHAR2蛋白等电点为5.69,分子量...     

巴西橡胶树一个Mlo基因克隆及其序列特征分析

Mlo基因是植物抗病基因中的重要成员。巴西橡胶树Mlo基因的克隆和序列分析,将为进一步通过转基因技术培育抗病橡胶树新品种奠定基础。本研究以大麦Mlo基因(GenBank登录号: Z83834)为探针对巴西橡胶树的EST和转录组数据库进行同源搜索,并将获得的同源EST序列进行拼接,最后得到巴西橡胶树Mlo基因的cDNA序列。采用RT-PCR方法成功克隆了与预期大小一致的Mlo基因CDS片段1668 bp,编码555个氨基酸,分子量为63.14 kDa,等电点是8.85。对巴西橡胶树Mlo的编码蛋白结构域进行分析发现,该蛋白具有Mlo保守结构域,包含8次跨膜结构。通过对不同物种的Mlo同源蛋白进行聚类分析发现,巴西橡胶树Mlo蛋白与木薯Mlo蛋白同源性最高,达到92.1%,其次是蓖麻(87.6%);在拟南芥基因组中,与AtMlo8的相似性最高,达到67%,而且AtMlo8也包含有8次跨膜结构,因此,将巴西橡胶树中克隆的Mlo基因命名为HbMlo8。通过对所克隆的HbMlo8基因分析可知,该基因属于Mlo基因家族成员,基因的克隆及序列分析为进一步验证巴西橡胶树HbMlo8的功能奠定了基础。     

巴西橡胶树HbDBB家族基因的鉴定与表达分析

本研究从橡胶树基因组中鉴定到9个HbDBB家族基因,并对这些基因的基因结构、启动子调控元件、染色体定位、进化和表达进行分析。结果显示,HbDBB家族成员分布在七条染色体和一个Contig上,编码蛋白的氨基酸数目为171～453个,分子量在18.20～50.13 kD,启动子区域含有多种植物激素和环境胁迫应答相关作用元件。系统进化分析表明DBB可以分成4个亚组,亚组成员在基因结构、保守基序数目和相对位置等方面具有较高相似性。表达分析显示HbDBB具有组织表达特异性,胶乳中HbDBB4和HbDBB6表达水平最高,叶片中HbDBB3和HbDBB4的表达水平最高。增产处理实验表明,HbDBB2、HbDBB4和HbDBB6受乙烯诱导,Hb DBB6受割胶诱导但不明显。叶片发育过程中,HbDBB3、HbDBB4和HbDBB9随着发育进程表达上调。本研究初步揭示了橡胶树DBB家族成员的理化特征和表达特性,为进一步研究该基因在橡胶树中的功能奠定了基础。     

巴西橡胶树HbRPB11基因的克隆与表达分析

橡胶树树皮中的次生乳管是天然橡胶合成和贮存的主要场所。生产上施用乙烯利通过延长橡胶树割胶后的排胶持续时间,调节胶乳代谢,从而达到增产的目的。但目前对于转录复合体关键成员RNA聚合酶Ⅱ在胶乳代谢过程中的动态变化尚不清楚。本研究采用RACE和RT-PCR方法,从橡胶树无性系CATAS7-33-97的胶乳中克隆到编码RNA聚合酶Ⅱ关键亚基RPB11的同源基因,命名为HbRPB11。该基因全长659 bp,包含351 bp的开放阅读框,编码一个由116个氨基酸残基组成的蛋白质。该蛋白质分子量为13.53 k D,理论等电点为5.934。实时荧光定量PCR结果表明,HbRPB11在橡胶树的多个组织中均有表达,其中在成熟叶片和胶乳中的表达量最高,并且受割胶和乙烯利处理显著上调。橡胶树不同种质间的表达模式分析显示HbRPB11基因在橡胶合成效率高的种质中的表达量要显著高于橡胶合成效率低的种质,表明该基因的表达量与橡胶合成效率呈正相关性,有可能作为生产上筛选高效合成橡胶种质材料的分子标记。     

巴西橡胶树HbMago3的克隆和表达分析

为了在基因组水平鉴定和分析巴西橡胶树中Mago基因家族的数量、结构和功能,本研究对巴西橡胶树Mago基因家族的数量、基因结构、染色体分布和蛋白特性进行了系统鉴定和分析;进一步克隆鉴定新的Mago基因,分析其组织表达水平和对激素(茉莉酸和乙烯)的响应。本研究从reyan7-33-97中鉴定了4个Mago基因,分别命名为HbMago1、HbMago2、HbMago3和HbMago4。HbMago2和HbMago3的可变剪切事件发生在第二个外显子,CDS存在66个碱基的差异,导致蛋白短了22个氨基酸、等电点低0.35;HbMago4可变剪切事件发生在5端的非翻译区,CDS和蛋白序列无差异。4个基因序列均包含3个外显子,HbMago1、HbMago2和HbMago4含有2个内含子,HbMago3含有3个外显子。4个基因序列分布在两条scaffold(NW-018745965.1和NW-018746420.1)上的4个位点。进化分析结果表明4个基因聚类在同一个进化枝条上,为单进化起源;橡胶树在进化过程中获得3个Mago基因而丢失1个基因。克隆了HbMago3,半定量结果表明HbMago3在根、胚...     

巴西橡胶树钙调蛋白基因的克隆及表达分析

为了进一步研究橡胶生物合成的分子机制,根据巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）cDNA文库中的EST序列,利用cDNA末端快速扩增（RACE）技术分离了一个巴西橡胶树钙调蛋白基因,命名为HbCAM1。分析结果显示,该基因cDNA全长775 bp,含有完整的阅读框架,编码区为450 bp,编码149个氨基酸,5’非编码区26 bp,3’非编码区299 bp。通过序列比对以及结构预测分析,HbCAM1编码的氨基酸序列与蓖麻、毛葡萄、烟草、麻风树中相应基因氨基酸序列的一致性分别达到100%、100%、99%、99%。半定量RT-PCR分析显示,HbCAM1基因可能通过对相关代谢基因表达调节参与了乙烯利刺激橡胶树增产的分子调控。     

橡胶树皮乳管组织茉莉酸诱导相关因子AP2/EREBP基因的克隆与表达分析

摘要：茉莉酸（jasmonic acid,JA）可诱导橡胶树（Hevea brasiliensis Muell.Arg.）乳管分化,是乳管分化的关键信号分子。目前,对JA诱导橡胶树乳管分化的分子机理仍然不清楚。我们在前期研究中通过筛选JA刺激乳管分化时期的橡胶树树皮组织cDNA差减文库,获得了4条与茉莉酸诱导乳管分化相关的AP2/EREBP家族转录因子基因的EST。本研究在此基础上,采用RACE法完整地克隆了这4个AP2/EREBP转录因子基因的开放阅读框,蛋白氨基酸序列分析表明其中3个属于ERF亚类,1个属于RAV亚类;表达分析发现,这4个基因在乳管分化时期的橡胶树树皮组织的表达受JA诱导,随JA处理时间的延长,其表达量先增强后减弱,推测它们可能在JA诱导橡胶树乳管分化过程中起着重要的调控作用。     

橡胶树中碱性转化酶基因HbNIN7的克隆与表达分析

蔗糖主要由植物光合作用产生,其水解依赖于转化酶和蔗糖合成酶。其中,转化酶催化蔗糖不可逆分解为葡萄糖与果糖。本研究基于橡胶树的基因组和转录组数据库,采用RT-PCR技术克隆得到一个中碱性转化酶基因HbNIN7基因,预测编码683个氨基酸。同源与亚细胞定位分析表明HbNIN7属于α类中碱性转化酶,定位于线粒体。通过原核表达获得其重组蛋白,酶活性分析表明,HbNIN7重组蛋白最适酶活pH值7.2;最适酶活温度45℃;最大反应速率32.69 mmol hexose·mg^-1protein·h^-1;Km值25.04 mmol/L。利用荧光定量方法分析基因的表达特征,结果显示:HbNIN7基因在雄花中表达水平最高,且在雄花发育的不同阶段差异显著,说明Hb NIN7很可能参与橡胶树花组织中糖利用及糖信号调控。     

巴西橡胶树HbTCTP基因的克隆及表达

在先前的研究中通过抑制缩减杂交获得了一个在巴西橡胶幼态无性系与老态无性系胶乳中差异表达的片段(HbSSHl2),BlastX分析表明,由该片段编码的氨基酸与麻疯树(Jatropha curcas L.)翻译控制肿瘤蛋白(translationally controlled tumor protein,TCTP)的同源性达到92%.本研究根据HbSSHl2的序列信息设计引物,通过3L-RACE的方法获得了一个长832bp的cDNA(命名为HbTCVP),序列分析表明HbTCTP有507 bp的阅读框,68 bp的5'-UTR和255 bp的3'UTR,编码168个氨基酸,该氨基酸序列与麻疯树、油棕、花生、南瓜、番茄和拟南芥的TCTP同源性分别达到93.45%、90.48%、89.29%、85.12%、82.74%和79.76%.RT-PCR表明,HbTCTP在巴两橡胶叶片、胶乳及树皮中都有表达,乙烯利处理可诱导HbTCTP的表达,割胶抑制HbTCTP的表达,表明HbTCTP可能参与伤信号或乙烯信号传导.HbTCTP的表达分析有助于解析橡胶树幼态无性系高产的分子机制.     

巴西橡胶树膜结合NAC转录因子HbNTL1的克隆及生物信息学分析

本实验根据巴西橡胶树胶乳cDNA文库中筛选到的NAC EST序列,克隆了橡胶树膜结合NAC转录因子,HbNTL1的cDNA和基因组DNA序列。生物信息学分析显示HbNTL1基因包含6个外显子和5个内含子,开放阅读框(ORF)为1704bp,编码了567个氨基酸。HbNTL1编码蛋白的相对分子量为62.52 kDa,理论等电点PI为4.62,N-端具有保守的NAC结构域,高度变异的C-端有一个跨膜结构域(TM)。序列比对和系统进化分析表明HbNTL1蛋白属于NAC转录因子家族中的NAC2亚族,推测其可能与橡胶树生长发育和胁迫应答有关。     

巴西橡胶树排胶机制研究进展

橡胶树是世界上商业用天然橡胶最主要的来源,排胶是天然橡胶生产的最后关键环节,为了安全高效的获取胶乳产量,橡胶树排胶机制的研究一直受到人们的重视。橡胶树中的乳管是天然橡胶合成和储存的组织,人们通过割胶收集从乳管中流出的胶乳用作提炼天然橡胶。胶乳的排出速度及排胶持续时间是决定天然橡胶产量的重要因素,是排胶动力和排胶阻力共同作用的结果。笔者对与排胶相关的乳管细胞学基础、排胶主要初动力的乳管膨压、排胶继动力的乳管胶乳水分稀释效应以及乳管排胶阻力的形成及其调控机制等研究进行了归纳,主要分析了乳管伤口堵塞物的形成和影响排胶阻力的多种因素,指出乳管堵塞在胶乳的停排中起重要作用。针对目前排胶机制的研究进展缓慢这一现状,我们提出有必要从以下几点展开深入研究：（1）乳管膨压形成相关的树皮木质素合成和调控;（2）水分运输相关的水通道蛋白基因表达和活性分析;（3）停排相关的乳管伤口末端堵塞物的形成和调节。这些研究将为全面解析橡胶树排胶机制奠定基础,也可为分子辅助育种-选育排胶通畅的种质提供依据。     

巴西橡胶GT1种子脱水处理与种子活力

以西双版纳地区产的GT 1橡胶种子为材料,通过快速脱水和慢速脱水处理,探讨GT 1种子脱水的敏感性与种子活力.结果表明:新鲜GT 1种子的萌发率并不是最高(72.22%),种子在经过短时脱水(24 h)后,种子的含水量下降一定范围,种子的萌发率明显提高,达到84.0%和86.66%.实验结果进一步表明:种子活力与种子的含水量关系非常明显,即快速脱水48 h、含水量在16.64%和慢速脱水72 h、含水量在14.3%的范围,超过这个范围,种子的萌发率和活力明显下降.     

不同品系橡胶树花药愈伤诱导和体胚发生研究

为建立橡胶树不同品系的体胚发生和植株再生体系,为不同品系橡胶树良种生产奠定基础。以橡胶树优良品系‘热研106’、‘热试59’、‘热试62’的花药为材料,采用正交设计,对不同品系、不同植物生长调节剂配比培养基的花药愈伤和体胚诱导效果进行了研究。[结果]结果表明：3个品系的愈伤诱导率和体胚诱导效率差异明显,同一品系不同培养基的愈伤诱导率和体胚诱导效率差异明显;愈伤诱导培养基中的植物生长调节剂对下一阶段的体胚诱导有明显影响。根据本研究,‘热研106’的花药愈伤诱导最佳浓度组合为2,4-D 1 mg/L+NAA 2 mg/L+KT 1 mg/L,‘热试59’的花药愈伤组织诱导最佳浓度组合为2,4-D 0.5mg/L+NAA 1 mg/L+KT 1 mg/L,‘热试62’的花药愈伤组织诱导最佳浓度组合为2,4-D 1 mg/L+NAA 1 mg/L+KT 1 mg/L。‘热试62’的体胚发生最佳浓度组合为KT 3 mg/L+NAA 0.05 mg/L+GA3 0.05 mg/L+6-BA 0.5 mg/L。[结论]本研究获得了不同品系的愈伤诱导和体胚发生最佳培养基组合,为多品系橡胶树花药植株再生体系的建立奠定了基础。